与烟草中提高的氮利用效率有关的方法和组合物
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技术领域
本公开提供了用于制备和鉴定烟草植物的组合物和方法，该烟草植物包含通过育种、转基因途径和顺化基因方法提高的氮利用效率。
背景技术
肥料是烟草种植者的主要成本，并且增加的肥料与植物组织中较高水平的生物碱和烟草特异性亚硝胺(TSNA)相关。不同的烟草品种需要不同水平的氮肥输入，以使每个品种实现最大产量。例如，与白肋烟烟草品种相比，马里兰烟草品种典型地需要少输入约25％的氮以实现最大产量。
提高烟草中的氮利用效率(NUE)将增加每单位输入氮肥的烟草可收获产量。氮利用效率的提高还允许降低农场投入成本，减少对氮肥生产所需的不可再生能源的使用和依赖，并减少氮肥生产和农业使用对环境的影响。
本文提供了用于提高烟草的氮利用效率的方法和组合物。
发明概述
一方面，本公开提供并且包括一种测定烟草品系的NUE的方法，包括从烟草品系的烟草植物获得至少一种代谢物，测定所获得的代谢物的量，并基于所鉴定的代谢物的量测定烟草品系的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种使用代谢物特征测定烟草品系的NUE的方法，包括从烟草品系的烟草植物分离代谢物特征，测定包含代谢物特征的每种代谢物的量，并且通过将所述代谢物特征与来自包含已知NUE的对照烟草品系的对照代谢物特征比较来测定烟草品系的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种育种包含与增强的NUE相关的代谢物特征的烟草品系的方法，包括测定来自第一烟草品系的第一烟草植物的代谢物特征，其中与缺乏所述代谢物特征的对照烟草植物相比，第一烟草植物包含增强的NUE，将所述第一烟草植物与第二烟草品系的第二植物杂交，并从所述杂交获得至少一个后代种子，其中从至少一个后代种子生长的后代植物包含代谢物特征，并且其中与缺乏所述代谢物特征的对照植物相比，所述后代植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，包括获得烟草植物群体，从来自所述烟草植物群体的至少一种烟草植物分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，并选择与对照烟草植物相比包含较高量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。在该方法的进一步的方面，与对照烟草植物相比，选择的烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，包括获得烟草植物群体，从来自所述烟草植物群体的至少一种烟草植物分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，并选择与对照烟草植物相比包含较低量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。
一方面，本说明书提供并且包括一种筛选烟草植物中与增强的NUE相关的第一代谢物特征的方法，包括从烟草植物分离与增强的NUE相关的第一代谢物特征，测定包含所述第一代谢物特征的至少一种代谢物的量，将所述第一代谢物特征与包含已知NUE的对照烟草植物的第二代谢物特征比较，并确定所述第一代谢物特征是否与增强的NUE相关。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
一方面，本说明书提供并且包括重组DNA构建体，其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽与选自下组的多肽至少70％一致或相似：SEQ ID NOs:1-8。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
一方面，本说明书提供并且包括包含本文公开的改性烟草种子或植物的温室、生长室或田间。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一个突变：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时至少缺乏一个突变的未改性对照烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物具有增强的氮利用效率。
一方面，本说明书提供并且包括重组DNA构建体，其包含与向导RNA可操作地连接的异源启动子，该向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一个突变的烟草植物制成：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一个突变的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种重组DNA构建体，其包含与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，所述顺化基因多核苷酸包含与编码sRNA的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述sRNA与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，并且其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将顺化基因核酸分子引入烟草细胞中，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏顺化基因核酸分子的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将引入改性的编码具有选自下组的序列的基因的核酸分子引入烟草细胞中：SEQ ID NOs:41-56，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏改性的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将编码小RNA(sRNA)的核酸引入烟草细胞中，所述核酸与编码具有选自下组的序列的基因的核酸分子的至少18个连续核酸同源：SEQ ID NOs:41-56，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏sRNA的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，包括提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体，针对增强的NUE基因座的20cM内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型；和选择一种或多种经基因分型并被发现包含所述分子标志物的烟草植物。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，该方法包括提供第一烟草植物群体，针对由选自下组的序列编码的基因座的增强的NUE等位基因的存在对第一烟草植物群体进行基因分型：SEQ ID NOs:9-16；和选择一种或多种经基因分型的包含增强的NUE等位基因的烟草植物。
一方面，本说明书提供并且包括一种将增强的NUE性状基因渗入烟草品种的方法，包括将包含增强的氮利用效率性状的第一烟草品种与缺乏增强的氮利用效率性状的第二烟草品种杂交，从杂交获得后代种子，针对与增强的氮利用效率性状相关的分子标志物对至少一个后代种子进行基因分型，其中所述分子标志物位于具有选自下组的序列的基因座的20cM内：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的氮利用效率性状的后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于选自下组的基因座的20cM内的一种或多种标志物：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的20cM内的一种或多种标志物：SEQ ID NOs:57-64，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。
序列简要说明
SEQ ID NOs:1-8是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE正相关的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:9-16是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE正相关的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:17-19是具有叶优选表达的基因的启动子区域的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:20-24是具有根优选表达的基因的启动子区域的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:25-40是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE负相关的基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:41-56是与根组织、叶组织或两者中的增强的NUE负相关的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NOs:57-64是包含与增强的NUE相关的多态性的SNP标志物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:65是表达载体p45-2-7的骨架序列。
附图简要说明
图1描绘了与烟草基因组中的NUE相关的四个基因簇。表明了具有NUE代谢物指纹图谱的在植物的低氮和正常氮之间的条件下差异表达的基因(相关基因)。还表明了差异表达基因(DEG)的总数，而与NUE代谢指纹图谱无关。
图2描绘了被超级支架1覆盖的烟草染色体11的2兆碱基区域。超级支架1是支架A和B的重叠群。位于该区域的79个表达基因中，有56个基因被差异表达。
图3描绘了与烟草染色体11上的NUE相关的23个白肋和6个马里兰品种的等位基因组成。品系1、2和3是在SEQ ID NO:58处包含有利的马里兰等位基因的白肋品系，且品系4是在SEQ ID NO:58处包含不利的白肋等位基因的标准白肋品系。
图4描绘了如图3所示的品系1-4和MD609对照(C)的叶绿素损失、生长和产量。品系1、2和3是在SEQ ID NO:58处包含有利的马里兰等位基因的白肋品系，且品系4是在SEQ IDNO:58处包含不利的白肋等位基因的标准白肋品系。
图5描绘了在氮胁迫下过表达与产量增加呈正相关的基因的温室生长的T1植物的产量(克鲜重/每株植物)。显示了基于每个样品9株植物的平均值和标准偏差。
图6描绘了收获后两个独立田间生长的F4品系(NUE-2和NUE-3)的产量(磅/英亩)。如所描述，从MD609到白肋TN90的杂交产生测试品系。提供了与对照TN90白肋烟相比的平均值和标准偏差。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本领域技术人员将认识到，可以在本公开的实践中使用许多方法。实际上，本公开绝不限于所描述的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
除非另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当术语以单数形式提供时，发明人还预期由该术语的复数描述的本公开的各方面。当通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异时，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其他技术术语在使用它们的领域中具有其普通含义，如各种特定领域的词典中所例证，例如“The American
除非另有说明，否则本公开的实践包括生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学、生物技术、代谢组学、植物育种和遗传学的常规技术，其本领域技术范围内。例如，参见Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4thedition(2012)；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,(1987))；Plant Breeding Methodology(N.F.Jensen,Wiley-Interscience(1988))；theseries Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))；Harlow and Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Recombinant Protein Purification:Principles And Methods,18-1142-75,GEHealthcare Life Sciences；C.N.Stewart,A.Touraev,V.Citovsky,T.Tzfira eds.(2011)Plant Transformation Technologies(Wiley-Blackwell)；and R.H.Smith(2013)PlantTissue Culture:Techniques and Experiments(Academic Press,Inc.)。
本文引用的任何参考文献(例如，所有专利、公开的专利申请和非专利出版物)的全文通过引用并入本文。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
如本文所用，在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“序列一致性”或“一致性”指的是当在指定的比较窗口上比对最大对应性时两个序列中的残基相同。当对蛋白质使用序列一致性百分比时，认识到不相同的残基位置通常通过保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代上不同时，可以向上调整序列一致性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。可以使用任何合适的计算机程序进行两个或更多个序列的比对。例如，用于进行行序列比对的一种广泛使用并认可的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,et al.(1994)Nucl.Acids Res.,22:4673-4680)。
如本文所用，关于核酸分子的术语“互补”是指核苷酸碱基的配对，使得腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶互补，而鸟嘌呤与胞嘧啶互补。两个互补核酸分子能够彼此杂交。例如，双链DNA的两条链彼此互补。
长度至少为三个核苷酸的特定多核苷酸可以被称为“寡核苷酸”。本文提供的核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其功能类似物，例如互补DNA(cDNA)。本文提供的核酸分子可以是单链或双链的。核酸分子包含核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)。尿嘧啶(U)替代RNA分子中的胸腺嘧啶。符号“R”可用于代表嘌呤(例如，A或G)核苷酸碱基。符号“Y”可用于代表嘧啶(例如，C或T)核苷酸碱基。符号“W”可用于代表A或T核苷酸碱基。符号S可用于代表G或C核苷酸碱基。符号“M”可用于代表A或C核苷酸碱基。符号“K”可用于表示G或T核苷酸碱基。符号“B”可用于代表G、C或T核苷酸碱基。符号“H”可用于代表A、C或T核苷酸碱基。符号“D”可用于代表A、G或T核苷酸碱基。符号“V”可用于代表A、G或C核苷酸碱基。符号“N”可用于代表任何核苷酸碱基(例如，A、G、C、T或U)。
术语“多核苷酸”的使用不意欲将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸均包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以由本文提供的多核苷酸编码。
本文提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以是分离的或基本纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含通常与其天然存在的环境中发现的多核苷酸或蛋白质相伴或相互作用的组分。例如，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。一方面，本文提供的分离的多核苷酸可以包含少于10000个核苷酸、少于5000个核苷酸、少于4000个核苷酸、少于3000个核苷酸、少于2000个核苷酸、少于1000个核苷酸、少于500个核苷酸或少于100个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列天然地位于从其衍生多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸侧翼。一方面，本文提供的分离的多核苷酸可包含100-10000个核苷酸、500-10000个核苷酸、1000-10000个核苷酸、2000-10000个核苷酸、3000-10000个核苷酸、4000-10000个核苷酸、1-500个核苷酸、1-1000个核苷酸、1-2000个核苷酸、1-3000个核苷酸、1-4000个核苷酸、1-5000个核苷酸、1-10000个核苷酸、100-500个核苷酸、100-1000个核苷酸、100-2000个核苷酸、100-3000个核苷酸或100-4000个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列天然地位于从其衍生多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸侧翼。在另一方面，本文提供的分离的多肽在制剂中基本上不含细胞物质，所述制剂的化学前体或非目标蛋白化学品的含量小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、或小于1％(干重)。所公开的多核苷酸和由其编码的多肽的片段也涵盖在本发明中。多核苷酸片段可以编码保留天然多肽的生物活性的多肽片段。或者，使用本领域已知的方法用作杂交探针或PCR引物的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性的片段多肽。取决于所需的结果，本文提供的多核苷酸片段可以为至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少70个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸，并且直至编码本发明多肽的全长多核苷酸。
可以使用本领域的常规技术分离核酸。例如，可以使用任何方法分离核酸，包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)。例如，通常的PCR技术描述于PCRPrimer:Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995。例如，重组核酸技术包括限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸被化学合成。可以通过已知方法(例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析)从天然来源(例如生物样品)中纯化多肽。例如，也可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。可以使用任何合适的方法测量多肽的纯度，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
一方面，本公开提供了检测植物细胞中的重组核酸和多肽的方法。非限制性地，也可以使用杂交检测核酸。核酸之间的杂交详细讨论于Sambrook等(1989,MolecularCloning:Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法制备对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将本文提供的抗体附着于固体支持物，如微量滴定板。
可以使用可检测标签进行检测(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽)。术语“标签”旨在涵盖使用直接标签以及间接标签。可检测标签包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
如本文所用，短语“与……相关”或“与……关联”是指两个实体之间的可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与增强的NUE相关”是指性状、基因座、基因、等位基因、标志物、表型等，或其表达，其存在或不存在能够影响具有增强的NUE性状的植物或其感兴趣部分的范围、程度和/或速率。因此，当标志物与性状关联时，并且当标志物的存在是指示所需性状或性状形式是否和/或在何种程度上将在包含所述标志物的植物/种质中发生的指示剂时，该标志物与性状“相关”。类似地，当标志物与等位基因关联时，并且当标志物的存在是指示等位基因是否存在于包含该标志物的植物/种质中的指示剂时，该标志物与等位基因“相关”。例如，“与增强的NUE等位基因相关的标志物”是指其存在或不存在可用于预测植物是否以及在何种程度上显示增强的NUE表型的标志物。
如本文所用，“厘摩”(cM)是两个基因座之间的重组频率和遗传距离的度量单位。一个cM等于一个基因座中的标志物由于在一代中发生杂交而与第二个基因座的标志物分离的机会为1％。
如本文所用，“紧密连接”是指标志物或基因座在另一个标志物或基因座的约20cM、15cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。例如，20cM是指在标志物和基因座之间以等于或小于约20％的频率发生重组。
如本文所用，“植物”是指整株植物。衍生自植物的细胞或组织培养物可包含任何植物成分或植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或它们的后代。后代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。植物细胞是植物的生物细胞，取自植物或通过培养取自植物的细胞而衍生。
如本文所用，烟草植物可以来自红花烟草(Nicotiana tabacum)属的任何植物，包括但不限于红花烟草(Nicotiana tabacum tabacum)；抱茎烟草(Nicotiana tabacumamplexicaulis),PI 271989；本塞姆氏烟草(Nicotiana tabacum benthamiana)PI555478；毕基劳式烟草(Nicotiana tabacum bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana tabacum debneyi)；高烟草(Nicotiana tabacum excelsior)PI 224063；粘烟草(Nicotiana tabacum glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana tabacumgoodspeedii)PI 241012；哥西氏烟草(Nicotiana tabacum gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana tabacum hesperis)PI 271991；奈特氏烟草(Nicotiana tabacumknightiana)PI 555527；海滨烟草(Nicotiana tabacum maritima)PI 555535；特大管烟草(Nicotiana tabacum megalosiphon)PI 555536；裸茎烟草(Nicotiana tabacumnudicaulis)PI 555540；圆锥烟草(Nicotiana tabacum paniculata)PI555545；蓝茉莉叶烟草(Nicotiana tabacum plumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana tabacumrepanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana tabacum rustica)；香甜烟草(Nicotianatabacum suaveolens)PI 230960；林烟草(Nicotiana tabacum sylvestris)PI 555569；绒毛烟草(Nicotiana tabacum tomentosa)PI 266379；绒毛状烟草(Nicotiana tabacumtomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana tabacum trigonophylla)PI 555572。
一方面，本文提供的植物组分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、嫩芽、细胞和原生质体。在其他方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开还提供是繁殖材料并介导植物的天然繁殖的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供了体细胞烟草植物细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
所提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、嫩芽、茎、荚、花、花序、叶柄、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部和维管组织。另一方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在进一步的方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶毛(毛状体)、根毛或贮藏根。在另一方面，本公开提供烟草原生质体。
技术人员理解，烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。一方面，本公开提供烟草胚乳。另一方面，本公开提供烟草胚乳细胞。在进一步的方面，本公开提供雄性或雌性不育的烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。
一方面，本公开提供了与改性烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和由改性烟草植物、种子、植物部分和植物细胞制成的产品有关的方法和组合物。一方面，本文提供的改性种子产生本文提供的改性植物。一方面，本文提供的改性植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组包含本文提供的重组DNA构建体。另一方面，本文提供的熟化烟草材料或烟草制品包含本文提供的改性烟草植物、植物组分、植物细胞或植物基因组。
如本文所用，“改性”是指经历诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组。
如本文所用，“同源转基因”或“顺化基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组分)。一方面，本文提供的改性植物、植物细胞或植物基因组是顺化基因的。本文提供的顺化基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。另一方面，本文提供的改性烟草植物不包含非烟草的遗传物质或序列。
如本文所用，“功能性片段”或“其功能性片段”是指保留其所指的全长序列的功能的任何大小的核苷酸或氨基酸序列。一方面，功能性片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个、至少5000或大于5000个核苷酸。一方面，功能性片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000或大于2000个氨基酸。一方面，功能性片段的长度可以是5-5000个核苷酸、10-4000个核苷酸、25-3000个核苷酸、50-2000个核苷酸、75-1000个核苷酸、100-900个核苷酸、150-800个核苷酸、200-700个核苷酸、250-600个核苷酸或300-500个核苷酸。一方面，功能性片段的长度可以是5-2000个氨基酸、10-1000个氨基酸、25-900个氨基酸、50-800个氨基酸、50-800个氨基酸、75-700个氨基酸、100-600个氨基酸、150-500个氨基酸、200-400个氨基酸或250-300个氨基酸。在进一步的方面，将本文描述的多核苷酸以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将本文所述的多肽以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将具有SEQ ID NOs:9-24和41-56的序列的多核苷酸以其整体以及作为其任何功能性片段预期。在进一步的方面，将具有SEQ ID NOs:1-8和25-40的序列的多肽以其整体以及作为其任何功能性片段预期。
如本文所用，术语“氮利用效率”(NUE)是指植物吸收、同化和/或使用氮(例如来自土壤、水和/或氮肥)的能力。NUE基因影响产量，并具有改进作物植物中氮利用的功效。增强的氮利用效率可归因于氮肥的吸收和同化和/或随后对积累的氮储量的再流动和再利用的提高，以及植物对胁迫条件(例如低氮环境)的耐受性增加。NUE基因可用于改变植物的遗传组成，使其在当前的肥料施用标准下提高生产率，或在显著减少肥料或减少氮利用率下维持其生产率。
已经以各种方式定义了NUE，但是土壤中每单位可获得的氮的产量整合了用于评估作物栽培品种的适应性的所有关键参数，并且其是NUE的常用度量。例如，参见Ladha等，2005.Advances in Agronomy,87:85-156，其全部并入本文。该指标有时称为“农业NUE”。作为NUE的另一种度量，可以测定植物产品(例如烟叶组织)与植物中地上氮的比率(有时称为“生理NUE”)。增强的NUE与三个关键成分有关：1)与在100％正常氮含量下生长的植物相比，当在25％正常氮含量下生长时，产量没有明显差异；2)与不具有增强的NUE的植物相比，叶绿素损失率降低；3)与在100％正常氮含量下生长的植物相比，当在25％正常氮含量下生长时，熟化叶质量没有明显差异。在优选的方面，与在100％正常白肋施肥率下生长的白肋植物相比，当在25％白肋施肥率下生长时，具有增强的NUE的植物能够产生相似的产量和叶质量。
至少五种NUE的途径和指标用于本领域，并在下文讨论。
(1)来自所施用的氮(N)的偏要素生产率(PFP)是对所施用的每单位氮产生多少产量的度量：
PFPN＝产量(千克)/所施用的N(千克)
PFPN＝Y+N/FN
其中Y+N是是产量(千克/公顷；kg/ha)，FN是施肥量(kg/ha)。
(2)所施用的氮(N)的农学效率(AE)是对于所施用的每单位氮产生多少额外产量的度量：
AEN＝产量增加(千克)/所施用的N(千克)
AEN＝(Y+N-Y0N)/FN
其中Y+N是施N处理中的产量(kg/ha)；Y0N是不施N的对照处理的产量(kg/ha)；以及FN是施用的N肥量(kg/ha)。
(3)所施用的氮(N)的回收效率(RE)是对所施用的氮中的多少被作物回收并吸收的度量。
REN＝所吸收的N(千克)/所施用的N(千克)
REN＝(UN+N-UN0N)/FN
其中UN+N是接受以比例FN(kg/ha)施用的地块中处于生理成熟度的地上生物量中测得的植物总N吸收量(kg/ha)；并且UN0N是不添加N的对照地块的总N吸收量。
(4)所施加的氮(N)的生理效率(PE)是每增加一个氮吸收单位产生多少额外产量的度量。
PEN＝产量增加(千克)/所吸收的肥料N(千克)
PEN＝(Y+N-Y0N)/(UN+N-UN0N)
其中Y+N是施N处理中的产量(kg/ha)；Y0N是不施N的对照处理的产量(kg/ha)；UN+N是接受施用肥料N的处理中的总N吸收量(kg/ha)；以及UN0N是不施用肥料N的处理中的总N吸收量(kg/ha)。
(5)氮(N)的内部效率(IE)涉及从肥料和固有(例如土壤)营养来源吸收的每单位N产生多少产量：
IEN＝产量(千克)/所吸收的N(千克)
IEN＝Y/UN
其中Y是产量(kg/ha)；以及UN是总N吸收量(kg/ha)。
氮可以是任何形式，包括有机和/或无机形式。氮的形式包括但不限于硝酸盐(例如硝酸铵、硝酸钙、硝酸钾)、亚硝酸盐、氨、氨水、无水氨、硫酸铵、磷酸二铵、低压氮溶液、无压氮溶液、尿素和尿素-硝酸铵(UAN)。一方面，氮为植物可立即利用的形式(例如，氨和/或硝酸盐)和/或可容易地转化成植物可利用的形式(例如，尿素)。
一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的氮吸收。另一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的氮同化。在进一步的一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含增加的产量。在又另一方面，与对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物在低氮条件下包含增加的产量。在优选的方面，与本领域技术人员典型地使用的水平相比，在田间使用的低氮条件为约25％的氮。另一方面，与本领域技术人员典型地使用的水平相比，在田间使用的低氮条件为约5％-50％。在温室环境中，低氮条件为约百万分之25(ppm)，并且正常氮条件为约100ppm。另一方面，温室中使用的低氮条件可以为5ppm-50ppm。
一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％的产量增加。一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含5％-100％、10％-100％、20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％、10％-200％、10％-300％、10％-400％、10％-500％或5％-500％的产量增加。
一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物群体相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物群体包含至少0.25kg/ha、至少0.5kg/ha、至少0.75kg/ha、至少1kg/ha、至少2kg/ha、至少3kg/ha、至少4kg/ha、至少5kg/ha、至少6kg/ha、至少7kg/ha、至少8kg/ha、至少9kg/ha、至少10kg/ha、至少15kg/ha、至少20kg/ha、至少25kg/ha、至少30kg/ha、至少35kg/ha、至少40kg/ha、至少45kg/ha、至少50kg/ha、至少75kg/ha、至少100kg/ha、至少200kg/ha、至少300kg/ha、至少400kg/ha、或至少500kg/ha的产量增加。另一方面，与在类似生长条件下生长的对照烟草植物群体相比，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物群体包含0.25kg/ha-100kg/ha、0.5kg/ha-100kg/ha、0.75kg/ha-100kg/ha、1kg/ha-100kg/ha、2kg/ha-100kg/ha、3kg/ha-100kg/ha、4kg/ha-100kg/ha、5kg/ha-100kg/ha、6kg/ha-100kg/ha、7kg/ha-100kg/ha、8kg/ha-100kg/ha、9kg/ha-100kg/ha、10kg/ha-100kg/ha、15kg/ha-100kg/ha、20kg/ha-100kg/ha、30kg/ha-100kg/ha、40kg/ha-100kg/ha、50kg/ha-100kg/ha、75kg/ha-100kg/ha、100kg/ha-500kg/ha、100kg/ha-400kg/ha、100-300kg/ha或100kg/ha-200kg/ha的产量增加。如本文所用，烟草植物“群体”可以具有任何大小，例如5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、500、1000、5000、10000、25000、50000、100000、500000或更多。群体可以来自单一品种、栽培品种或品系。可以使用本领域已知的任何育种技术来产生群体。
一方面，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含的叶片比在类似生长条件下生长的对照烟草植物多至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20或至少25片。另一方面，本文提供的包含增强的NUE的改性烟草植物包含的叶片比在类似生长条件下生长的对照烟草植物多1-25、2-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25、9-25、10-25、11-25、12-25、13-25、14-25、15-25或20-25片。
如本文所用，“可比条件”、“类似条件”或“类似生长条件”是指用于生长或熟化烟草并在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较的类似环境条件、农学实践和/或熟化方法，使得环境条件和农学实践(包括熟化方法)均不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型之间观察到的任何差异。例如，环境条件包括光、温度、水、湿度和营养(例如氮和磷)。例如，农学实践包括播种、剪枝、底切、移栽、打顶、分杈和熟化。参见Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp.70-103的第4B章和第4C章。
一方面，本文提供的改性植物、种子、植物部分或植物细胞包含一种或多种非天然存在的突变。一方面，本文提供的突变改进氮利用效率。例如，本文提供的突变类型包括取代(点突变)、缺失、插入、重复和倒位。期望这种突变存在于基因的编码区中；然而，也期望启动子或其他调节区、内含子、内含子-外显子边界或基因的非翻译区中的突变。
一方面，本文提供的方法能够生产与对照烟草植物相比具有增强的氮利用效率的烟草植物。诱变方法包括但不限于化学诱变，例如用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering and Verkerk,In,The use of induced mutations in plantbreeding.Pergamon Press,pp.317-320,1965)；或UV辐射、X射线、电子束、离子束(例如碳离子束、氦离子束、氖离子束)和快中子辐照(例如，参见Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；Poehlman,Breeding Field Crops,VNostrand Reinhold,New York(3.sup.rd ed.),1987；和Tanaka,J.Radiat.Res.51:223-233,2010)；转座子标志物(Fedoroff等,1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)和T-DNA插入方法(Hoekema等,1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变包括在基因组长度上化学诱导随机点突变。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大的缺失。转座子标志物包括在内源基因中插入转座子以减少或消除基因的表达。
此外，用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法、TILLING(靶向诱导的基因组局部损伤)、使用变性高效液相色谱(HPLC)或选择的PCR产物的选择性核酸内切酶消化也适用于本公开。参见McCallum等(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。可以使用本领域熟知的方法确定本文提供的影响基因表达或干扰基因功能的突变。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基中的突变可以特别有效地抑制蛋白质的功能。
可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法筛选和选择诱变的烟草植物。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern印迹、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNase保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促分析，以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术(如原位杂交、酶染色和免疫染色)也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于进行所有所指技术的方法是本领域已知的。
一方面，本文提供的植物基因组通过选自下组的核酸酶被突变(被编辑)：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1或CRISPR/Cmx1核酸酶。在另一方面，本文提供的植物基因组通过CRISPR/CasX或CRISPR/CasY核酸酶被突变。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个核苷酸的定向诱变，或去除或替换内源植物基因组的核酸序列。
本文还提供了使用本领域已知的任何合适的转化方法用本文所述的重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指其中引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物细胞的基因组中并且能够被其后代继承的转化。“瞬时转化”旨在表示将序列引入植物或植物细胞中，并且仅在植物或植物细胞中瞬时表达或仅瞬时存在于植物或植物细胞中。
一方面，本文提供的方法和组合物包括将一种或多种多核苷酸引入一种或多种植物细胞中。一方面，改性本文提供的植物基因组以包括引入的多核苷酸或重组DNA构建体。如本文所用，“植物基因组”是指植物细胞的核基因组、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组。另一方面，将本文提供的多核苷酸整合到人工染色体中。一方面，将本文提供的包含多核苷酸的人工染色体整合到植物细胞中。
一方面，本文提供的改性植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组包含一个或多个转基因。一方面，本文提供的转基因改进烟草植物中的氮利用效率。如本文所用，“转基因”是指通过本领域已知的任何方法转移到基因组中的多核苷酸。一方面，转基因是外源多核苷酸。一方面，转基因是内源多核苷酸，其被整合到通常其不存在的新基因组位点中。因此，在适当情况下，转基因也可以是顺化基因。
一方面，本文提供的转基因包含重组DNA构建体。一方面，本文提供的重组DNA构建体或表达盒可包含用于选择转基因细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物，例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、磺酰脲类(例如氯磺隆和甲嘧磺隆)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)抗性的基因。其他选择性标志物包括表型标志物，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)。
一方面，本文提供的方法和组合物包含载体。如本文所用，术语“载体”或“质粒”可互换使用，是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。一方面，本文使用的质粒或载体能够在体内复制。如本文所用，“转化载体”是能够转化植物细胞的质粒。一方面，本文提供的质粒是细菌质粒。另一方面，本文提供的质粒是土壤杆菌Ti质粒或衍生自土壤杆菌Ti质粒。在又另一方面，本文提供的载体是病毒载体。
一方面，本文提供的质粒或载体是重组载体。如本文所用，术语“重组载体”是指通过基因重组的实验室方法(例如分子克隆)形成的载体。另一方面，本文提供的质粒是合成质粒。如本文所用，“合成质粒”是能够与天然质粒(例如Ti质粒)具有相同功能(例如复制)的人工产生的质粒。不受限制地，本领域技术人员可以通过通过单个核苷酸合成质粒，或通过将来自不同预先存在的质粒的核酸分子剪接在一起来从头产生合成质粒。
载体可商购获得或可通过本领域常规的重组DNA技术制备。一方面，本文提供的载体包含SEQ ID NO:65的全部或部分。含有核酸的载体可以具有与这种核酸可操作地连接的表达元件，并且还可以包括序列(诸如编码可选择标志物的那些(例如抗生素抗性基因))。含有核酸的载体可以编码嵌合或融合多肽(即与异源多肽可操作地连接的多肽，其可以位于多肽的N-末端或C-末端)。代表性的异源多肽是可用于纯化编码多肽的那些(例如，6xHis标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST))。
将多核苷酸(例如转基因、重组载体、重组DNA构建体、表达盒)引入本公开的植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Shillito等(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.US83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(例如，参见美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomes等(1995)in Plant Cell,Tissue,and OrgCultureFundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923-926)。还可以参见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-674(soybean)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6:923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)In Vitro CellDev.Biol.27P:175-182(soybean)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(soybean)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman等(Longman,N.Y.),pp.197-209(花药)；Kaeppler等(1990)Plant CellReports 9:415-418和Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)。一方面，本文提供的细菌细胞包含本文提供的重组DNA构建体或重组载体。应当理解，许多不同种类的细菌细胞可以包含重组DNA构建体或重组载体，包括但不限于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、大肠杆菌(Escherichia coli)。还提供了包含本文提供的重组DNA构建体或重组载体的酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
另一方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文提供的重组构建体或表达盒引入植物。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒整合入病毒DNA或RNA分子中。已经认识到，用于本文提供的表达盒的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶的转录的启动子。用于将多核苷酸(包括病毒DNA或RNA分子)引入植物并表达在其中编码的蛋白质的方法是本领域已知的。例如，参见美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。
可以用本文提供的重组构建体或表达盒转化可以使用克隆方法随后繁殖(无论是通过器官发生还是胚胎发生)的任何植物组织。“器官发生”是指从分生组织中心依次发育芽和根的过程。“胚胎发生”是指芽和根从体细胞或配子以协调方式(不是依次)一起发育的过程。适用于本文所述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、已有的分生组织(例如茎尖分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。
如本领域中通常理解的，术语“启动子”通常是指包含RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA框并且辅助或促进相关的可转录的多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可以合成产生、变化或衍生自已知或天然存在的启动子序列或其他启动子序列(例如，如本文所提供)。启动子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本发明的启动子可以包括组成相似但与本文已知或提供的其他启动子序列不相同或不互补的启动子序列的变体。如本文所用，在DNA构建体的上下文中，“异源启动子”是指：(i)衍生自不同于可操作连接的结构基因或编码区的来源的启动子，或(ii)衍生自与可操作连接的结构基因或编码区相同来源的启动子，其中启动子的序列从其原始形式被改性。如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与相关的可转录多核苷酸序列或基因(或转基因)的编码序列之间的功能性连接，从而使启动子等以至少在特定组织、发育阶段和/或在某些条件下，执行启动、协助、影响、引起和/或促进相关的编码或可转录的多核苷酸序列的转录和表达。“植物可表达的启动子”是指可用于在植物、植物细胞和/或植物组织中表达与该启动子可操作连接的相关的编码序列、转基因或可转录的多核苷酸序列的启动子。
启动子可以根据与编码可操作地连接至该启动子的序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的多种标准进行分类，例如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植物的所有或大多数组织中启动转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中表达增强的启动子称为“组织增强”或“组织优选”启动子。因此，“组织优选”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先的表达，但在植物的其他组织中引起较低的表达水平。在植物的特定组织中表达而在其他植物组织中很少表达或不表达的启动子称为“组织特异性”启动子。在植物的某种细胞类型中表达的启动子称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(例如冷、干旱或光照或其他刺激(例如伤口或化学施加))而启动转录的启动子。启动子也可以按照其来源分类，例如是异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因)具有不同来源的启动子序列和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列。当自然界中通常不存在这样的组合时，术语“异源的”可以更广泛地指两个或更多个DNA分子或序列的组合。例如，如果两个或更多个DNA分子或序列通常在不同基因组中或在同一基因组中的不同基因座处被发现，或者如果它们在性质上未相同地结合，则彼此之间将是异源的。
示例性的组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313：810-812)；泛素(Christensen等人1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J 3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。
示例性的化学诱导型启动子包括由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学诱导型启动子包括类固醇反应性启动子(例如，参见Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.US88:10421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动子(例如，参见Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)。可用于本文的其他示例性启动子是那些负责热调节的基因表达、光调节的基因表达(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；在豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或者阿拉伯苏启动子)、激素调节的基因表达(例如，来自小麦Em基因的脱落酸(ABA)反应序列；ABA诱导型HVA1和HVA22，以及大麦和拟南芥的rd29A启动子；和伤口诱导的基因表达(例如wunl)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性储存蛋白基因；描述的来自玉米的23kDa玉米醇溶蛋白基因；或法国豆(β-菜豆蛋白基因)或病原体-诱导型启动子(例如，分别是PR-1、prp-1或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子，以及线虫诱导型启动子，烟草和欧芹的TobRB7-5A和Hmg-1)。
如本文所用，“叶”启动子包括在衍生自植物的任何部分的叶组织中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达的任何启动子。该“叶”启动子可以进一步定义为在植物的一个或多个组织(例如一个或多个花组织)中启动、引起、驱动(等)其相关基因/转基因或可转录DNA序列的转录或表达。该“叶”启动子可以进一步定义为“叶优选”启动子，其至少优先地或大部分地(如果不是排他性的话)在衍生自植物任何部分的叶组织(与花组织相反)中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。然而，“叶”和“叶优选”启动子也可以在植物的一个或多个细胞或组织，例如一个或多个营养或生殖组织的生殖阶段或发育阶段期间各自许可、允许、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。实际上，“叶”启动子甚至可以在一个或多个生殖或营养组织中以大于在叶组织中的水平或程度启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。
如本文所用，“根”启动子包括在衍生自植物的任何部分的根组织中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达的任何启动子。该“根”启动子可以进一步定义为在植物的一个或多个组织(例如一个或多个花组织)中启动、引起、驱动(等)其相关基因/转基因或可转录DNA序列的转录或表达。该“根”启动子可以进一步定义为“根优选”启动子，其至少优先地或大部分地(如果不是排他性的话)在衍生自植物任何部分的根组织(与花组织相反)中启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。然而，“根”和“根优选”启动子也可以在植物的一个或多个细胞或组织，例如一个或多个营养或生殖组织的生殖阶段或发育阶段期间各自许可、允许、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。实际上，“根”启动子甚至可以在一个或多个生殖或营养组织中以大于在根组织中的水平或程度启动、引起、驱动(等)其相关基因、转基因或可转录DNA序列的转录或表达。
其他示例性组织优选的启动子包括在以下中公开的那些：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；VanCamp等(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.US90(20):9586-9590；和Guevara-Garci等(1993)Plant J.4(3):495-505。
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。
如本文所用，“异源”是指序列源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体旨在表示构建体源自外来物种，或者，如果源自相同物种，则通过有意的人为干预实质上改变它在组合物和/或基因组位点中的天然形式。例如，异源核酸构建体包括但不限于通过转化方法或随后用另一种目标植物育种转基因植物而已经被引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体。
一方面，可以通过表达本文提供的多核苷酸通过RNA干扰(RNAi)来获得抑制本文提供的一种或多种多肽的表达。一方面，RNAi包括表达非编码RNA。如本文所用，“非编码RNA”选自下组：microRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、内含子、发夹RNA(hpRNA)、包含内含子的发夹RNA(ihpRNA)和向导RNA。一方面，本文提供的单个非编码RNA抑制至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或多于10个多肽的表达。一方面，将本文提供的非编码RNA稳定地转化到植物基因组中。另一方面，将本文提供的非编码RNA瞬时转化到植物基因组中。
如本文所用，术语“下调”和“抑制”定义为本领域已知的或本文所述的降低目标基因产物(例如mRNA、蛋白质、非编码RNA)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物(例如改性植物VS对照植物)之间进行比较。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在相同植物内的或不同植物之间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物组分之间进行比较，并且包括在相同植物或植物组分内的或在植物或植物组分之间的发育阶段或时间阶段之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对减少，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”涵盖下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。
术语“抑制性序列”涵盖能够抑制植物中基因表达或功能的任何多核苷酸或多肽序列，例如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义方向的核苷酸序列、反义方向的核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的反向区域、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物、其组合等的序列。
当在多核苷酸抑制性序列的背景下使用短语“能够抑制”时，意指抑制性序列本身发挥抑制作用；或者，当抑制性序列编码抑制性核苷酸分子(例如发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)或编码抑制性多肽(例如抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录后(例如在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制性序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制性序列的情况下)后，转录或翻译产物分别对靶基因产物发挥抑制作用(例如抑制靶基因产物的表达或功能)。
本文提供的抑制性序列可以是通过本领域已知的任何沉默路径或机制触发基因沉默的序列，包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和包含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA、人工或合成的microRNA、以及人工反式作用siRNA。取决于所需的结果，抑制性序列可以为至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少70个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸，直至编码本公开蛋白质的全长多核苷酸。一方面，抑制性序列可以是长度为50-400个核苷酸、70-350个核苷酸、90-325个核苷酸、90-300个核苷酸、90-275个核苷酸、100-400个核苷酸、100-350个核苷酸、100-325个核苷酸、100-300个核苷酸、125-300个核苷酸或125-275个核苷酸的片段。
MicroRNA(miRNA)是非蛋白质编码RNA，通常在19-25个核苷酸之间(在植物中通常为20-24个核苷酸)，其引导靶标转录物的反式切割，负调节参与各种调控和发育路径的基因的表达(Bartel(2004)Cell,116:281-297)。在一些情况下，miRNA用于引导siRNA初级转录物的同步加工(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
已经鉴定了许多microRNA基因(MIR基因)并可在数据库中公开获得(“miRBase”，在microrna.sanger.ac.uk/sequences可在线获得；还参见Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)。据报道，MIR基因出现在基因间区域(在基因组中是分离的且成簇的)，但也可以完全或部分位于其他基因(蛋白质编码和非蛋白质编码)的内含子中。至少在某些情况下，MIR基因的转录可以在MIR基因自身启动子的促进控制下进行。初级转录物，称为“pri-miRNA”，可以是相当大的(几千碱基)并且可以是多顺反子的，包含一个或多个pre-miRNA(包含茎环排列的折叠结构，其被加工成成熟miRNA)以及mRNA常有的5'“帽”和多腺苷酸化尾。
来自其相应前体(pri-miRNA和pre-miRNA)的成熟miRNA的成熟度在动物和植物之间显著不同。例如，在植物细胞中，microRNA前体分子被认为主要在细胞核中完全加工成成熟miRNA，而在动物细胞中，pri-miRNA转录物在细胞核中由动物特异性酶Drosha加工，然后pre-miRNA被输出到细胞质中，进一步被加工成成熟的miRNA。植物中的成熟miRNA的长度典型地为21个核苷酸。
转基因表达miRNA(无论是天然存在的序列还是人工序列)可用于调节miRNA的一种或多种靶基因的表达。在转基因表达的转录物中包含miRNA识别位点也可用于调节转录物的表达；例如，参见Parizotto等(2004)Genes Dev.,18:2237-2242。已经在mRNA的所有区域中验证了miRNA的识别位点，包括5'非翻译区、编码区和3'非翻译区，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能不一定影响抑制。因为miRNA是真核生物中重要的调控元件，所以miRNA的转基因抑制可用于操纵生物路径和反应。最后，MIR基因的启动子可以具有非常特异的表达模式(例如细胞特异性、组织特异性、时间特异性或可诱导)，因此可用于重组构建体以诱导与它们可操作地连接的DNA序列的这种特异性转录。miRNA、它们的前体、它们的识别位点和它们的启动子的各种用途是已知的。这些用途的非限制性实例包括：(1)表达天然miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(2)表达人工miRNA或miRNA前体序列以抑制靶基因；(3)表达具有miRNA识别位点的转基因，其中当表达成熟miRNA时，转基因被抑制；(4)表达由miRNA启动子驱动的转基因。
对于miRNA前体的miRNA茎区中的核苷酸，设计人工miRNA序列可以像替换与预期靶标互补的序列一样简单。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以制备工程化miRNA前体的一般方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择靶基因特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如通过使用序列比对工具(例如烟草cDNA和基因组DNA数据库的BLAST(参见例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等(1997)NucleicAcids Res.,25:3389-3402))，以鉴定靶转录物直系同源物和与无关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶标序列的无意沉默；(b)分析不需要的序列的靶基因(例如与来自非靶标物种的序列匹配)，并对每个潜在的19-聚体片段的以下进行评分：GC含量、Reynolds得分(参见Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)和由自由能的负差异表征的功能不对称性(“.DELTA..DELTA.G”或“ΔΔG”)。优选选择具有所有或大多数以下特征的19-聚体：(1)Reynolds得分>4，(2)GC含量为40％-60％，(3)负的ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏连续4个或更多个相同的核苷酸；(6)位于靶基因3'末端附近；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。据报道，siRNA中每个第三个核苷酸的位置对影响RNAi效力特别重要，可在rna.chem.tu-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm公开获得算法“siExplorer”；(c)确定所选19聚体的反向互补序列以用于制备修饰的成熟miRNA。第20位的其他核苷酸优选与选择的靶序列匹配，并且优选选择第21位的核苷酸不配对以防止沉默在靶转录物上扩散，或选择与靶序列配对以促进沉默在靶序列上扩散；和(d)将人工miRNA转入植物。
一方面，本文提供的人工miRNA降低或消除靶基因的RNA转录或蛋白质翻译。
一方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组织特异性启动子的控制下。在进一步的方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组织优选启动子的控制下。在进一步的方面，本文提供的miRNA或人工miRNA处于组成型启动子的控制下。
从本公开的改性烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制备烟草制品。如本文所用，“烟草制品”定义为意欲用于人类使用或消费的由烟草制备或衍生的任何产品。一方面，本文提供的烟草制品包含来自本文提供的改性烟草植物的熟化组分。另一方面，本文提供的烟草制品包含来自本文提供的改性烟草植物的熟化烟叶。
本文提供的烟草制品包括但不限于卷烟制品(例如卷烟、比迪烟、丁香烟)、雪茄制品(例如雪茄、雪茄包皮烟、小雪茄)、烟斗烟制品、衍生自烟草的制品、从烟草衍生的烟碱制品、无烟烟草制品(例如湿鼻烟、干鼻烟、嚼烟、潮湿无烟烟草、细切嚼烟、长切嚼烟、袋装嚼烟)、膜、可嚼物(例如口香糖)、含片、溶解条、标签、片剂、成形部分、凝胶、消费品单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。例如，参见美国专利公开号US 2006/0191548。
如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草制品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒成型纸(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。
一方面，本公开提供了衍生的烟碱和从本文提供的改性烟草植物生产用于制品的烟碱的方法。
本公开的衍生自植物的烟草制品还包括卷烟和其他吸烟制品，特别是那些包括过滤元件的吸烟制品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。一方面，本公开的烟草制品选自下组：小雪茄、不通风过滤嘴香烟、通风过滤嘴香烟、比迪烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟丝、雪茄烟叶、卷烟烟叶、嚼烟、整烟叶、水烟、切碎烟丝(shredded tobacco)和生切烟丝(cut tobacco)。另一方面，本公开的烟草制品是无烟烟草制品。无烟烟草制品不燃烧，包括但不限于嚼烟、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其典型地被包装在大袋状包装中并用于条(plug)或切片(twist)。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且典型地被包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或被包装在置于成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或用于鼻腔的精细研磨的烟草。在进一步的方面，本公开的烟草制品选自下组：散叶嚼烟、烟饼型嚼烟(plug chewing tobacco)、湿鼻烟和鼻烟(nasal snuff)。在又另一方面，本公开的烟草制品选自下组：电子加热的卷烟、e-卷烟、电子蒸发装置。一方面，本文提供的方法包括使用来自本文提供的改性烟草植物的熟化烟叶来制备烟草制品。
如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以类似于烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。
如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。它减少了卷烟中使用的烟草的重量。
本文还提供了由本文提供的烟草植物或植物组分制成的熟化烟草材料。“熟化”是一种陈化过程，其减少水分并导致叶绿素的破坏，使烟叶呈现金黄色，淀粉也转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。一方面，可以使用常规方法熟化本文提供的烟草植物或植物组分，例如烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于各种类型的熟化方法的描述，例如，参见Tso(1999,Chapter 1 in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％-25％的压缩条件下在木桶(例如大桶)或纸板箱中被陈化数年(例如2-5年)。参见美国专利号4,516,590和5,372,149。然后，可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度下的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制烟草。典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10-20％。例如，参见美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter 1 inTobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford)。可以进一步加工熟化的、陈化的和发酵的烟草(例如切丝、切碎、膨化或混合)。例如，参见美国专利号4,528,993；4,660,577和4,987,907。一方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化的、晒制熟化的、晾制熟化的或明火烤制熟化的。
本公开还提供了一种制造烟草制品的方法，所述烟草制品包含来自本文提供的烟草植物的烟草材料。一方面，本文提供的方法包括调制由本文提供的烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其水分含量从12.5％-13.5％增加至21％，混合该经调制的烟草材料以产生所需的混合物。一方面，本文提供的制备烟草制品的方法进一步包含将所述混合物进行加料(casing)或调味。通常，在加料工序中，在混合物中添加加料或调味的材料，以通过平衡化学组成来提高它们的质量并开发某些所需的风味特征。加料工艺的进一步细节可见于L.Davis和M.Nielsen主编的Tobacco Production,Chemistry and Technology,BlackwellScience,1999。
也可以使用包括但不限于热处理(例如烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法加工本文提供的烟草材料。可以使用这些技术加工发酵和非发酵烟草。合适的加工烟草的实例包括深色晾制熟化的、深色明火烤制熟化的、白肋烟、烤制熟化的和雪茄填料或包装纸，以及来自全部抽叶的梗的操作的制品。一方面，烟草纤维包括基于鲜重高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述，可通过加热、发酵(sweating)和/或巴氏杀菌步骤来调制烟草。
本文提供的烟草材料可以进行发酵。典型地，发酵的特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10-20％。例如，参见美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373和5,372,149。除了改变叶的香气外，发酵还可以改变叶的颜色和质地。同样在发酵过程中，可以产生演化气体，可以吸收氧气，可以改变pH值，可以改变保留的水量。例如，参见美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1 in Tobacco,Production,Chemistry andTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。在掺入口腔用制品之前，可以进一步加工(例如切丝、膨化、混合、研磨或粉碎)熟化或熟化并发酵的烟草。在某些情况下，烟草是长切发酵的熟化湿烟草，在与共聚物和任选的食用香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。
一方面，可以将本文提供的烟草材料加工成所需的尺寸。在某些方面，可以将烟草纤维加工成平均纤维尺寸小于200微米。一方面，烟草纤维为75-125微米。另一方面，将烟草纤维加工成尺寸为75微米或更小。一方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切丝或切碎成宽度为10切/英寸(cut/inch)直至110切/英寸，长度为0.1英寸直至1英寸。双切烟草纤维可具有一定范围的颗粒尺寸，使得70％的双切烟草纤维落在-20目-80目的筛目尺寸之间。
可以将本文提供的烟草材料加工成总烘箱挥发物含量为10重量％或更高；20重量％或更高；40重量％或更高；15重量％-25重量％；20重量％-30重量％；30重量％-50重量％；45重量％-65重量％或50重量％-60重量％。本领域技术人员将理解，“潮湿”烟草典型地是指烘箱挥发物含量为约40重量％-60重量％(例如45重量％-55重量％，或50％重量)的烟草。如本文所用，通过计算在预热的强制通风烘箱中于110℃干燥样品3.25小时后样品的失重百分比来确定“烘箱挥发物”。口腔用制品的总烘箱挥发物含量可与用于制备口腔用制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同。本文描述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
一方面，本文提供的烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晒制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草和深色明火烤制熟化烟草。另一方面，本文提供的烟草植物、种子、植物组分、植物细胞和植物基因组来自选自下组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟、金黄色烟、弗吉尼亚烟、东方烟草、土耳其烟草和
烤制熟化烟草(也称为弗吉尼亚烟或金黄色烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“金黄色烟”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高、油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的烤制熟化烟草背景：CC 13、CC 27、CC 33、CC35、CC 37、CC 65、CC67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。另一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的烤制熟化烟草背景：Coker 48、Coker 176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker 347、GL939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、McNair 373、McNair944、Ox 207、Ox 414NF、Reams 126、Reams 713、Reams 744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG22、RG 81、RG H4、RG H51、Speight H-20、Speight G-28、Speight G-58、Speight G-70、Speight G-108、Speight G-l11、Speight G-l17、Speight 168、Speight 179、Speight NF-3、V116、V182，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。参见WO 2004/041006A1。在进一步的方面，本文提供的改性烟草植物、种子、杂交种、品种或品系是选自下组的任何烤制熟化背景：K326、K346和NC196。
晾制熟化烟草包括白肋烟、马里兰烟和暗烟草。共同因素是，熟化主要没有人工的热源和湿度。白肋烟的颜色是浅棕色至深棕色，油含量高、且糖含量低。白肋烟在仓房里晾制熟化。主要的白肋烟种植国家有阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。马里兰烟极度蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性的香气。主要的马里兰烟种植国家包括美国和意大利。另一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的白肋烟背景：Clay 402、Clay403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、HB4488PLC、PD 7319LC、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和V509。在进一步的方面，本文提供的改性烟草植物、种子、杂交种、品种或品系是选自下组的任何白肋烟背景：TN 90、KT209、KT 206、KT212和HB 4488。另一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的马里兰烟背景：Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872和Md 341。
深色晾制熟化烟草与其他类型的主要区别在于熟化过程，其给予深色晾制熟化烟草中褐色至深棕色的颜色和不同的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的深色晾制熟化烟草背景：Sumatra、Jatim、DominicCubano、Besuki、One sucker、Green River、Virginisun-cured和ParaguPassado。
深色明火烤制熟化烟草通常用封闭的熟化室地板上的低燃烧木火熟化。深色明火烤制熟化烟草用于制造管烟(pipe blends)、卷烟、嚼烟、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区域是美国的田纳西、肯塔基和弗吉尼亚。一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的深色明火烤制熟化烟草背景：Narrow Leaf Madole、ImprovedMadole、Tom Rosson Madole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、Small Stalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF485、TN D94、TN D950、V309和V359。
东方烟草也称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们典型地种植在东地中海区域，例如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马里亚。今天的东方品种的特征是植物和叶的尺寸小，以及它独特的香气特性，这是植物在过去的许多世纪中适应贫瘠土壤和恶劣的气候条件的结果。一方面，本文提供的改性烟草植物或种子是选自下组的东方烟草背景：Izmir、Katerini、Samsun、Basma和Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir，以及基本上衍生自上述品种任意之一的任何品种。
一方面，本文提供的改性烟草植物、种子、杂交种、品种或品系基本上衍生自以下品种或是选自以下品种的遗传背景：BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、
所有前面提及的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方类型的具体品种仅出于示例性目的而列出。在本申请中还预期任何其他的深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方品种。
本文还提供了本文所述的烟草植物的群体。一方面，本文提供的烟草植物群体的种植密度为每英亩5,000-8000、5,000-7,600、5,000-7,200、5,000-6,800、5,000-6,400、5,000-6,000、5,000-5,600、5,000-5,200、5,200-8,000、5,600-8,000、6,000-8,000、6,400-8,000、6,800-8,000、7,200-8,000、或7,600-8,000株植物。
本文还提供了来自本文所述烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以包含至少或大于10粒种子；至少或大于25粒种子；至少或大于50粒种子；至少或大于100粒种子；至少或大于200粒种子；至少或大于300粒种子；至少或大于400粒种子；至少或大于500粒种子；至少或大于600粒种子；至少或大于700粒种子；至少或大于800粒种子；至少或大于900粒种子；至少或大于1000粒种子；至少或大于1500粒种子；至少或大于2000粒种子；至少或大于2500粒种子；至少或大于3000粒种子；至少或大于3500粒种子；至少或大于4000粒种子；或至少或大于5000粒种子。或者，容器可含有至少或大于1盎司种子；至少或大于5克种子；至少或大于10克种子；至少或大于30克种子；至少或大于50克种子；至少或大于100克种子；至少或大于500克种子；至少或大于1千克种子；至少或大于1.5千克种子；至少或大于2千克种子；至少或大于5千克种子；或至少或大于10千克种子。烟草种子的容器可以是本领域可用的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒、袋、小包、小袋、带卷、管或瓶。
一方面，本公开提供来自包含降低水平的一种或多种TSNA的改性烟草植物的熟化叶。一方面，降低的一种或多种TSNA选自下组：N'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)/N'-亚硝基新烟草碱(NAT)、N'-亚硝基假木贼碱(NAB)及其任何组合。一方面，使用具有串联质谱的液相色谱仪(LC/MS/MS)基于冻干的熟化叶样品来测量总TSNA或单个TSNA的水平。
一方面，本公开提供来自包含降低水平的一种或多种生物碱的改性烟草植物的熟化叶。一方面，降低的一种或多种生物碱选自下组：烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱。
本公开还提供了用于育种包含增强的氮利用效率的烟草品系、栽培种或品种的方法。可以通过任何已知的程序进行育种。DNA指纹分析、SNP作图、单倍型作图或类似技术可用于标志物辅助选择(MAS)育种程序，以将期望的性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可以使用本文提供的F1杂交种植物在F2或回交代中产生分离群体，或者进一步使F1杂交种植物与具有农学上期望的基因型的其他供体植物杂交。可以使用本领域已知的或本文列出的技术之一筛选F2或回交代植物的期望的农学性状或期望的化学谱。取决于预期的遗传模式或所使用的MAS技术，可以在每个回交循环之前对所选植物进行自花授粉以帮助鉴定所需的单株植物。可以重复回交或其他育种程序，直到恢复轮回亲本的期望表型。一方面，本公开的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种，或东方品种。另一方面，轮回亲本可以是改性烟草植物、品系或品种。一方面，本文提供的轮回亲本为TN90。另一方面，本文提供的轮回亲本为MD609。例如，其他育种技术可见于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishingGo.,Inc.,New York,N.Y.，其全文通过引用并入本文。
使用本文所述的改性烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用的品系、栽培种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有将其与相同物种的其他植物分离的恒定特征的植物群体。品种通常是(尽管并不总是)商业销售的。当具有一个或多个特殊性状，品种的进一步特征是在该品种内个体之间非常小的总体差异。可通过数代自花受粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖生成“纯系”品种。品种可以基本上衍生自另一个品系或品种。根据国际公约对植物新品种保护的定义(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)，品种“基本上衍生”自初始品种，如果：a)它主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达；b)它与初始品种有明显区别；c)除了由衍生行为产生的差异，它在由所述初始品种的基因型或基因型组合产生的必要特征的表达中与初始品种相符合。例如，可通过选择天然或诱导的突变体、体细胞无性变体、来自初始品种植物的变异个体、回交或转化获得基本上衍生的品种。认为第一烟草品种和第一品种基本上从其衍生的第二烟草品种具有基本上相同的遗传背景。与品种不同，“品系”最通常是指非商业使用的一组植物，例如用于植物研究。品系典型地在个体间的一个或多个目标性状上显示非常小的总体差异，尽管在个体间的其他性状上可能存在一些差异。
一方面，本公开提供了一种生产烟草植物的方法，包括使第一烟草品种的至少一种烟草植物与第二烟草品种的至少一种烟草植物杂交，其中与在可比条件下生长的相同品种的对照烟草植物相比，所述第一烟草品种的至少一种烟草植物表现出增强的氮利用效率；选择与在可比条件下生长的相同杂交的对照烟草植物相比，表现出增强的氮利用效率的后代烟草植物。一方面，本文提供的第一烟草品种包含改性烟草植物。另一方面，本文提供的第二烟草品种含括改性烟草植物。一方面，第一或第二烟草品种是雄性不育的。另一方面，第一或第二烟草品种是细胞质雄性不育的。另一方面，第一或第二烟草品种是雌性不育的。一方面，第一或第二烟草品种是优良品种。另一方面，第一或第二烟草品种是杂交种。
一方面，本公开提供了一种将一个或多个转基因渗入烟草品种的方法，该方法包括：(a)将包含一个或多个转基因的第一烟草品种与不含所述一个或多个转基因的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；(b)对一种或多种后代烟草植物进行一个或多个转基因的基因分型；和(c)选择包含一个或多个转基因的后代烟草植物。另一方面，这些方法进一步包括使所选择的后代烟草植物与第二烟草品种回交。在进一步的方面，这些方法还包括：(d)将选择的后代植物与其自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或多种进一步的后代烟草植物；和(e)选择包含一个或多个转基因的进一步的后代烟草植物。一方面，第二烟草品种是优良品种。
一方面，本公开提供了一种将一个或多个突变渗入烟草品种的方法，该方法包括：(a)将包含一个或多个突变的第一烟草品种与不含所述一个或多个突变的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；(b)对一种或多种后代烟草植物进行一个或多个突变的基因分型；和(c)选择包含一个或多个突变的后代烟草植物。另一方面，这些方法还包括使所选择的后代烟草植物与第二烟草品种回交。在进一步的方面，这些方法还包括：(d)将选择的后代植物与其自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或多种进一步的后代烟草植物；和(e)选择包含一个或多个突变的进一步的后代烟草植物。一方面，第二烟草品种是优良品种。
一方面，本公开提供了一种生长包含增强的氮利用效率的改性烟草植物群体的方法，其中该方法包括种植包含一个或多个突变、一个或多个转基因或两者的烟草种子的群体，其中，当在可比条件下生长时，与相同品种的对照烟草植物相比，所述一种或多种改性烟草植物表现出增强的氮利用效率。
一方面，本公开提供了用于制备改性种子的方法，包括将本文提供的重组DNA构建体引入植物细胞中；筛选植物细胞群体的重组DNA构建体；从群体中选择一个或多个植物细胞；从一个或多个植物细胞产生一株或多株改性植物；从一株或多株改性植物收集一粒或多粒改性种子。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标志物所在的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一种或多种多态性；例如，一些个体中存在替代等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但典型地更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在第二条同源染色体上，例如，对于在杂合个体的不同染色体，或者在群体中不同的纯合或杂合个体之间出现。如本文所用，当仅存在一个基因座拷贝时，二倍体植物中的染色体是“半合子的”。例如，当插入的转基因仅插入一条姐妹染色体时(即，第二条姐妹染色体不含插入的转基因)，插入的转基因是半合子的。
一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是纯合的。另一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是杂合的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的转基因是半合子的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是纯合的。另一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是杂合的。一方面，改性的植物、种子、植物组分、植物细胞或植物基因组对于本文提供的突变是半合子的。
如本文所用，“基因渗入”是指将遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递至另一个遗传背景。
如本文所用，“杂交”是指通过受精产生后代(例如细胞、种子或植物)，并且包括不同植物之间的杂交(有性)和自体受精(自交)。
如本文所用，“回交”是指后代植物与其亲本之一重复杂交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渗入其中的亲本植物。最初的杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，依此类推。一方面，重复进行回交，每个连续回交代的后代个体自身与相同的亲本基因型回交。
如本文所用，“优良品种”是指由于优异的农学性能从育种和选择产生的任何品种。
如本文所用，在育种背景下的“选择”是指基于某些预定标准通常从群体挑选或选择期望个体的行为。
一方面，本文提供的烟草植物是杂交种植物。可以通过以下来生产杂交种：阻止第一品种的雌性亲本植物(例如种子亲本)自花受粉，允许第二品种的雄性亲本植物的花粉受精雌性亲本植物，并允许F1杂交种种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育早期将花去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可以使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，可以通过雄性不育(MS)或其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育或自交不亲和来产生雄性不育。包含MS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可以从雄性可育植物收获花粉，并将其人工授至MS雌性亲本植物的柱头，并收获所得的F1种子。此外，雌性不育植物也可以用于阻止自花授粉。
植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自雄性亲本植物的花粉人工转移至去雄的雌性亲本植物或雄性不育的雌性亲本植物以形成F1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作雌性亲本并与不同的雄性亲本杂交。作为另一种选择，可以产生双交杂交种，其中两个不同单交的F1后代与其自身杂交。当形成双交杂交种时，自交不亲和性可以特别有利地用于阻止雌性亲本的自花授粉。
一方面，本文提供的烟草品种是雄性不育。另一方面，本文提供的烟草品种是细胞质雄性不育(CMS)。可以通过本领域已知的任何方法生产雄性不育的烟草植物。生产雄性不育烟草的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillPublishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp。另一方面，本文提供的烟草品种是雌性不育。作为非限制性的实例，可以通过突变STIG1基因来制备雌性不育植物。例如，参见Goldman等1994,EMBO Journal 13:2976-2984。
一方面，本公开提供并且包括一种测定烟草品系的NUE的方法，包括从烟草品系的烟草植物获得至少一种代谢物，测定所获得的至少一种代谢物的量，并基于测定的至少一种代谢物的量测定烟草品系的NUE。在进一步的方面，所述至少一种代谢物获自选自下组的植物组织：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。在该方法的进一步的方面，获得至少两种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少三种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少四种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少五种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少六种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少七种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少八种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少九种代谢物。在该方法的进一步的方面，获得至少十种代谢物。在该方法的进一步的方面，测定至少两种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少三种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少四种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少五种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少六种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少七种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少八种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少九种代谢物的量。在该方法的进一步的方面，测定至少十种代谢物的量。
在本文提供的方法的另一方面，测定了选自下组的代谢物的量：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯(N-acetylmuramate)、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、D-23937、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、4-胍基丁酸酯(guanidinobutanoate)、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、X-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素、X-23454、X-23580和X-23852。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较少量的至少一种代谢物的烟草植物相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较高量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含等量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含增强的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较低量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较低量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较低量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较低量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含较高量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含较高量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含较高量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含较高量的至少五种代谢物。
在本文提供的方法的另一方面，与包含等量的至少一种代谢物的烟草品系相比，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含降低的NUE。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少一个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在两个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少两个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在三个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少三个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在四个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少四个组织中包含等量的至少五种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在五个组织中包含等量的至少一种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少两种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少三种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少四种代谢物。在进一步的方面，具有增强的NUE的烟草植物在至少五个组织中包含等量的至少五种代谢物。
另一方面，本文提供的方法包括使用选自下组的方法测定代谢物的量：液相色谱/质谱法(LC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、超级HPLC(UHPLC)、质谱(MS)、串联质谱(MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)、X射线荧光光谱(XRF)、离子色谱(IC)、气相色谱(GC)、气相色谱/质谱(GC/MS)、毛细管电泳/质谱(CE-MS)、离子迁移谱/质谱(IMS/MS)、X射线衍射、核磁共振(NMR)、发射光谱分析、极谱法、紫外-可见光谱法、红外光谱法和薄层色谱法。
一方面，本说明书提供并且包括一种使用代谢物特征测定烟草品系的NUE的方法，包括从烟草品系的烟草植物分离代谢物特征，测定包括代谢物特征的每种代谢物的量，并且通过将代谢物特征与来自包含已知NUE的对照烟草品系的对照代谢物特征进行比较来测定烟草品系的NUE。在该方法的进一步的方面，与对照烟草品系相比，NUE包含增强的NUE。在该方法的另一方面，从选自下组的植物组织分离代谢物特征：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
在本文提供的方法的一个方面，代谢物特征包含至少两种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少六种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少七种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少八种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少九种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十一种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十二种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少二十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少二十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少三十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少三十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少四十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含至少五十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含两到五十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含三到四十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含三到四十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含四到三十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含五到三十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含六到二十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含七到二十种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含八到十五种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含九到十四种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含十到十三种代谢物。在进一步的方面，代谢物特征包含十到十二种代谢物。
一方面，本说明书提供并且包括一种育种包含与增强的NUE相关的代谢物特征的烟草品系的方法，包括从第一烟草品系测定第一烟草植物的代谢物特征，其中与缺乏代谢物特征的对照烟草植物相比，第一烟草植物包含增强的NUE，将第一植物与第二烟草品系的第二植物杂交，并从杂交获得至少一粒后代种子，其中从至少一个后代种子生长的后代植物包含代谢物特征，并且其中与缺乏代谢物特征的对照植物相比，后代植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，将后代植物与来自第一烟草品系的第三植物杂交。另一方面，第一烟草品系选自下组：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。另一方面，第二烟草品系选自下组：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。另一方面，代谢物特征包含叶代谢物特征。另一方面，代谢物特征包含根代谢物特征。另一方面，与对照烟草植物的代谢物特征相比，代谢物特征包含较高量的4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852或其任何组合。另一方面，与对照烟草植物的代谢物特征相比，代谢物特征包含较低量的X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。
另一方面，本文提供的方法包含含有增强的NUE的烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏增强的NUE的烟草植物相比，增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，包括获得烟草植物群体，从来自烟草植物群体的至少一种烟草植物中分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，并选择与对照烟草植物相比包含较高量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。在该方法的进一步的方面，与对照烟草植物相比，所选的烟草植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，至少一种代谢物选自下组：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852、或其任何组合。在该方法的进一步的方面，从选自下组的植物组织分离代谢物：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择烟草植物的方法，包括获得烟草植物群体，从来自烟草植物群体的至少一种烟草植物中分离与增强的NUE相关的至少一种代谢物，并选择与对照烟草植物相比包含较低量的至少一种代谢物的至少一种烟草植物。在该方法的进一步的方面，与对照烟草植物相比，所选的烟草植物包含增强的NUE。在该方法的进一步的方面，至少一种代谢物选自X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。在该方法的进一步的方面，从选自下组的植物组织分离代谢物：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
一方面，本说明书提供并且包括一种筛选烟草植物中与增强的NUE相关的第一代谢物特征的方法，包括从烟草植物中分离第一代谢物特征，测定包含第一代谢物特征的至少一种代谢物的量，将第一代谢物特征与包含已知NUE的对照烟草植物的第二代谢物特征进行比较，并确定第一代谢物特征是否与增强的NUE相关。
一方面，本说明书提供并且包括一种改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有可操作地连接至编码区的异源启动子的顺化基因多核苷酸，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含选自下组的异源启动子：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。另一方面，异源启动子包含来自烟草基因组的多核苷酸序列。另一方面，异源启动子包含来自植物基因组的多核苷酸序列。另一方面，组织优选启动子是叶优选启动子。另一方面，组织优选启动子是根优选启动子。进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物是白肋烟品种。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本发明的改性烟草种子或烟草植物包含较低量的TSNA。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基降烟碱(NNN)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基新烟草碱(NAT)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的N'-亚硝基假木贼碱(NAB)。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的生物碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的烟碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的降烟碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的假木贼碱。在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含较低量的新烟草碱。
在进一步的方面，本说明书的改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少70％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少75％一致或相似的多肽的编码区：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少80％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少85％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少90％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少95％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少96％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少97％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少98％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少99％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列100％一致的多肽的编码区：SEQ ID NOs:1-8。
在进一步的方面，本说明书的改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少70％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少75％一致或相似的多肽的编码区：SEQ IDNOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少80％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少85％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少90％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少95％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少96％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少97％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少98％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列至少99％一致或相似的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含编码与选自下组的序列一致的多肽的编码区：SEQ ID NOs:9-16。
在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含叶优选启动子，其由与选自下组的序列至少70％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少75％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少80％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少85％一致的序列或其功能性片段编码：：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少90％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少95％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少96％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少97％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少98％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ IDNOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由与选自下组的序列至少99％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。在进一步的方面，叶优选启动子由选自下组的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。
在进一步的方面，改性烟草种子或烟草植物包含根优选启动子，其由与选自下组的序列至少70％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少75％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少80％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少85％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少90％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少95％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少96％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少97％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少98％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ IDNOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由与选自下组的序列至少99％一致的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。在进一步的方面，根优选启动子由选自下组的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本说明书的改性烟草植物在根组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本说明书的改性烟草植物在叶组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本说明书的改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。
在进一步的方面，与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，本说明书的改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
一方面，本说明书提供并且包括一种重组DNA构建体，其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽与选自下组的多肽至少70％一致或相似：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少75％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少80％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少85％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少90％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少95％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少96％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少97％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少98％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽至少99％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多肽100％一致的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
一方面，本说明书提供并且包括包含本文公开的改性烟草种子或植物的温室、生长室或田间。一方面，本说明书提供并且包括使本说明书的烟草植物在温室、生长室或田间中生长的方法。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一个突变：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时至少缺乏至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。在进一步的方面，内源基因座中的突变选自下组：插入、缺失、取代和倒置。另一方面，内源基因座中的突变是沉默突变、非沉默突变或无效突变。在进一步的方面，改性烟草种子或改性烟草植物是白肋烟品种。
在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在根组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在叶组织中包含较高水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。在进一步的方面，与在相同条件下生长的未改性烟草植物相比，改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
一方面，本说明书提供并且包括重组DNA构建体，其包含与向导RNA可操作地连接的异源启动子，该向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少19个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少20个连续核苷酸：SEQ IDNOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少21个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少22个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少23个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少24个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少25个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少26个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少27个连续核苷酸：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸100％一致或互补的至少28个连续核苷酸：SEQ IDNOs:25-40。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一种突变的烟草植物制成：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少两个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少三个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少四个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少五个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少六个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少七个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少八个突变：SEQID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少九个突变：SEQ ID NOs:25-40。在进一步的方面，烟草植物在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少十个突变：SEQ ID NOs:25-40。
一方面，本说明书提供并且包括改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，其中与在相同条件下生长时缺乏顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ IDNOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸包含编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，异源启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。在进一步的方面，组织优选启动子是叶优选启动子。在进一步的方面，组织优选启动子是根优选启动子。
在进一步的方面，sRNA包含至少18个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少19个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少20个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少21个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少22个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少23个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少24个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少25个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少26个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少27个核苷酸。在进一步的方面，sRNA包含至少28个核苷酸。在进一步的方面，sRNA选自下组：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。在进一步的方面，sRNA下调选自下组的多核苷酸的表达或翻译：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括一种重组DNA构建体，其包含与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ IDNOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，重组DNA构建体包含编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA的多核苷酸：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，所述顺化基因多核苷酸包含与编码sRNA的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述sRNA与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，并且其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的NUE。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少90％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少91％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少92％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少93％一致或互补的sRNA：SEQID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少94％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少95％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少96％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少97％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少98％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸至少99％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。在进一步的方面，顺化基因多核苷酸编码与选自下组的多核苷酸100％一致或互补的sRNA：SEQ ID NOs:41-56。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将顺化基因核酸分子引入烟草细胞中，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏顺化基因核酸分子的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使所述改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使所述改性烟草植物自花授粉。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将对编码具有选自SEQ ID NOs:41-56的序列的基因的核酸分子的改性引入烟草细胞中：SEQ ID NOs:41-56，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏改性的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使改性烟草植物自花授粉。另一方面，通过包括使用RNA引导的核酸酶的方法引入改性。另一方面，RNA引导的核酸酶选自下组：Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶及其功能性同源物。另一方面，改性选自下组：插入、取代、倒置和缺失。
一方面，本说明书提供并且包括一种增强烟草植物的NUE的方法，包括将编码小RNA(sRNA)的核酸引入烟草细胞中，所述核酸与编码具有选自SEQ ID NOs:41-56的序列的基因的核酸分子的至少18个连续核酸同源，并从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏sRNA的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。另一方面，所述方法进一步包括使改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使改性烟草植物自花授粉。在进一步的方面，所述方法包括引入选自下组的sRNA：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，包括提供包含增强的NUE的第一烟草植物群体，针对增强的NUE基因座的20cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型；和选择一种或多种经基因分型并被发现包含所述分子标志物的烟草植物。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的15cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的10cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的9cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的8cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的7cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的6cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的5cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的4cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的3cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对在增强的NUE基因座的2cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的1cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，本文公开的方法包括针对增强的NUE基因座的0.5cM内是否存在分子标志物对第一烟草植物群体进行基因分型。在进一步的方面，所述方法包括将一个或多个选定的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交获得后代种子。在进一步的方面，分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
在进一步的方面，本文提供的方法包括包含增强的NUE基因座的烟草植物，所述基因座包含编码与选自下组的多肽至少70％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少75％一致或相似的多肽：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少80％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少85％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少90％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少95％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少96％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少97％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少98％一致或相似的多肽：SEQ IDNOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽至少99％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，多核苷酸编码与选自下组的多肽100％一致的多肽：SEQ ID NOs:1-8。在进一步的方面，增强的NUE基因座与选自下组的多核苷酸序列遗传连接：SEQ ID Nos:57-64。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:58的第57位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:58的第117位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ IDNO:58的第57位的G核苷酸和第117位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:57的第147位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:59的第162位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:60的第36位的C核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:61的第36位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:62的第36位的T核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:63的第36位的G核苷酸遗传连接。在另一方面，增强的NUE基因座与SEQ ID NO:64的第36位的T核苷酸遗传连接。
在本文提供的方法的进一步方面，第一烟草植物群体是马里兰品种。在进一步的方面，本文提供的方法包括选自下组的第一烟草植物群体：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。在进一步的方面，本文提供的方法包括白肋烟品种的第二烟草植物群体。在进一步的方面，本文提供的方法包括选自下组的第二烟草植物群体：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。
在进一步的方面，本文提供的方法包括包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括包含增强的NUE的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的20cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的15cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的10cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的9cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的8cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的7cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的6cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的5cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的4cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的3cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的2cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的1cM内包含分子标志物的后代种子。在进一步的方面，本文提供的方法包括在本文提供的增强的NUE效率基因座的0.5cM内包含分子标志物的后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种方法，该方法包括提供第一烟草植物群体，针对由选自下组的序列编码的基因座的增强的NUE等位基因的存在对第一烟草植物群体进行基因分型：SEQ ID NOs:9-16；和选择一种或多种经基因分型的包含增强的NUE等位基因的烟草植物。在进一步的方面，所述方法进一步包括使一种或多种选择的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交获得后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种将增强的NUE性状基因渗入烟草品种的方法，包括将包含增强的氮利用效率性状的第一烟草品种与缺乏增强的氮利用效率性状的第二烟草品种杂交，从杂交获得后代种子，针对与增强的氮利用效率性状相关的分子标志物对至少一个后代种子进行基因分型，其中所述分子标志物位于具有选自下组的序列的基因座的20cM内：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的氮利用效率性状的后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于具有选自下组的序列的基因座的20cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:9-16，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。在进一步的方面，所述方法还包括使一种或多种选择的烟草植物与第二烟草植物杂交；并从杂交种获得后代种子。
一方面，本说明书提供并且包括一种选择具有增强的NUE性状的烟草植物的方法，包括从烟草种质集合中分离核酸，测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的20cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64，和选择包含增强的NUE性状的烟草植物。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中一个或多个位于选自下组的标志物的15cM内的标志物：SEQ ID NO:58。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的10cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的9cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的8cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的7cM内的一个或多个标志物：SEQID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的6cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的5cM内的一个或多个标志物：SEQ IDNOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的4cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的3cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的2cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的1cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中位于选自下组的标志物的0.5cM内的一个或多个标志物：SEQ ID NOs:57-64。在进一步的方面，本文公开的方法包括测定分离的核酸中选自下组的标志物：SEQ ID NOs:57-64。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:58的第57位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:58的第117位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ IDNO：58的第57位包含G核苷酸，在第117位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:57的第147位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:59的第162位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQID NO:60的第36位包含C核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:61的第36位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:62的第36位包含T核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:63的第36位包含G核苷酸。在另一方面，与增强的NUE相关的等位基因在SEQ ID NO:64的第36位包含T核苷酸。在进一步的方面，可以选择包含与本文公开的增强的NUE相关的等位基因的任何组合的烟草植物。
以下是示例性实施方式。
实施方式1.一种测定烟草品系的氮利用效率(NUE)的方法，包括：
a.从所述烟草品系的烟草植物获得至少一种代谢物；
b.测定所述至少一种代谢物的量；和
C.基于在步骤(b)中鉴定的所述至少一种代谢物的量测定所述烟草品系的氮利用效率。
实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中所述至少一种代谢物从选自下组的植物组织获得：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
实施方式3.根据实施方式1或2所述的方法，其中所述植物组织包含叶组织。
实施方式4.根据实施方式1-3任一项所述的方法，其中所述植物组织包含根组织。
实施方式5.根据实施方式1-4任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物选自下组：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、D-23937、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、X-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素、X-23454、X-23580和X-23852。
实施方式6.根据实施方式1-5任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含较低量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含增强的NUE。
实施方式7.根据实施方式1-6任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含等量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含增强的NUE。
实施方式8.根据实施方式1-7任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含等量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含增强的NUE。
实施方式9.根据实施方式1-8任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含较低量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含降低的NUE。
实施方式10.根据实施方式1-9任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含等量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含降低的NUE。
实施方式11.根据实施方式1-10任一项所述的方法，其中与在所述至少一种组织中包含等量的所述至少一种代谢物的烟草品系相比，所述NUE包含降低的NUE。
实施方式12.根据实施方式1-11任一项所述的方法，其中所述测定所述至少一种代谢物的量包括选自下组的方法：液相色谱/质谱法(LC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、超级HPLC(UHPLC)、质谱(MS)、串联质谱(MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)、X射线荧光光谱(XRF)、离子色谱(IC)、气相色谱(GC)、气相色谱/质谱(GC/MS)、毛细管电泳/质谱(CE-MS)、离子迁移谱/质谱(IMS/MS)、X射线衍射、核磁共振(NMR)、发射光谱分析、极谱法、紫外-可见光谱法、红外光谱法和薄层色谱法。
实施方式13.根据实施方式1-12任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物包含至少两种代谢物。
实施方式14.根据实施方式1-13任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物包含至少五种代谢物。
实施方式15.根据实施方式1-14任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物包含至少十种代谢物。
实施方式16.一种使用代谢物特征测定烟草品系的氮利用效率(NUE)的方法，包括：
a.从所述烟草品系的烟草植物分离所述代谢物特征；
b.测定包含所述代谢物特征的每种代谢物的量；和
c.通过将所述代谢物特征与来自包含已知NUE的对照烟草品系的对照代谢物特征比较来测定所述烟草品系的所述NUE。
实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述代谢物特征包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50种代谢物。
实施方式18.根据实施方式16或17所述的方法，其中与所述对照烟草品系相比，所述NUE包含增强的NUE。
实施方式19.根据实施方式16-18任一项所述的方法，其中与所述对照烟草品系相比，所述NUE包含减少的NUE。
实施方式20.根据实施方式16-19任一项所述的方法，其中所述代谢物特征分离自选自下组的植物组织：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
实施方式21.一种育种包含与增强的氮利用效率(NUE)相关的代谢物特征的烟草品系的方法，包括：
a.测定来自第一烟草品系的第一烟草植物的代谢物特征，其中与缺乏所述代谢物特征的对照烟草植物相比，所述第一烟草植物包含增强的NUE；
b.将所述第一烟草植物与第二烟草品系的第二植物杂交；和
c.从步骤(a)的杂交获得至少一个后代种子，其中从至少一个后代种子生长的后代植物包含所述代谢物特征，并且其中与缺乏所述代谢物特征的对照植物相比，所述后代植物包含增强的NUE。
实施方式22.根据实施方式21所述的方法，其中所述方法进一步包括：
d.将所述后代植物与来自所述第一烟草品系的烟草植物杂交。
实施方式23.根据实施方式21或22所述的方法，其中所述第一烟草品系选自下组：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。
实施方式24.根据实施方式21-23任一项所述的方法，其中所述第二烟草品系选自下组：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。
实施方式25.根据实施方式21-24任一项所述的方法，其中所述代谢物特征包含叶代谢物特征。
实施方式26.根据实施方式21-25任一项所述的方法，其中所述代谢物特征包含根代谢物特征。
实施方式27.根据实施方式21-26任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式28.根据实施方式21-27任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式29.根据实施方式21-28任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式30.根据实施方式21-29任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式31.根据实施方式21-30任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式32.根据实施方式21-31任一项所述的方法，其中与所述对照烟草植物的代谢物特征相比，所述代谢物特征包含等量的4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852或其任何组合。
实施方式33.根据实施方式21-32任一项所述的方法，其中与所述对照烟草植物的代谢物特征相比，所述代谢物特征包含较低量的X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。
实施方式34.根据实施方式21-33任一项所述的方法，其中所述代谢物特征包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50种代谢物。
实施方式35.一种选择烟草植物的方法，包括：
a.获得烟草植物群体；
b.从所述烟草植物群体的至少一种烟草植物分离与增强的氮利用效率(NUE)相关的至少一种代谢物；和
c.选择与对照烟草植物相比包含等量的所述至少一种代谢物的至少一种烟草植物。
实施方式36.根据实施方式35所述的方法，其中与所述对照烟草植物相比，步骤(c)选择的所述烟草植物包含相等的NUE。
实施方式37.根据实施方式35或36所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式38.根据实施方式35-37任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式39.根据实施方式35-38任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式40.根据实施方式35-39任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式41.根据实施方式35-40任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式42.根据实施方式35-41任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物选自下组：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺、对羟基苯甲醛、X-23454、X-23580、X-23852或其任何组合。
实施方式43.根据实施方式35-42任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物分离自叶组织或根组织。
实施方式44.根据实施方式35-43任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物分离自选自下组的植物组织：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
实施方式45.一种选择烟草植物的方法，包括：
a.获得烟草植物群体；
b.从所述烟草植物群体的至少一种烟草植物分离与增强的氮利用效率(NUE)相关的至少一种代谢物；和
c.选择与对照烟草植物相比包含较低量的所述至少一种代谢物的至少一种烟草植物。
实施方式46.根据实施方式45所述的方法，其中与对照烟草植物相比，步骤(c)选择的所述烟草植物包含相等的NUE。
实施方式47.根据实施方式45或46所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式48.根据实施方式45-47任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式49.根据实施方式45-48任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式50.根据实施方式45-49任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式51.根据实施方式45-50任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式52.根据实施方式45-51任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物选自X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916、1-甲基腺嘌呤、X-23453、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、X-23366、N-乙酰苯基丙氨酸、柚皮素或其任何组合。
实施方式53.根据实施方式45-52任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物分离自叶组织或根组织。
实施方式54.根据实施方式45-53任一项所述的方法，其中所述至少一种代谢物分离自选自下组的植物组织：根组织、叶组织、花组织、分生组织和茎组织。
实施方式55.一种筛选烟草植物中与增强的氮利用效率(NUE)相关的代谢物特征的方法，包括：
a.从所述烟草植物分离与增强的NUE相关的第一代谢物特征；
b.测定包含所述第一代谢物特征的至少一种代谢物的量；
c.将所述第一代谢物特征与包含已知NUE的对照烟草植物的第二代谢物特征比较；和
d.确定所述第一代谢物特征是否与增强的NUE相关。
实施方式56.根据实施方式55所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式57.根据实施方式55或56所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式58.根据实施方式55-57任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式59.根据实施方式55-58任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式60.根据实施方式55-59任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式61.一种改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式62.根据实施方式61所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述编码区编码与选自下组的序列至少70％一致或相似的多肽：SEQ ID NOs:1-8。
实施方式63.根据实施方式61或62所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述编码区包含与选自下组的多核苷酸序列至少70％一致或互补的多核苷酸序列：SEQ ID NOs:9-16。
实施方式64.根据实施方式61-63任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。
实施方式65.根据实施方式61-64任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子包含来自烟草基因组的多核苷酸序列。
实施方式66.根据实施方式61-65任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子包含来自植物基因组的多核苷酸序列。
实施方式67.根据实施方式61-66任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述组织优选启动子是叶优选启动子。
实施方式68.根据实施方式61-67任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述组织优选启动子是根优选启动子。
实施方式69.根据实施方式61-68任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述叶优选启动子由与选自下组的序列至少70％一致或互补的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。
实施方式70.根据实施方式61-69任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述根优选启动子由与选自下组的序列至少70％一致或互补的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。
实施方式71.根据实施方式61-70任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。
实施方式72.根据实施方式61-71任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。
实施方式73.根据实施方式61-72任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。
实施方式74.根据实施方式61-73任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
实施方式75.根据实施方式61-74任一项所述的改性烟草种子或植物，其中所述改性烟草种子或植物是白肋烟品种。
实施方式76.根据实施方式61-75任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草种子或植物包含较低量的TSNA。
实施方式77.一种重组DNA构建体，其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多肽与选自下组的多肽至少70％一致或相似：SEQ ID NOs:1-8。
实施方式78.熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含含有与编码区可操作地连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式79.温室、生长室或田间，其包含根据实施方式61-76任一项所述的改性烟草种子或植物。
实施方式80.改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一个突变：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式81.根据实施方式80所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述至少一种突变选自下组：插入、缺失、取代和倒置。
实施方式82.根据实施方式80或81所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述至少一种突变是无效突变。
实施方式83.根据实施方式80-82任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。
实施方式84.根据实施方式80-83任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。
实施方式85.根据实施方式80-84任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。
实施方式86.根据实施方式80-85任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
实施方式87.根据实施方式80-86任一项所述的改性烟草种子或植物，其中所述改性烟草种子或植物是白肋烟品种。
实施方式88.根据实施方式80-87任一项所述的改性烟草种子或植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性烟草植物相比，所述改性烟草种子或植物包含较低量的TSNA。
实施方式89.一种重组DNA构建体，其包含与向导RNA可操作地连接的异源启动子，所述向导RNA包含与编码选自下组的多肽的多核苷酸一致或互补的至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27或至少28个连续核苷酸：SEQID NOs:25-40。
实施方式90.熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由在编码选自下组的多肽的内源基因座中包含至少一种突变的烟草植物制成：SEQ ID NOs:25-40，其中与在相同条件下生长时缺乏所述至少一种突变的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式91.改性烟草种子或由其生长的烟草植物，其包含含有与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作连接的异源启动子的顺化基因多核苷酸，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ ID NOs:41-56，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式92.根据实施方式91所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述sRNA包含至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27或至少28个核苷酸。
实施方式93.根据实施方式91或92所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述sRNA选自下组：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。
实施方式94.根据实施方式91-93任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述sRNA下调选自下组的多核苷酸的表达或翻译：SEQ ID NOs:41-56。
实施方式95.根据实施方式91-94任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子、组织优选启动子和组织特异性启动子。
实施方式96.根据实施方式91-95任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述组织优选启动子是叶优选启动子。
实施方式97.根据实施方式91-96任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述组织优选启动子是根优选启动子。
实施方式98.根据实施方式91-97任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述叶优选启动子由与选自下组的序列至少70％一致或互补的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:17-19。
实施方式99.根据实施方式91-98任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述根优选启动子由与选自下组的序列至少70％一致或互补的序列或其功能性片段编码：SEQ ID NOs:20-24。
实施方式100.根据实施方式91-99任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子包含来自烟草基因组的多核苷酸序列。
实施方式101.根据实施方式91-100任一项所述的改性烟草种子或烟草植物，其中所述异源启动子包含来自植物基因组的多核苷酸序列。
实施方式102.根据实施方式91-101任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、丁香醛、硫胺和对羟基苯甲醛。
实施方式103.根据实施方式91-102任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含相等水平的选自下组的代谢物：4-胍基丁酸酯、X-23454、X-23580和X-23852。
实施方式104.根据实施方式91-103任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在根组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-2357、N-乙酰胞壁酸酯、X-23319、X-23852、X-23330、α-酮戊二酸酯、X-21756、4-羟基-2-酮戊二酸、X-23937、X-23916和1-甲基腺嘌呤。
实施方式105.根据实施方式91-104任一项所述的改性烟草植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草植物在叶组织中包含较低水平的选自下组的代谢物：X-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N’-甲基烟酰胺、可替宁、X-23389、N-乙酰精氨酸、N-23366、N-乙酰苯基丙氨酸和柚皮素。
实施方式106.根据实施方式91-105任一项所述的改性烟草种子或植物，其中所述改性烟草种子或植物是白肋烟品种。
实施方式107.根据实施方式91-106任一项所述的改性烟草种子或植物，其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性烟草植物相比，所述改性烟草种子或植物包含较低量的TSNA。
实施方式108.一种重组DNA构建体，其包含与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸至少85％一致或互补：SEQ IDNOs:41-56。
实施方式109.熟化的烟草材料或包含所述熟化的烟草材料的烟草制品，其中所述熟化的烟草材料由包含顺化基因多核苷酸的烟草植物制成，所述顺化基因多核苷酸包含与编码小RNA(sRNA)的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸与选自SEQ IDNOs:41-56的多核苷酸至少85％一致或互补，并且其中与在相同条件下生长时缺乏所述顺化基因多核苷酸的未改性对照烟草植物相比，所述改性烟草种子或烟草植物包含增强的氮利用效率。
实施方式110.一种增强烟草植物的氮利用效率(NUE)的方法，包括：
a.将顺化基因核酸分子引入烟草细胞中；和
b.从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏所述顺化基因核酸分子的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
实施方式111.根据实施方式110所述的方法，其中所述方法进一步包括：
c.使所述改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使所述改性烟草植物自花授粉。
实施方式112.根据实施方式110或111所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式113.根据实施方式110-112任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式114.根据实施方式110-113任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式115.根据实施方式110-114任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式116.根据实施方式110-115任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式117.一种增强烟草植物的氮利用效率(NUE)的方法，包括：
a.将对编码具有选自下组的序列的基因的核酸分子的改性引入烟草细胞中：SEQID NOs:41-56；和
b.从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏所述改性的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
实施方式118.根据权利要求117所述的方法，其中所述引入包含使用RNA引导的核酸酶。
实施方式119.根据权利要求117或118所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶选自下组：Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶及其功能性同源物。
实施方式120.根据权利要求117-119任一项所述的方法，其中所述改性选自下组：插入、取代、倒置和缺失。
实施方式121.根据权利要求117-120任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式122.根据实施方式117-121任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式123.根据实施方式117-122任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式124.根据实施方式117-123任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式125.根据实施方式117-124任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式126.根据实施方式117-125任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
c.使所述改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使所述改性烟草植物自花授粉。
实施方式127.一种增强烟草植物的氮利用效率(NUE)的方法，包括：
a.将编码小RNA(sRNA)的核酸引入烟草细胞中，所述核酸与编码具有选自下组的序列的基因的核酸分子的至少18个连续核酸同源：SEQ ID NOs:41-56；和
b.从所述烟草细胞再生改性烟草植物，其中与缺乏所述sRNA的烟草植物相比，所述改性烟草植物包含增强的NUE。
实施方式128.根据实施方式127所述的方法，其中所述sRNA选自下组：microRNA、小干扰RNA(siRNA)、反式作用siRNA及其前体。
实施方式129.根据权利要求127或128所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式130.根据实施方式127-129任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式131.根据实施方式127-130任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式132.根据实施方式127-131任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式133.根据实施方式127-132任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式134.根据实施方式127-133任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
c.使所述改性烟草植物与第二烟草植物杂交或使所述改性烟草植物自花授粉。
实施方式135.一种方法，包括：
a.提供包含增强的氮利用效率的第一烟草植物群体；
b.针对增强的氮利用效率基因座的20cM内分子标志物的存在对第一烟草植物群体进行基因分型；和
c.选择一种或多种步骤(b)中经基因分型的包含所述分子标志物的烟草植物。
实施方式136.根据实施方式135所述的方法，其中所述方法进一步包括：
d.使步骤(c)中选择的一种或多种烟草植物与第二烟草植物杂交；和
e.从步骤(d)的杂交获得后代种子。
实施方式137.根据实施方式135或136所述的方法，其中所述分子标志物选自下组：SNP标志物、INDEL标志物、RFLP标志物、SSR标志物、AFLP标志物和RAPD标志物。
实施方式138.根据实施方式135-137任一项所述的方法，其中所述增强的氮利用效率基因座包含编码与选自下组的多肽至少70％一致或相似的多肽的多核苷酸：SEQ IDNOs:1-8。
实施方式139.根据实施方式135-138任一项所述的方法，其中所述增强的氮利用效率基因座包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NOs:9-16。
实施方式140.根据实施方式135-139任一项所述的方法，其中所述分子标志物选自下组：SEQ ID NOs:57-64。
实施方式141.根据实施方式135-140任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:58的第57位包含G核苷酸。
实施方式142.根据实施方式135-141任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:58的第117位包含C核苷酸。
实施方式143.根据实施方式135-142任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:58的第57位包含G核苷酸和在SEQ ID NO:58的第117位包含C核苷酸。
实施方式144.根据实施方式135-143任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:57的第14位包含T核苷酸。
实施方式145.根据实施方式135-144任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:59的第162位包含G核苷酸。
实施方式146.根据实施方式135-145任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:60的第36位包含C核苷酸。
实施方式147.根据实施方式135-146任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:61的第36位包含T核苷酸。
实施方式148.根据实施方式135-147任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:62的第36位包含T核苷酸。
实施方式149.根据实施方式135-148任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:63的第36位包含G核苷酸。
实施方式150.根据实施方式135-149任一项所述的方法，其中所述分子标志物在SEQ ID NO:64的第36位包含T核苷酸。
实施方式151.根据实施方式135-150任一项所述的方法，其中所述第一烟草植物群体是马里兰品种。
实施方式152.根据实施方式135-151任一项所述的方法，其中所述第一烟草植物群体是选自下组的品种：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。
实施方式153.根据实施方式135-152任一项所述的方法，其中所述第二烟草植物是选自下组的品种：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。
实施方式154.根据实施方式135-153任一项所述的方法，其中所述后代种子包含所述分子标志物。
实施方式155.根据实施方式135-154任一项所述的方法，其中所述后代种子包括所述增强的氮利用效率。
实施方式156.根据实施方式135-155任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的15cM内。
实施方式157.根据实施方式135-156任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的10cM内。
实施方式158.根据实施方式135-157任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的5cM内。
实施方式159.根据实施方式135-158任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的2cM内。
实施方式160.根据实施方式135-159任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的1cM内。
实施方式161.根据实施方式135-160任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述增强的氮利用效率基因座的0.5cM内。
实施方式162.一种方法，包括：
a.提供第一烟草植物群体；
b.针对由选自下组的序列编码的基因座的增强的氮利用效率等位基因的存在对第一烟草植物群体进行基因分型：SEQ ID NOs:9-16；和
c.选择一种或多种步骤(b)中经基因分型的包含所述增强的氮利用效率等位基因的烟草植物。
实施方式163.根据实施方式161或162所述的方法，其中所述方法进一步包括：
d.使步骤(c)中选择的一种或多种烟草植物与第二烟草植物杂交；和
e.从步骤(d)的杂交获得后代种子。
实施方式164根据实施方式161-163任一项所述的方法，其中所述第一烟草植物群体是马里兰品种。
实施方式165.根据实施方式161-164任一项所述的方法，其中所述第一烟草植物群体是选自下组的品种：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。
实施方式166.根据实施方式161-165任一项所述的方法，其中所述第二烟草植物是选自下组的品种：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。
实施方式167.根据实施方式161-166任一项所述的方法，其中所述后代种子包含所述分子标志物。
实施方式168.根据实施方式161-167任一项所述的方法，其中所述后代种子包含所述增强的氮利用效率。
实施方式169.一种将增强的氮利用效率性状基因渗入烟草品种的方法，包括：
a.将包含所述增强的氮利用效率性状的第一烟草品种与缺乏所述增强的氮利用效率性状的第二烟草品种杂交；
b.从步骤(a)的杂交获得后代种子；
c.针对与所述增强的氮利用效率性状相关的分子标志物对步骤(b)获得的至少一个所述后代种子进行基因分型，其中所述分子标志物在选自下组的基因座的20cM内：SEQID NOs:9-16；和
d.选择包含所述增强的氮利用效率性状的后代种子。
实施方式170.根据实施方式169所述的方法，其中所述第一烟草品种是马里兰烟草品种。
实施方式171.根据实施方式169或170所述的方法，其中所述第一烟草品种是选自下组的品种：MD609、MD601、Banket A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925。
实施方式172.根据实施方式169-171任一项所述的方法，其中所述第二烟草品种是白肋烟品种。
实施方式173.根据实施方式169-172任一项所述的方法，其中所述第二烟草品种是选自下组的品种：TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC。
实施方式174.根据权利要求169-173任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的偏要素生产率(PFP)。
实施方式175.根据实施方式169-174任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的农学效率(AE)。
实施方式176.根据实施方式169-175任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的回收效率(RE)。
实施方式177.根据实施方式169-176任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的生理效率(PE)。
实施方式178.根据实施方式169-177任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏所述增强的NUE的烟草植物相比，所述增强的NUE包含增加的内部效率(IE)。
实施方式179.根据实施方式169-178任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的15cM内。
实施方式180.根据实施方式169-179任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的10cM内。
实施方式181.根据实施方式169-180任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的5cM内。
实施方式182.根据实施方式169-181任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的2cM内。
实施方式183.根据实施方式169-182任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的1cM内。
实施方式184.根据实施方式169-183任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的0.5cM内。
实施方式185.一种选择包含增强的氮利用效率性状的烟草植物的方法，包括：
a.从烟草种质集合中分离核酸；
b.测定所述核酸中一种或多种位于选自下组的基因座的20cM内的标志物：SEQ IDNOs:9-16；和
c.选择包含所述增强的氮利用效率性状的所述烟草植物。
实施方式186.根据实施方式185所述的方法，其中所述方法进一步包括：
d.使步骤(c)中选择的所述烟草植物与第二烟草植物杂交；和
e.从步骤(d)的杂交获得后代种子。
实施方式187.根据实施方式185或186所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的15cM内。
实施方式188.根据实施方式185-187任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的10cM内。
实施方式189.根据实施方式185-188任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的5cM内。
实施方式190.根据实施方式185-189任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的2cM内。
实施方式191.根据实施方式185-190任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的1cM内。
实施方式192.根据实施方式185-191任一项所述的方法，其中所述分子标志物在所述基因座的0.5cM内。
实施方式193.一种选择包含增强的氮利用效率性状的烟草植物的方法，包括：
a.从烟草种质集合中分离核酸；
b.测定所述核酸中一种或多种位于选自下组的SNP标志物的20cM内的标志物：SEQID NOs:57-64；和
c.选择包含所述增强的氮利用效率性状的所述烟草植物。
实施方式194.根据实施方式193所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:58的第57位的G核苷酸。
实施方式195.根据实施方式193或194所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ IDNO:58的第117位的C核苷酸。
实施方式196.根据实施方式193-195任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:58的第57位的G核苷酸和第117位的C核苷酸。
实施方式197.根据实施方式193-195任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:57的第14位的T核苷酸。
实施方式198.根据实施方式193-197任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:59的第162位的G核苷酸。
实施方式199.根据实施方式193-198任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:60的第36位的C核苷酸。
实施方式200.根据实施方式193-199任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:61的第36位的T核苷酸。
实施方式201.根据实施方式193-200任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:62的第36位的T核苷酸。
实施方式202.根据实施方式193-201任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:63的第36位的G核苷酸。
实施方式203.根据实施方式193-202任一项所述的方法，其中所述测定包括测定SEQ ID NO:64的第36位的T核苷酸。
具体实施方式
实施例1：田间生产实践
使用标准的田间生产实践产生田间种植的烟草植物。每个测试地块包含最多40排移植的幼苗。移植前，将幼苗在温室中萌发。为了测试NUE的性状，测试地块接受的氮率为60磅氮/英亩。当测试地块中50％的植物到达细长的按钮阶段时，使用标准程序将植物打顶。农药的施用遵循标准方案。成熟时收获叶，并分为每地块3根枝条，每根枝条5棵植物进行熟化。在取下/剥离阶段从枝条上取样叶。每个实验品种从三种不同的枝条中收获五片叶，每个样品15片叶。从每棵植物顶部的第四片叶收获一半的叶片进行采样。使用本领域已知的常规方法进行生物碱、TSNA和NO3的分析。
实施例2：鉴定与增强的氮利用率相关的代谢物
与白肋烟烟草品种相比，马里兰烟草品种所需氮肥输入量减少约25％。为了鉴定与高氮效率(马里兰烟)和低氮效率(白肋烟)烟草品种相关的代谢物，在马里兰烟草品种MD609和白肋烟烟草品种TN90中检测了代谢物水平的差异。
MD609和TN90幼苗从种子萌发，并且在不添加氮的情况下生长六周。六周后，将每个品种的幼苗分成两组：A组包含提供有0.01％氮或正常温室施肥的植物；并且B组包含提供有25ppm或25％的正常温室施肥率的植物。播种后第10和14周，用甲醇从根叶组织中提取代谢物。
使用三种不同的LC/MS途径(UHPLC-MS/MS(+ESI)、UHPLC-MS/MS(-ESI)和GC-MS(+EI))分析分离的代谢物，以分离和鉴定单个代谢物。通过将获得的质谱与标准光谱数据库(Metabolon Inc,Morrisville,NC)比较来鉴定代谢物。使用曲线下面积定量峰。通过将中位数记录为等于一(1.00)并按比例归一化每个数据点(称为“块校正”)来标定每个化合物。表1中提供了未知代谢物的分子量。表2-5列出了区分性代谢物，以及每个样品的标定测量值。通过考虑所有时间点的TN90和MD609之间的Student t检验比较测定区分性代谢物。将p值小于0.01的代谢物包括在分析中。
表1：未知代谢物化合物的分子质量，以千道尔顿表示
表2：当比较播种后第10周和第14周的MD609和TN90烟草品系时，代谢物与根组织中鉴定的增强的氮效率呈负相关。
表3：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与根组织中鉴定的增强的氮效率呈正相关
表4：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与叶组织中鉴定的增强的氮效率呈负相关。
表5：当比较MD609和TN90烟草品系时，代谢物与叶组织中鉴定的增强的氮效率呈正相关
实施例3：鉴定与增强的氮利用效率有关的基因表达
还对实施例1中使用的相同植物进行RNA提取以用于RNAseq。播种后第10周和第14周从叶和根组织中提取RNA以用于Illumina测序。根据本领域标准方法分析RNAseq数据。随后，验证候选基因。
发现十七个基因(表6和7)与MD609的增强的氮利用效率表型负相关，并且发现七个基因(表8和9)与MD609的增强的氮利用效率表型正相关。负相关的基因是白肋烟烟草品种中下调的候选基因(通过诱变、顺化基因转化或转基因转化)，并且正相关的基因是白肋烟烟草品种中过表达以改进氮利用效率的候选基因。提供相关的单核苷酸多态性(SNP)标志物用于跟踪每个候选基因(表6-10)。提供与MD609等位基因相关的多态性，因此有利于增强的NUE(表10)。
对每个相关基因的基因组位置的鉴定鉴定了与烟草基因组中增强的NUE相关的四个基因簇(图1)。七个基因类似地位于染色体1上，四个基因类似地位于染色体11上，三个基因类似地位于染色体14上，并且五个基因类似地位于染色体20上(图1)。这四个位置也是低氮和正常氮条件下差异表达基因的热点(图1)。生成SNP标志物以鉴定MD609是特异的，因此对这些位置的每一个鉴定增强的NUE多态性(表6-10)。进一步表征染色体11上的区域，其包含79个总表达基因，并且这些基因中46个是在低氮条件下的差异表达的基因(图2)。
表6：鉴定为与根组织中增强的氮利用效率负相关的基因。
表7：鉴定为与叶组织中增强的氮利用效率负相关的基因。
表8：鉴定为与根组织中增强的氮利用效率正相关的基因。
表9：鉴定为与叶组织中增强的氮利用效率正相关的基因。
表10：包含与增强的NUE相关的多态性的SNP标志物
实施例4：鉴定烟草叶优选和根优选启动子
从10种组织类型(打顶前的腋芽；打顶后2小时的腋芽；打顶后6小时的腋芽；打顶后24小时的腋芽；打顶后72小时的腋芽；打顶前的根；打顶后24小时的根；打顶后72小时的根；打顶时的幼叶；以及茎尖分生组织)获得来自4周大TN90烟草植物的RNA样品。将得到的RNA样品(每种组织类型三个独立收集的样品)用作Illumina 1x100bp测序的起始材料。
将Illumina读长进行映射(mapping)并用于鉴定表现出高根或叶表达的候选基因列表。表11和12提供了鉴定为具有叶优选或根优选表达的基因的RPKM表达值。这些基因是分别具有叶优选启动子或根优选启动子的候选基因。
表11：具有叶优选表达的基因
表12：具有根优选表达的基因
实施例5：开发改性植物
将表达载体p45-2-7(SEQ ID NO：65)用作骨架以产生多个转化载体(参见实施例X-Y)。p45-2-7含有CsVMV启动子、NOS终止子和包含与Actin2启动子和NOS终止子可操作地连接的卡那霉素选择标志物(NPT II)的盒。通过农杆菌转化将包含目标转基因的核酸载体引入烟草叶盘。例如，参见Mayo等,2006,Nat Protoc.1:1105-11and Horsch et al.,1985,Science 227:1229-1231。
在MagentaTM GA-7盒中生长TN90烟草植物，切割叶盘并置于培养板中。通过在50mL离心管中以3500RPM离心20mL细胞悬浮液10分钟来收集包含转化载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。除去上清液，将根癌农杆菌细胞沉淀重悬于40mL液体再悬浮培养基中。用#15剃刀刀片将烟草叶切成8个0.6cm的圆盘(避免中脉)，并倒置在培养板中。将具有B5维生素液体再悬浮培养基的薄层Murashige&Skoog添加到培养板中，并用细针均匀地戳叶盘。将约25mL根癌农杆菌悬浮液添加到培养板中，并将叶盘在悬浮液中孵育10分钟。
将叶盘转移至共培养的培养板(1/2MS培养基)中，将圆盘倒置放置，与覆盖在共培养TOM培养基(含有20g/L蔗糖；1mg/L吲哚-3-乙酸和2.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的MS培养基)上的滤纸接触。将培养板用封口膜密封，然后在昏暗的光照(60-80mE/ms)中以18小时光照、6小时黑暗的光周期在24℃下孵育6小时，持续3天。孵育后，将叶盘转移至再生/选择TOM K培养基的培养板(TOM培养基加300mg/L卡那霉素)。在昏暗的光照中以18小时光照、6小时黑暗的光周期在24℃下每两周将叶盘传代培养至新鲜的TOM K培养基，直至嫩芽变得可切除。用镊子从叶取出嫩芽，并插入含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中。在24℃下以18小时光照、6小时黑暗的光周期(高强度光照，6080mE/ms)在含有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基上孵育嫩芽，以诱导生根。
当含有嫩芽和根的小植株长得足够大时(例如，达到MagentaTM GA-7盒的大约一半高度)，将它们转移到土壤中。将已建立的幼苗转移到温室中进行进一步分析并结种。通过生长改性植物(T0、T1、T2或更晚代)和对照植物来进行增强的氮利用效率的评估。对照植物是未转化的NLM植物或用空p45-2-7载体转化的NLM植物。
在温室中使用零百万分之零(ppm)氮(无氮)、25ppm氮(低氮)和100ppm氮(正常氮)进行增强的氮利用效率的表型筛选。初步筛选在带有T1植物的温室中进行。然后，在田间使用60磅/英亩化肥(约为白肋烟推荐率的25％)评估纯合T2群体。测量幼苗生长、叶绿素损失和最终产量，并将其与正常氮水平下生长的对照植物比较。
在T1代中，在温室中生长过表达G20580(2个独立转化体)、G42290(4个独立转化体)、G41446(4个独立转化体)、G53261(2个独立转化体)和G30999(3个独立转化体)的植物，以及在相当于60磅氮/英亩的氮限制条件下的对照。每个转化体取样九株植物，并且与对照相比，过表达G41446的品系之一显示产量(鲜重克/植物)的统计学显著增加(参见图5)。
实施例6：产生具有增强的氮利用效率的顺化基因烟草植物
可以通过对涉及在实施例2中鉴定为差异表达的基因的基因表达进行改性来改进氮利用效率。类似地，可以对涉及实施例1中鉴定的代谢物的生物合成或降解的基因进行调节以改进氮利用效率。可以使用一般的过表达启动子或组织优选启动子来过表达与增强的氮利用效率正相关的基因，以在所需组织中过表达该基因。
产生转化载体以过表达与增强的氮利用效率正相关的蛋白质。将包含SEQ IDNOs:9-16之一的单独的转化载体掺入p45-2-7转化载体中。另外，产生包含SEQ ID NOs:9-16之一的转化载体。
根据实施例4，使用这些转化载体产生改性烟草植物。然后，如实施例4所述表型评估改性烟草植物(T1代)和对照烟草植物。与在相同条件下生长的对照烟草植物相比，改性烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例7：产生具有增强的氮利用效率的转基因烟草植物
还可通过下调实施例2中鉴定为与氮利用效率负相关的基因的表达来增强氮利用效率。
设计包含RNAi构建体的转化载体以抑制其在实施例2中的表达与氮利用效率负相关的烟草基因。单独的转化载体包含SEQ ID NOs:41-56之一，其被掺入p45-2-7中转化载体中。产生另外的转化载体，其包含SEQ ID NOs:41-56之一。
根据实施例4，使用这些转化载体产生改性烟草植物。然后，如实施例4所述，表型评估改性烟草植物(T1代)和对照烟草植物。与在相同条件下生长的对照烟草植物相比，改性烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例8：使用基因编辑技术改进氮利用效率的其他方法
使用诸如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)的基因编辑技术来改性与增强的氮利用率负相关的基因编码区，使该基因编码无功能蛋白或低功能蛋白。这些基因编辑技术还用于编辑或替换内源启动子序列，以驱动其在叶或根组织中的同源蛋白质表达，从而改进氮利用效率。例如，将内源性G64360编辑或替换，因此该基因仅在叶组织中表达，在该组织中该基因可起作用以改进植物的氮利用效率。
构建单独的CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1向导RNA以识别并与SEQ ID NOs:9-40中的每一个的启动子序列杂交。将工程化向导RNA和包含选自下组的启动子的供体多核苷酸提供给烟草植物：SEQ ID NOs:17-24，从而允许所选择的启动子替换所选择基因的内源启动子，并根据需要限制对叶或根组织而言内源性的表达。与在相似条件下生长的对照烟草植物相比，经编辑烟草植物表现出增强的氮利用效率。
实施例9：经由随机诱变开发新突变以改进氮利用效率
使用甲磺酸乙酯(EMS)诱变或快中子轰击进行烟草植物的随机诱变。EMS诱变在于化学诱导随机的点突变。快中子诱变在于将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂引起大的缺失。
对于EMS诱变，将1克(约10,000粒种子)白肋烟(品种TN90)种子在0.1％Tween中洗涤15分钟，然后在30mL ddH2O中浸泡2小时。然后，将150μL的0.5％EMS(Sigma，目录号M-0880)混合到种子/ddH2O溶液中并在室温下(RT；约20℃)在罩下孵育8-12小时(以30RPM旋转)。然后，除去种子中的液体，并将其混合到1M NaOH中过夜以进行净化和清除。然后，用100mL ddH2O洗涤种子两次，持续2-4小时。然后，将洗过的种子悬浮于0.1％琼脂溶液中。
将琼脂溶液中的EMS处理的种子以～2000粒/板均匀地涂布在水浸泡的平板中的Carolina's Choice Tobacco Mix(Carolina Soil Company,Kinston,NC)上。然后，用保鲜膜覆盖平板并将其置于生长室中。一旦幼苗从土壤中出来，就会刺破保鲜膜以使湿度逐渐下降。两周后，完全除去保鲜膜。将平板移至温室并用NPK肥料施肥。将幼苗重新插入浮盘中并生长直至移栽大小。随后将植物移植到田地中。在生长期间，植物自花授粉形成M1种子。在成熟阶段，从每株植物收获五粒荚，并对来自每株植物的一组种子单独命名。这形成了M1群体。生长来自每种M0植物的M1种子的复合物，并如实施例4所述表型评估植物的增强的氮效率。选择表现出增强的氮效率的M1植物，并使用本领域已知的DNA测序和基因映射技术筛选突变。
实施例10：使用育种产生具有增强的氮利用效率的烟草植物
传统育种技术可用于将本文提供的NUE有利的等位基因引入任何烟草品种以增强NUE。可以通过将具有至少一个有利的NUE等位基因(见表10)的烟草植物与缺乏该有利的等位基因的烟草植物杂交来产生烟草植物群体。标志物辅助选择或本领域已知的其他技术(例如直接测序)可用于追踪F1代中有利的等位基因的基因渗入，并可用于测定后续代中的杂合性或纯合性。可以使用本领域已知的或上述方法测定后代植物的增强的NUE。可以将多个不同的NUE有利的等位基因组合到单个品系中。由代谢物特征测定的分子表型可用于追踪育种过程中增强的NUE。可以使用上述方法测定后代植物的代谢物特征。使具有增强的NUE的亲本植物的具有代谢特征的后代植物杂交以产生具有增强的NUE的烟草植物的后续群体。
可以如所述进行将Maryland609基因座引入可商购白肋烟品种中以开发具有增强的NUE的白肋烟品系。对23个白肋烟和6个MD609品系的筛选鉴定了3个在SNP标志物S451(SEQ ID NO:58)上包含MD609等位基因的白肋烟品系(图3)。测试了三个带有MD609等位基因的白肋烟品系在氮限制条件下的叶绿素损失、生长和产量，并与对照TN90白肋烟品系和对照MD609品系(在SNP标志物S451上带有MD609等位基因的MD609)比较(图4)。带有MD609等位基因的白肋烟品系显示出与马里兰烟对照更为相似(图4)的叶绿素损失、生长和产量。与MD609对照相比，TN90白肋烟对照显示出叶绿素损失增加、生长减少和产量降低(图4)。这些结果表明在SNP标志物S451处引入MD609等位基因可以增强NUE。
为了将MD609等位基因引入白肋烟，将MD609与白肋烟杂交。选择来自该杂交的F1后代，随后自交以生产F2种子。使F2和F3植物生长并自交以产生F4种子。在田间生长和收获来自分别鉴定为NUE-2和NUE-3品系的两个独立杂交方案的胀大的F4种子。对于NUE-2和NUE-3品系的F4种子，测定了SNP标志物S451、S317、S12385、S238、S3894和S2237的基因型(参见表13)。使用实施例1中所述的减少的氮生产方法来种植F4植物。与白肋烟对照TN90相比，NUE-2和NUE-3品系均表现出以磅/英亩表示的增加的产量(参见图6)。
或者，可以使用本文所述的方法产生包含增强的NUE表型的改性烟草植物，并将其与未改性烟草植物杂交以在后续代中繁殖改性。可以使用本领域已知的适当技术来追踪基因改性的选择。可以使用本领域已知的或上述方法测定后代植物的增强的NUE。
表13：来自F4 NUE-2和NUE-3品系和TN90的田间生长植物的基因型。MD代表MD609等位基因，白肋烟代表白肋烟等位基因，HET代表杂合MD609/白肋烟。
