一种利用胶红酵母固态发酵烟梗梗丝的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用胶红酵母固态发酵烟梗梗丝的方法。
背景技术
我国作为烟草大国，烟草的种植面积和产量均居世界首位，大量的烟梗也由此产生。目前处理烟梗的方法主要包括物理爆破法、化学处理法、生物酶法，存在降解效果差、化学试剂污染、费用昂贵等缺点。目前有报道用短小芽孢杆菌V35制成菌剂用于梗丝处理，只是针对纤维素和果胶进行降解，其细胞壁成分木质素没有被降解，因此其细胞壁物质降解效果不明显。目前烟梗利用率较低，而其大量积压既会造成环境污染，也会造成可利用资源的浪费。
烟梗的主要成分是细胞壁物质(果胶、纤维素、木质素和半纤维素)，约占烟梗的43％左右，此外还有水溶性糖类、淀粉、蛋白质、烟碱和茄尼醇等。与烟叶相比，烟梗中化学成分的组成特征是总糖(即水溶性糖)、总氮和烟碱含量一般较低，细胞壁物质含量较高。目前认为细胞壁物质是影响烟草内在品质和风味的不利因素，该类物质在热解作用下会产生较多的低级醛类，在燃吸时会产生刺激性的呛咳等。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种利用胶红酵母固态发酵烟梗梗丝的方法，采用本发明方法能实现降解烟梗的不利物质，增加其香气成分，提高烟梗在卷烟中的利用率。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种利用胶红酵母固态发酵烟梗梗丝的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将胶红酵母菌种接种到斜面培养基上培养；
(2)种子培养：将步骤(1)获得的斜面菌种接种到种子培养基中培养；
(3)固态发酵培养：将培养好的种子液以10％-40％V/m的接种量接种到含烟梗梗丝的固态发酵培养基中，在22-32℃条件下培养2-6天。
进一步方案为，所述的斜面培养基为YEPD培养基含有：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L酵母粉10g/L，琼脂20g/L。
进一步方案为，所述斜面培养的条件为在28-32℃条件下培养2-3天。
进一步方案为，所述的种子培养基含有：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
进一步方案为，所述种子培养的条件为在28-32℃，120-180rpm条件下培养2-3天。
进一步方案为，所述的固态发酵培养基含有：烟梗梗丝100％。
进一步方案为，胶红酵母种子液以10％-40％V/m的接种量接种到含烟梗梗丝的固态发酵培养基中，在28-32℃条件下培养5-7天。
进一步方案为，所述胶红酵母种子液的接种量为10-20％V/m。
进一步方案为，上述的方法，其所述胶红酵母菌包括胶红酵母JM401。所述胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JM401，保藏编号为CCTCCNO：M2013088，已于2013年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明另一方面还提供了上述的方法在烟梗处理中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明的原料烟梗经过胶红酵母的固态发酵和微生物转化，其中细胞壁物质纤维素、半纤维素、木质素和果胶被胶红酵母分解利用，还原糖增加32.81％，总糖含量增加25.65％。有效实现了卷烟中烟梗的利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：不同接种量条件下，纤维素、半纤维素、木质素、果胶含量变化。
图2：不同接种量条件下，还原糖、总糖含量变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
胶红酵母JM401(CCTCC M2013088)是于2011年10月份分离自四川泸州产烟梗，可以高效降解烟梗细胞壁物质纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，同时合成多糖等活性物质，并且胶红酵母能够产生类胡萝卜素，能够使烟梗梗丝的香气成分增加。
(一)培养基
斜面培养基(YEPD培养基)：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟。
种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，pH自然，121℃灭菌20分钟。
发酵培养基：烟梗梗丝，121℃灭菌20分钟。
(二)纤维素测定方法
标准曲线绘制：取10mL比色管6支，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00mL纤维素标准液，再分别加入蒸馏水2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0mL，摇匀，则每管纤维素含量依次为0、40、80、120、160、200μg。向每管加2％蒽酮0.5mL，再沿管壁加浓H2SO45mL，上塞，摇匀，沸水浴中加热5min，静置冷却，然后在620nm波长下，求测不同含量纤维素溶液的吸光度。
发酵结束后固体培养物自然风干，粉碎，过60目筛。称取约0.3g样品，加入1mL80％乙醇，室温快速匀浆，90℃水浴20min，冷却至室温，6000g 25℃离心10min，弃上清。沉淀加入1.5mL 80％乙醇和丙酮各洗一遍(漩涡振荡2min左右，6000g 25℃离心10min，弃上清即可)，沉淀即为粗细胞壁，将沉淀干燥，称取0.2g样品于烧杯中，置于冷水浴，加入50％H2SO4 60mL，40min后转入100mL容量瓶中，并用50％H2SO4定容至刻度，摇匀后静置。取上清液10mL，放入100mL容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后取2mL溶液于比色管中，加入2％蒽酮0.5mL，并沿管壁加浓H2SO4 5mL，上塞，摇匀，沸水浴中加热5min，静置冷却，然后在620nm波长下，求测吸光度，并根据回归方程计算出烟梗样品中纤维素的含量。
(三)半纤维素的测定方法
制作标准曲线：取25mL比色管8支，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL葡萄糖标准溶液(1.0mg/mL)，加蒸馏水2mL，再各加1.5mL DNS，摇匀，沸水浴10min，冷却后定容至25mL，在540nm波长下，用分光光计测定吸光度。
称取0.20g样品于100mL烧杯中，加10mL 60％Ca(NO3)2，加热10min，稀释过滤，用蒸馏水洗滤渣3次后置于烘箱，70℃烘干，再转入250mL三角烧瓶中，加入10mL 2mol/L的HCl后沸水浴50min，冷却后过滤，用蒸馏水洗滤渣3次，留取滤液和洗涤液混匀，取0.5mL滤液加DNS溶液1.5mL，沸水浴10min，冷却后定容至25mL，于540nm波长下测定吸光度，再根据回归方程计算出烟梗样品中的半纤维素含量。
(四)木质素的测定方法
准确称取经粉碎后过样品粉末6.0mg，置于25mL试管中，加入25％乙酰溴一乙酸溶液(V/V)5mL和高氯酸0.2mL，将试管管口用封口膜封住，于80℃恒温水浴40min，将样液全部转移到装有10mL 2mol/L NaOH和25mL冰乙酸混合液的容量瓶内，充分振荡混匀后用冰乙酸定容至100mL。以冰乙酸为空白溶液，用紫外分光光度计在280nm处，测定吸光值。
(五)果胶的测定方法
标准曲线的制作：准确称取半乳糖醛酸0.0991g，用蒸馏水溶解后定容于100mL容量瓶中，分别移取此液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于6个100mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得标准稀释液。分别移取标准稀释液1.0mL于6支试管中，加6mL浓H2SO4，摇匀，在85℃水浴中加热15min，取出冷却，加入0.15％咔唑无水乙醇溶液0.2mL，摇匀，在室温下暗处放置，在530nm波长下显色2h，用1cm比色皿，以空白试剂做参比，测定吸光度(A)，绘制吸光度-浓度标准曲线。
称取5g(精确到0.001g)样品于烧杯中，加入热的70％乙醇，充分搅拌以提取糖类，过滤，反复操作至滤液不呈现糖类的反应。残渣用99％乙醇洗涤，再用乙醚洗涤，风干乙醚。用150mL加热至沸的0.05mol/L HCl溶液把漏斗中残渣移入250mL锥形瓶中，装上冷凝器，于沸水浴中加热回流1h，冷却后移入250mL容量瓶中，加甲基红指示剂2滴，加0.5mol/LNaOH中和后，定容，摇匀，过滤，收集滤液即得总果胶提取液。取果胶提取液，用水稀释到适当浓度(含半乳糖醛酸10-70μg/L)。取1mL稀释液于试管中，按制作标准曲线的方法操作，测定吸光度并从标准曲线上查出半乳糖醛酸浓度。
(六)还原糖、总糖测定方法
标准曲线的制作：将分析纯葡萄糖在80℃下烘干至恒重，精确称取500mg，加少量蒸馏水溶解，移入100mL容量瓶中并定容、摇匀，即为5mg/mL葡萄糖标准液。分别量取5mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，置于具塞25mL试管中，吸取蒸馏水分别补充至2.0mL，再各加2.0mL DNS试剂。盖上塞子，置于沸水浴中加热6min，取出，用流动冷水冷却后用蒸馏水定容到刻度25mL，充分摇匀，静置10min后，在紫外可见分光光度计上于540nm波长下，以空白(即量取标准溶液0mL)为参比液，测其吸光度。经回归统计求出其回归方程。
称取磨碎后的样品(过80目筛)100mg于100mL大试管中，加入10mL80％乙醇，浸泡过夜，次日加入热蒸馏水10mL，并在80℃水浴中加热0.5h，过滤于100mL容量瓶中，并用热蒸馏水反复冲洗滤渣，定容，即为还原糖待测液。吸取上述还原糖待测液25mL于250mL三角瓶中，并加入1∶3(浓盐酸与蒸馏水体积比)的盐酸溶液7mL，置于沸水浴中酸化0.5h，加1-2滴甲基红指示剂，用10％NaOH调至中性或偏碱性(pH＝7.0-7.5)，转移到100mL容量瓶并定容，即为水溶性总糖待测液。取还原糖待测液2.00mL，水溶性总糖待测液2.00mL，加入3，5-二硝基水杨酸显色剂2.00mL，按标准液的处理方法测定吸光度，然后从标准曲线上查出对应的浓度并计算还原糖、总糖含量。
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
在下面所述的所有具体实施例中，纤维素、半纤维素、木质素的含量均按样本质量计算，单位mg/g干重。还原糖和总糖的含量均为每克干物质所含还原糖和总糖的量，即质量百分比，其他如无特殊说明，均为本领域常用方法。
实施例1
(1)斜面培养：将胶红酵母菌种接种到斜面培养基(即YEPD培养基)上，在30℃条件下培养2天；
(2)液体种子培养：将斜面菌种接种到装有80mL种子培养基的250mL的三角瓶中，在30℃条件下培养3天；
(3)固态发酵培养：将培养好的胶红酵母种子液，按10％的接种量接种至装有烟梗梗丝的发酵培养基的500mL的三角瓶中，30℃条件下培养6天，发酵前，纤维素、半纤维素、木质素、果胶、含量分别为585.4mg/g、167.18mg/g、96mg/g、66.40mg/g，还原糖、总糖的含量为17.25％、18.36％。发酵6d后，测得纤维素降解率为20.69％，半纤维降解率为40.15％，木质素降解率为14.46％，果胶降解率为13.20％，还原糖增加32.81％，总糖含量增加25.65％(见表1、图1及图2)。
表1接种量为10％时，不同培养时间检测的物质含量变化
实施例2
将培养好的胶红酵母种子液，按20％的接种量接种至装有烟梗梗丝的发酵培养基的500mL的三角瓶中，其他条件同实施例1，发酵结束后测得纤维素降解率32.81％，半纤维素降解率33.53％，木质素降解率14.07％，果胶降解率11.78％，还原糖含量增加30.55％，总糖增加24.51％(见表2、图1及图2)。
表2接种量为20％时，不同培养时间检测的物质含量变化
实施例3
将培养好的胶红酵母种子液，按30％的接种量接种至装有烟梗梗丝的发酵培养基的500mL的三角瓶中，其他条件同实施例1，发酵结束后测得纤维素降解率25.68％，半纤维素降解率28.32％，木质素降解率17.50％，果胶降解率8.91％，还原糖含量增加27.13％，总糖含量增加27.34％(见表3、图1及图2)。
表3接种量为30％时，不同培养时间检测的物质含量变化
实施例4
将培养好的胶红酵母种子液，按40％的接种量接种至装有烟梗梗丝的发酵培养基的500mL的三角瓶中，其他条件同实施例1，发酵结束后测得纤维素降解率15.18％，半纤维素降解率21.20％，木质素降解率24.57％，果胶降解率9.50％，还原糖含量增加26.20％，总糖含量增加28.16％(见表4、图1及图2)。
表4接种量为40％时，不同培养时间检测的物质含量变化
相比于液态发酵，液态发酵水分含量太多，其糖分含量还有香味物质成分会部分溶于液体中，造成一定量的损失。固态发酵不仅可以降解梗丝细胞壁成分，而且其还原糖和总糖以及香味成分都有所增加，总体效果要优于液态发酵。
本发明的原料烟梗经过胶红酵母的固态发酵和微生物转化，其中细胞壁物质纤维素、半纤维素、木质素和果胶被胶红酵母分解利用，还原糖增加32.81％，总糖含量增加25.65％。有效实现了卷烟中烟梗的利用率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
