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乳酸菌胞外多糖的分离及其应用

2021-02-25 17:53:42

乳酸菌胞外多糖的分离及其应用

　　技术领域

　　本发明属于食品加工领域，涉及一株乳酸菌产胞外多糖的分离提取及其在食品、保健品及宠物食品等领域的应用，尤其涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的具有产黏、抗氧化、抗菌、乳化、絮凝等功能的胞外多糖。

　　背景技术

　　乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的通称，是典型革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢、大多数不运动、兼性厌氧或厌氧的球状或棒状菌。乳酸菌在发酵过程中会产生胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，是指乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的黏液多糖或荚膜多糖的总称。乳酸菌菌种不同其胞外多糖的产量、结构和功能性质明显不同，研究不同乳酸菌的产量及其功能结构，对于丰富乳酸菌胞外多糖的相关信息具有重要意义。

　　乳酸菌胞外多糖是一种活性高分子化合物。不仅具有改善酸乳流变特性，增加酸乳粘度、提高酸乳稳定性、提高产品的乳化性能、絮凝性等性质，对人体还具有抗氧化、抗菌、免疫调节、抗肿瘤和降低胆固醇等生理作用，使其成为食品科学、天然药物及保健品等领域的研究热点之一。

　　因此，从高产胞外多糖的菌株中分离提取保外多糖，研究其功能特性及生理功能，对于改善食品品质，开发功能性发酵制品，扩展胞外多糖在食品和制药方面的利用具有重要意义。

　　专利号200810023012.0的发明《具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02及其制备方法、用途》公开了一种具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02，来源于新疆酸马奶；其具有耐酸特性、耐胆盐特性(抗胆汁能力)，抗氧化特性，对大肠杆菌、沙门氏菌均具有抑制能力；有较强的破坏内毒素能力，保护酒精肝损伤特性。

　　申请号2019107886764的发明《一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用》公开了一种嗜热链球菌DMST-H2，其分离于内蒙古家庭自制酸奶；最优条件下活菌数可达4.2×109CFU/mL，该菌株具有耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液的能力，同时具有突出的抗氧化能力，尤其是DPPH清除能力。

　　上述专利主要把嗜热链球菌作为益生菌，侧重于菌株的抗氧化、护肝、抗菌、耐酸、耐胆盐等益生特性。

　　发明内容

　　本发明要解决的问题是提供一株具有高产胞外多糖性能的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilus ZJUIDS-2-01)及其所产生的胞外多糖和应用。

　　为了解决上述技术问题，本发明提供一种高产胞外多糖的乳酸菌ZJUIDS-2-01，为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，保藏号为CGMCC NO.17210。

　　本发明还同时提供了一种胞外多糖：利用嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ZJUIDS-2-01对脱脂酸乳进行发酵培养后而得。

　　即，脱脂酸乳通过等电点法除酪蛋白，酶解后，用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于超纯水后再用超纯水透析，干燥，即获得所述胞外多糖。

　　本发明还同时提供了上述胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

　　1)、制备脱脂酸乳：

　　将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ZJUIDS-2-01按照2～5％(体积％)的接种量接种至浓度为10～12g/100ml的灭菌脱脂乳中，于37～45℃发酵培养至滴定酸度>70°T(培养时间约为4.0～6.0h)；

　　置于(4±1)℃冷藏24～48h，得到脱脂酸乳；

　　2)、胞外多糖的提取，依次进行以下步骤：

　　2.1)、等电点法除酪蛋白：

　　将脱脂酸乳调pH至(8.0±0.2)，离心，离心所得的上清液调pH至(4.6±0.2)，离心，取上清液；

　　2.2)、酶解：

　　调节2.1)所得的上清液pH至(7.5±0.2)，加入胰酶于(40±5)℃酶解(2.5±0.5)h，离心，取上清液；

　　2.3)、三氯乙酸法除蛋白：

　　向2.2)所得的上清液中加入三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为9～11g/100ml，从而使蛋白质变性，(4±1)℃沉淀(1±0.2)h后，离心，收集上清液；

　　2.4)乙醇沉淀：

　　向2.3)所得的上清液中加入预冷(4℃)的无水乙醇，调配成乙醇终浓度(体积浓度)为15％～60％(优选45％)的溶液，(4±1)℃沉淀过夜，离心，收集所得的沉淀重溶于超纯水中；

　　2.5)透析：

　　将2.5)所得的沉淀重溶于超纯水后所得的溶液装入透析袋，(4±1)℃超纯水透析(48±4)h；得胞外多糖溶液(位于透析袋内)；

　　2.6)冷冻干燥：

　　将2.5)所得的胞外多糖溶液真空冷冻干燥，得胞外多糖粗提物。

　　作为本发明胞外多糖的制备方法的改进：

　　所述步骤2.2)：

　　加入占2.1)所得的上清液1/9～1/11体积的胰酶液进行酶解，胰酶液的浓度为(3±0.3)g/L，胰酶为(2500±300)U/g；

　　优选：加入占2.1)所得的上清液1/10体积的胰酶液进行酶解，胰酶液的浓度为3g/L，胰酶为2500U/g；

　　所述步骤2.4)：

　　重溶所用的超纯水的体积量＝步骤2.3)所得的上清液的体积量；

　　所述步骤2.5)：

　　透析袋的截留分子量14000Da，透析过程中，每(8±2)h换水一次。

　　所述步骤2.6)：

　　真空冷冻干燥时间为44～50h。

　　本发明还同时提供了上述胞外多糖的用途：作为食品添加剂或可食性食用膜。所述食品添加剂包括增稠剂、稳定剂。

　　本发明还同时提供了一种发酵剂(嗜热链球菌工作发酵剂)：所述发酵剂活性成分含有或仅为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus ZJUIDS-2-01)。

　　本发明还同时提供上述高产胞外多糖的乳酸菌ZJUIDS-2-01、或上述发酵剂的用途：用于发酵食品。所述食品包括乳品、肉品、保健品、宠物食品。

　　作为本发明用途的改进：以脱脂乳为原料制备脱脂酸乳；所述脱脂酸乳高含胞外多糖。

　　该脱脂酸乳质地粘稠，低脂，风味丰富的特点，适用于糖尿病患者、肥胖患者。

　　本发明菌株的保藏信息如下：

　　将菌株ZJUIDS-2-01进行保藏，保藏名称为嗜热链球菌Streptococcusthermophilus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.17210，保藏时间2019年01月17日。

　　本发明所提供的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilusZJUIDS-2-01)筛选自中国云南地区的传统乳制品乳扇，挑取具有拉丝倾向的乳酸菌菌落，纯化培养；通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合API50CH鉴定试剂条(法国梅里埃)和16S rDNA测序等对该菌进行了鉴定。

　　本发明所提供的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilusZJUIDS-2-01)的菌落形态学特征为：在M17琼脂培养基上形成明显的菌落，直径在0.1-0.2mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，表面湿润光滑。其菌体形态特征为：革兰氏染色呈阳性，球形，不生芽孢，成对或成链状。

　　实际使用时，嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilus ZJUIDS-2-01)在M17液体培养基中提前活化培养。

　　本发明所提供的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilusZJUIDS-2-01)的16S rDNA全序列为SEQ ID No.1所示。

　　本发明所提供的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilusZJUIDS-2-01)发酵性能优良，发酵酸乳黏度在5700-6600mPa﹒s，其能够高产胞外多糖，其含量范围达407-564mg/L，显著高于其他乳酸菌。

　　本发明通过15％～60％(优选45％)的乙醇沉淀可以提取到高含量粗多糖，经过凝胶纯化可以纯化中性多糖及酸性多糖。

　　本发明提供胞外多糖的抗氧化性能测定，其中粗多糖的抗氧化活性为40～45％。

　　本发明提供胞外多糖的抗菌活性测定，中性多糖具有较好的抗单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的活性。

　　本发明提供胞外多糖的乳化性能测定，其中中性多糖对橄榄油的乳化活性为40～45％；酸性多糖对花生油乳化作用58～62％。

　　本发明提供胞外多糖的絮凝性能测定，其中粗多糖的絮凝活性89～92％；酸性多糖絮凝活性91～93％。

　　本发明的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01(Streptococcus thermophilus ZJUIDS-2-01)的菌粉活菌数高。

　　附图说明

　　下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

　　图1为嗜热链球菌ZJUIDS-2-01的菌落形态图。

　　图2为嗜热链球菌ZJUIDS-2-01革兰氏染色的菌体形态图。

　　图3为嗜热链球菌ZJUIDS-2-01的16S rDNA的电泳鉴定图。

　　图4为胞外多糖的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱洗脱曲线。

　　图5为不同多糖组分的DPPH自由基清除能力对比图。

　　图6为不同多糖组分的抑菌活性对比图。

　　图7为不同多糖组分的乳化作用对比图。

　　图8为不同多糖组分的絮凝活性对比图。

　　具体实施方式

　　下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

　　下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　M17固体培养基：大豆胨5.0g/L，聚蛋白胨2.5g/L，酪蛋白胨2.5g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉浸粉5.0g/L，乳糖5.0g/L，抗坏血酸钠0.5g/L，β-甘油磷酸钠19.0g/L，硫酸镁0.25g/L，琼脂12.75g/L，蒸馏水1000ml；调节pH至7.2±0.2。

　　M17液体培养基：取消“琼脂12.75g/L”，其余同M17固体培养基。

　　灭菌脱脂牛乳；脱脂乳粉以12％(w/v，即，12g/100ml)比例溶于蒸馏水中，55℃加热平衡，115℃保持10min灭菌。

　　本发明中冷冻干燥均为：真空度100pa，温度-60℃。

　　实施例1、ZJUIDS-2-01的鉴定：

　　1.嗜热链球菌ZJUIDS-2-01的分离鉴定

　　1.1样品来源

　　样品采自于5份云南地区农户自制的乳扇样品。

　　1.2菌株的分离纯化

　　以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml无菌生理盐水的锥形瓶中(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分震荡摇匀，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取适宜稀释度的样品稀释液，涂布于M17固体培养基上，置于43℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50-150个单菌落的平板，挑取具有粘性的菌落，在M17琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到M17液体培养基进行增菌培养(于43℃培养48h)，所得的菌液(0.4ml)加入至含60％甘油0.8ml的冻存管，于-80℃冷冻保存。

　　2.嗜热链球菌ZJUIDS-2-01的鉴定

　　2.1菌落特征

　　将上述步骤所得的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01在M17琼脂培养基培养48h后，呈现圆形，直径在0.1-0.2mm之间，白色，边缘整齐的湿润菌落，见图1。

　　2.2显微镜下形态

　　嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状，见图2。

　　2.3 16S rDNA鉴定

　　用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。将PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO：1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与嗜热链球菌的16S rDNA序列同源性超过99％。

　　将菌株ZJUIDS-2-01的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌ZJUIDS-2-01为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

　　实验1、ZJUIDS-2-01制备脱脂酸乳的黏度

　　1.脱脂酸乳的制备

　　将保藏于-80℃的冷冻甘油管中的乳酸菌ZJUIDS-2-01，按2％(v/v)比例接种到M17液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，制备种子液。

　　将活化后的种子液继续按2％(v/v)比例接种于12％(w/v)的灭菌脱脂乳中，43℃静置培养，以滴定酸度>70°T为发酵终点，置于4℃冷藏24～48h，得到脱脂酸乳(不需要添加增稠剂的酸乳)。

　　2.酸乳粘度的测定

　　采用流变仪(博勒飞公司DV2T型)，在4℃下测试粘度，转子型号为64，分别在50r/min的速度下测定三次，选取第20s的数据为测量值，每个样品做三个平行试样，结果取算数平均值。

　　实验测得嗜热链球菌ZJUIDS-2-01发酵酸乳的粘度为6143mPa﹒s。显著高于其他菌株和商业发酵剂。

　　表1冷藏期间的不同菌株黏度变化

　　注：标有ABC表示纵向比较，标有abc表示横向比较。

　　说明：编号1～3为发明过程中获取的其余3个菌株，其也均为来自我国传统发酵食品中的嗜热链球菌，安全可靠，具有产黏、产胞外多糖等条件。

　　商业菌株为购自科汉森公司的发酵剂中的嗜热链球菌菌株。

　　实验2、ZJUIDS-2-01的胞外多糖的制备及含量测定

　　1.脱脂酸乳的制备

　　同实验1的“1.脱脂酸乳的制备”。

　　2.胞外多糖的提取

　　(1)等电点法除酪蛋白：取发酵乳样品(脱脂酸乳)50g，用饱和氢氧化钠溶液调pH至8.0,4000g/min，离心20min，离心所得的上清液用HCl溶液(质量浓度为18％HCl溶液)调pH至4.6，然后4000g/min，离心20min，取上清液；

　　(2)酶解：用饱和氢氧化钠溶液调节步骤(1)上清液pH至7.5，加入1/10体积的胰酶液(浓度为3g/L，现配现用，胰酶为2500U/g)，40℃水浴，酶解2.5h后，4000g/min，离心30min，取上清液；

　　(3)三氯乙酸法除蛋白：向步骤(2)所得的上清液中加入80％(w/v)的三氯乙酸溶液至三氯乙酸终浓度为10％(w/v，即，100ml中含有三氯乙酸10g)，使蛋白质变性，4℃沉淀1h后，12000g/min，离心40min，收集上清液；

　　(4)乙醇沉淀：向步骤(3)所得的上清液中加入预冷(4℃)的无水乙醇，调配成乙醇终浓度(体积浓度)为45％的溶液，4℃沉淀过夜(10～12h)，12000g/min，离心40min，收集沉淀，重溶于超纯水中；

　　重溶所用的超纯水的体积量＝步骤(3)所得的上清液的体积量；

　　(5)透析：将步骤(4)所得的溶液装入透析袋(截留分子量14000Da)，4℃超纯水透析48h，每8h换水；得胞外多糖溶液(位于透析袋内)；

　　(6)将步骤(5)所得的胞外多糖溶液真空冷冻干燥48h，得胞外多糖粗提物(EPS-1，以下简称粗多糖)。

　　说明：将上述步骤(4)中乙醇终浓度由45％分别改成15％，30％，和60％；其余同上。不同乙醇浓度下胞外多糖的提取率如下表2。

　　表2不同乙醇浓度下胞外多糖的提取率

　　根据表2的结果，溶液中乙醇浓度为45％时提取效果性价比最高。

　　所述胞外多糖提取率＝提取出的胞外多糖/脱脂酸乳中总胞外多糖的重量比。

　　3.多糖含量测定

　　采用苯酚-浓硫酸法测定粗提物中胞外多糖含量，用葡萄糖做标准曲线。

　　取适量分析纯葡萄糖置于鼓风干燥箱中80℃干燥2h，冷却后精确称取4mg葡萄糖于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配制成葡萄糖标准溶液(40μg/ml)。分别准确吸取葡萄糖标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80ml，加水定容至2ml，作为不同浓度的葡萄糖溶液。

　　将葡萄糖溶液置于具塞刻度试管中，再加入6％(v/v)苯酚溶液1ml，混匀后静置2min，迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度为98％H2SO4溶液)，混匀静置10min后30℃水浴加热15min，取出，置于冷水中冷却，以空白溶液为对照，测定490nm波长处的吸光度，每组做3个平行。以葡萄糖含量(mg/L)为横坐标，吸光度值(A490)为纵坐标绘制标准曲线(表3)。

　　表3苯酚硫酸法标准曲线绘制

　　标准曲线为y＝0.0087x+0.0622，R2＝0.9987。

　　将上述步骤2所得的胞外多糖粗提物1mg溶解于5ml水中，所得的胞外多糖溶液作为样品备用液。取样品备用液2ml替代上文中的葡萄糖溶液2ml，按照上述方法测定吸光度值(A490)，带入上述计算公式中，得2ml样品液中共有0.196mg胞外多糖。然后按照换成5ml样品液中共有，得0.49mg胞外多糖，粗提物中胞外多糖含量约为49％。

　　按上述方法测得胞外多糖含量测定结果见下表4，实验测得嗜热链球菌ZJUIDS-2-01发酵并冷藏48小时后胞外多糖产量为481mg/L，显著高于其他菌株和商业菌株。

　　表4冷藏期间胞外多糖含量变化

　　注：标有ABC表示纵向比较，标有abc表示横向比较，P<0.05。

　　实验3、ZJUIDS-2-01的胞外多糖的纯化及抗氧化活性测定

　　1.多糖的纯化，采用离子交换层析法进行极性分离，将DEAE Sepharose FastFlow离子胶填料(100g)先用0.5mol/mL的盐酸浸泡1h，然后洗去填料中的杂质物，用4-5倍柱体积的蒸馏水洗脱至中性。调整流速为5mL/min，蒸馏水平衡2h。用蒸馏水(约10ml)溶解1g的粗多糖(EPS-1)，加热(约50℃)，斡旋，12 000rpm离心，取上清液上样。调整流速为15mL/min的蒸馏水进行洗脱。先采用三倍柱体积的水洗脱(从而分离出中性多糖EPS-3)，然后分别用均是一倍柱体积的0.2M NaCl、0.5M NaCl、2.0M NaCl进行洗脱，苯酚-硫酸法进行追踪检测，测定酶标仪490nm吸光度，绘制散点图。根据峰形，合并收集峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥得到极性不同的多糖样品。

　　具体为：

　　将三倍柱体积的水对应的洗脱液收集后经透析(3500Da透析袋)、浓缩(60℃旋蒸至近干)、冷冻干燥，得中性多糖(EPS-3)。

　　将0.2M NaCl对应的洗脱液、0.5M NaCl对应的洗脱液、2.0M NaCl对应的洗脱液收集混合后经透析(3500Da透析袋)、浓缩(旋蒸至近干)、冷冻干燥，得酸性多糖(EPS-2)。

　　2、DPPH抗氧化活性测定

　　1)、配置不同浓度胞外多糖溶液和VC溶液：0mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.0mg/mL和10.0mg/mL；

　　胞外多糖分别为：粗多糖(EPS-1)、中性多糖(EPS-3)、酸性多糖(EPS-2)。

　　2)、向1mL DPPH乙醇溶液(0.2mM，4℃避光保存，现配现用)中加入1mL上述样品分别作为实验组；另取1mL DPPH乙醇溶液和1mL蒸馏水作为对照组，1mL乙醇和1mL样品作为空白组；

　　将上述实验组、对照组、空白组均常温下黑暗中静置反应60min；

　　3)收集上清，517nm测定吸光值；

　　4)记录并计算DPPH清除率：

　　其中：Ai为实验组吸光度值；Aj为空白组吸光度值；A0为对照组吸光度值。

　　不同多糖的抗氧化能力见图5，结果表明粗多糖、中性和酸性多糖均具有良好的自由基清除能力，可以应用于保健品及药品。

　　实验4、ZJUIDS-2-01的胞外多糖的抗菌活性测定

　　采用国际通用牛津杯法测定嗜热链球菌ZJUIDS-2-01胞外多糖组分的抑菌活性。EPS-1为粗多糖，EPS-2为酸性多糖，EPS-3为中性多糖。

　　1)指示菌株菌悬液的制备

　　将保存于甘油管中的四个指示菌(S.aureus、E.coli、S.typhimurium、L.monocytogenes)在LB固体培养基上活化2～3次，分别挑取活化后的单菌落于LB液体培养基中，37℃培养18h，离心收集细菌细胞，重悬于生理盐水中，使浓度达到108CFU/mL。

　　2)将配制好的50mg/mL的粗多糖EPS-1、酸性多糖EPS-2、中性多糖EPS-3过滤除菌(过0.22μm的滤膜，从而实现除菌)，备用。

　　以浓度为0.005mg/ml的甲硝唑作为对照。

　　3)琼脂扩散法

　　将步骤1)中所制的指示菌菌悬液按1％加入到无菌LB固体培养基(45℃)中，充分混合，定量加入15mL/皿。待LB培养基冷凝后，轻轻拔掉事先放置的无菌牛津杯(直径为8.00±0.01mm)。定量以200μL/孔加入步骤2)中所制得的多糖样品，以0.005mg/mL的甲硝唑溶液为阳性对照。将操作完成的平板置于37℃，培养24h。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

　　所得结果如图6和表5所示。

　　表5胞外多糖组分的抑菌活性

　　结果表明EPS-3中性多糖对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌具有较好的抑菌活性。

　　G+：革兰氏阳性菌；G-：革兰氏阴性菌。

　　实验5、ZJUIDS-2-01的胞外多糖的乳化能力测定

　　根据标准方法测定胞外多糖乳化特性。EPS-1为粗多糖，EPS-2为酸性多糖，EPS-3为中性多糖。

　　在10mL螺口玻璃管中(100mm×13mm)加入2mL胞外多糖溶液(质量浓度为0.1％)或黄原胶溶液(0.1％，w/v)和3mL食用油(花生油、橄榄油、菜籽油和葵花籽油)，高速旋涡2min，室温静置24h、168h后测定乳化指数(E24/E168)，公式如下：

　　其中：E24为静置24h后的乳化指数，he24为静置24h后的乳化层高度；E168为静置168h后的乳化指数，he168为静置168h后的乳化层高度；ht为试管内液体总高度。以同浓度的黄原胶作为对照，测定胞外多糖对不同种类食用油的乳化效果。

　　所得结果如图7所述。

　　图7的结果表明多糖对各种油均有良好的乳化性，其中酸性多糖乳化效果效果最好。

　　实验6、ZJUIDS-2-01的胞外多糖的絮凝能力测定

　　根据标准方法测定胞外多糖乳化特性。EPS-1为粗多糖，EPS-2为酸性多糖，EPS-3为中性多糖。

　　取0.1mL胞外多糖水溶液(0.2～1.0mg/mL)与8mL活性炭悬浊液混合(6mg/mL，Ph7.0)，加入0.5mL CaCl2溶液(7.0mM，pH 7.0)，漩涡震荡2min后，室温静置10min。取1mL上清液在550nm处测定吸光度；

　　以0.1mL蒸馏水替代上述胞外多糖水溶液，为空白对照；

　　以0.1mL黄原胶溶液(0.2～1.0mg/mL)替代上述胞外多糖水溶液，为阳性对照。

　　公式如下：

　　其中，B为空白对照吸光度值，A为样品吸光度值。

　　所得结果如图8所示。

　　图8显示不同的多糖具有一定的絮凝活性，其中酸洗多糖的絮凝效果最好，可用于食品及污水处理等领域。

　　实验7、利用ZJUIDS-2-01制备高活性菌粉

　　1.嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌泥的制备

　　挑取嗜热链球菌ZJUIDS-2-01单菌落接种于50mL M17液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再次按5％(体积％)的接种量于250mL M17液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次。即可得到嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌泥。

　　2.保护剂的制备

　　冻干保护剂含有15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐；余量是作为溶剂的水；上述％为质量％。于110℃灭菌备用。

　　3.嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌粉的制备

　　将上述制备的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌泥按1:5的比例(体积比)与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌粉。最终测得嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌粉中活菌数为1.0×1011CFU/g。

　　实验8、利用嗜热链球菌ZJUIDS-2-01制备发酵果蔬汁

　　一般生产工艺：将果蔬原料清洗干净后切块，采用闪蒸(0.5～1min，121℃)的方法灭酶处理后，将原料打浆成流体，加蔗糖等调味剂再进行均质(15～25MPa，10～15min)，灭菌(90～100℃，10～20min)，冷却至40℃左右，菌液与果蔬原料按照4％的用量比；接入活化好的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌液(107CFU/mL)，在37～43℃条件下恒温发酵16～24h，使其pH值为4.2～4.5，冷却灌装，4～10℃保藏。

　　实验9、利用嗜热链球菌ZJUIDS-2-01制备奶酪

　　以马苏里拉奶酪为例，生产工艺为：选择新鲜无抗原料乳，均质，72～80℃加热灭菌，保持10～15s，按2～5％(v/v)比例，接入活化好的嗜热链球菌ZJUIDS-2-01菌液(107CFU/mL)，发酵30-60min，达到一定酸度后，添加凝乳酶，搅拌均匀后静置35-50min，待凝乳达到一定硬度后，用干酪刀切割成1cm的小方块，静置5-10min，加热使温度在15min内上升至42℃，pH达6.1时，开始排出乳清。将干酪堆叠在干酪槽两侧，10-20min后形成大块状，将凝块切块，每隔10min翻转一次，直到pH达到5.25。将凝块切成小条，加入1.5-2％的食盐，充分混匀。将凝块加热，挤揉拉伸，使中心温度达66℃左右，凝块形成拉丝状的特殊结构。装入模具，4-10℃冷却，脱模。真空包装，在4℃条件下成熟2-4周，即可完成。

　　最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

　　序列表

　　<110> 浙江大学

　　<120> 乳酸菌胞外多糖的分离及其应用

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1385

　　<212> DNA

　　<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)

　　<400> 1

　　ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60