包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物为活性成分的免疫增强剂、免疫治疗抗癌剂和抗癌治疗不良反应缓解剂
技术领域
本发明涉及免疫增强剂和抗癌佐剂组合物，用于减轻抗癌药物的副作用，所述组合物包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分，所述花色素苷-岩藻依聚糖复合物由花色素苷与岩藻依聚糖之间的离子键形成。
背景技术
以战胜癌症为目标，基于多种因素(例如基于下一代测序(NGS)的癌症基因组分析和环境)，针对患者特异的精确医学进行了全球范围内的广泛研究，但癌症疾病仍难以治疗并可能导致死亡，被认为是可怕疾病。即使经抗癌药物治疗，据报道胃癌的复发率为55％、结肠癌为20％-50％、肺癌为20％-50％、子宫癌为5％-20％、乳腺癌为10％-15％(国家癌症中心)。
免疫应答是指用于检查自体和非自体并将非自体移除的细胞反应和体液反应，当免疫力下降时，免疫应答不能发挥其原有的功能，并且最终我们的身体容易被外来物质感染。在癌症的情况下，归因于降低的免疫活性，参与免疫的免疫细胞无法攻击癌细胞，因此癌症无法被去除。
花色素苷(anthocyanin)是主要包含在植物花和果实中的天然色素苷，并在例如黑加仑、蓝莓、腺肋花楸(aronia)、樱桃、黑米、葡萄和红甘蓝的植物中大量含有。高浓度的花色素苷主要见于强的日光紫外线、严寒和高湿度的环境中，因为强烈的日光紫外线会破坏植物细胞核的DNA并影响植物的生命，因此花色素苷作为紫外线吸收剂在被保护植物的表面或中间层产生以进行保护。
已知此类花色素苷易于从天然产物中提取，因而可以大量生产，并且在衰老、免疫应答、糖尿病、细菌感染、神经系统疾病和癌症中具有优异的药理活性。因此，人们对花色素苷的兴趣与日俱增，并且由于全球的健康热潮，含花色素苷的产品的市场规模也在逐步扩大。
花色素苷在作为食物摄入时具有最大效果，但由于在胃肠道中停留时间长、肠壁通透性低、溶解度低、商业化过程中不稳定、或温度、环境氧和光照、消化道中的pH值以及酶或其它营养物质，花色素苷在体内表现出5％或更低的低活性。
因此，需要通过提高花色素苷(从例如腺肋花楸植物中提取的天然产物)的体内稳定性来增强免疫功能，对能够作为有效的抗癌药物的花色素苷进行研究和开发。
发明内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明提供了花色素苷复合物作为免疫增强剂、免疫抗癌剂和抗癌佐剂组合物，用于减轻抗癌剂的副作用，所述复合物通过使岩藻依聚糖(一种天然提取物)与花色素苷进行离子键合来提高稳定性和溶解度。
技术方案
本发明提供了花色素苷-岩藻依聚糖复合物，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
本发明提供了包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的免疫增强剂，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
本发明提供了包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的免疫抗癌药物，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
本发明提供了包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的抗癌保健食品，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
此外，本发明提供了包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的抗癌佐剂，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
有益效果
根据本发明，已经证实花色素苷-岩藻依聚糖复合物(其中岩藻依聚糖(一种具有高生物相容性和生物可降解性的天然提取物)的阴离子与花色素苷的阳离子离子键合)提高了花色素苷在体内即使在酸性条件下的稳定性和溶解度，从而提高肿瘤动物模型的免疫活性，恢复经抗癌药物治疗而减轻的体重，从而延长寿命，因此旨在提供花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为免疫增强剂、免疫抗癌剂和抗癌佐剂组合物，用于减轻抗癌剂的副作用。
附图说明
图1示出了花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)的结构。
图2示出了确认花青素-岩藻依聚糖复合物的吸光度和光学图像的结果。
图3示出了花青素-岩藻依聚糖复合物的DLS结果(左)以及花青素-岩藻依聚糖复合物的扫描电子显微镜分析结果。
图4示出了确认花青素和花青素-岩藻依聚糖复合物中花青素降解程度的差异的结果。
图5示出了确认花青素-岩藻依聚糖复合物的抗癌功效和对正常细胞的杀死率的结果，根据(a)HCT-116、(b)Hep-G2、(c)NIH/3T3和(d)HUVEC中的花青素-岩藻依聚糖含量确认IC50的结果。
图6示出了花青素-岩藻依聚糖复合物的通过免疫因子的分泌来确认免疫诱导水平的结果。
图7示出了在每天口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(腺肋花楸生物活性组分，ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)22周后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物是否产生肿瘤的结果。
图8示出了在每天口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)22周后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物中在5周、9周、12周、16周、18周、20周和22周的肿瘤生长抑制作用的结果。
图9示出了在每天口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)22周后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物中在9周、11周、14周、16周、18周和22周的肿瘤生长抑制作用的结果。
图10示出了在口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物的体重和存活率的结果。
图11示出了在口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物中的肿瘤面积和肿瘤确定数(结节计数)的增加率的结果。
图12示出了在口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物的主要器官心、肺、肝、肾和脾的苏木精和伊红染色组织的结果。
图13示出了在口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物的苏木精和伊红染色肿瘤组织的结果。
图14示出了在口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，确认用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物的血浆中IFN-γ水平的结果。
图15示出了在静脉内注射阿霉素，然后口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，通过癌细胞移植确认肿瘤诱导实验动物的肿瘤生长抑制作用的结果。
图16示出了在静脉内注射阿霉素，然后口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)后，通过癌细胞移植的肿瘤诱导实验动物的肿瘤生长抑制作用(A)、体重变化(B)和存活率(C)。
图17示出了在实验第1天和第5天在小鼠动物模型中静脉注射阿霉素(共2次)，然后口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)14天后，在实验第5天和第14天确认血液中CD8+T细胞和NK细胞水平的结果。
图18示出了在实验第1天和第5天在小鼠动物模型中静脉注射阿霉素(共2次)，然后口服给予PBS、岩藻依聚糖(Fu)、腺肋花楸提取物(ABF)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)14天并在实验最后一天第14天提取动物模型的脾后，确认小鼠动物模型中脾重量的结果。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明人已证实，可以通过将具有生物相容性的岩藻依聚糖阴离子与花青素(一种源自腺肋花楸的花色素苷)阳离子进行离子键合来产生复合物，以在胃、小肠和血液中在结构上稳定花青素，在与人体相似的条件下提高免疫活性，并作为具有优异生物利用度和生理活性的复合物提供，从而完成本发明。
本发明可提供花色素苷-岩藻依聚糖复合物，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
更具体而言，花色素苷可以是花青素，并且所述花青素可以是从腺肋花楸提取物分离和纯化的花青素-3-葡萄糖苷(C3G)，但不限于此。
本发明的花色素苷是希腊语单词Anthos(意为花)和cyanos(意为蓝色)的组合，花色素苷色素(一种植物化学物质)在浆果的茎、花和果实中产生，以保护自身免受外界刺激。在自然界中约存在600种这类花色素苷，其中，花青素-3-葡萄糖苷(C3G)具有最佳的活性，特别是其抗衰老、抗氧化、抗癌、抗代谢优异。
该复合物能够以花色素苷和岩藻依聚糖的重量比为0.1:10至10:0.1而形成。
该复合物可为平均直径在50nm至500nm范围内的纳米复合物。
本发明可提供包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的免疫增强剂，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
花色素苷-岩藻依聚糖复合物可以诱导免疫因子的表达，以提高免疫细胞的活性。
根据本发明的一个实例，将含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)的腺肋花楸提取物(ABF)溶液、或含有500μg/mL的岩藻依聚糖的岩藻依聚糖溶液、以及含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)和500μg/mL的岩藻依聚糖的花青素-岩藻依聚糖复合物分别处理至HCT-116(人结肠细胞)、SKBR-3(人乳腺癌细胞)和Hep-G2(人肝细胞)。结果，如图6所示，证实了相比用腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖单独处理时，用花青素-岩藻依聚糖复合物处理时IL-6分泌更高，并且在用腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖处理的细胞中，经花青素-岩藻依聚糖复合物处理的细胞分泌的IL-6的量高于经腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖处理的细胞分泌的IL-6的量之和。
该结果证实了，花青素-岩藻依聚糖复合物能够在体内诱导免疫因子的表达，从而提高免疫细胞的活性。
因此，本发明可提供包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的免疫抗癌药物，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
花色素苷-岩藻依聚糖复合物能够诱导免疫因子的表达，以增加免疫细胞的活性并杀死癌细胞。
癌细胞可以是实体癌的癌细胞，更具体而言，实体癌可以选自于由结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、上皮性卵巢癌、脑癌、皮肤癌和肝癌所组成的组，但不限于此。
根据本发明的另一实例，为了证实具有花色素苷的复合物针对癌细胞的抗癌作用和对正常组织细胞的毒性，使用含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)的腺肋花楸提取物(ABF)溶液、或含有200μg/mL的岩藻依聚糖的岩藻依聚糖溶液、以及含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)和200μg/mL的岩藻依聚糖的花青素-岩藻依聚糖复合物通过连续稀释法从初始浓度稀释1/2来制备各8个样品，并将它们分别处理至HCT-116(人结肠细胞)、NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)、HUVEC(内皮细胞；ATCC)和Hep-G2(人肝细胞)以确认样品的癌细胞杀死水平，如图5所示，已证实腺肋花楸提取物(ABF)溶液对HCT-116和Hep-G2的IC50值分别为27μg/mL和17μg/mL，而花青素-岩藻依聚糖复合物的IC50值分别为12μg/mL和5.2μg/mL。此外，在正常组织细胞NIH/3T3和HUVEC中，关于腺肋花楸提取物(ABF)溶液的IC50值分别为41μg/mL和53μg/mL，而关于花青素-岩藻依聚糖复合物的IC50值分别为38μg/mL和38μg/mL。
由以上结果可知，由于花青素-岩藻依聚糖复合物对癌细胞的IC50值低于腺肋花楸提取物(ABF)溶液对癌细胞的IC50值，证实了花青素-岩藻依聚糖复合物比腺肋花楸提取物(ABF)以更小的量有效杀死癌细胞。由于花青素-岩藻依聚糖复合物对正常组织细胞的IC50值高于对癌细胞的IC50值，证实了花青素-岩藻依聚糖复合物能够有效杀死癌细胞而对正常细胞无细胞毒性。
在本发明的一个实施方式中，可根据常规方法，将用于预防或治疗癌症疾病的包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的药物组合物作为选自于由如下所组成的组的任一种制剂使用：注射剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、凝胶剂、混悬剂、乳剂、滴剂或液体剂。
在本发明的另一实施方式中，用于预防或治疗癌症疾病的包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的药物组合物可进一步包含选自于由如下所组成的组的一种或多种适当添加剂：载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、增滑剂、调味剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，所述添加剂常用于制造药物组合物。
具体而言，载体、赋形剂或稀释剂包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。用于口服给予的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂可通过在组合物中混入至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)来制备。此外，除了简单的赋形剂以外，还使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。口服液体制剂包括混悬剂、口服溶液剂、乳剂和糖浆剂，并且除了常用的简单稀释剂(例如水和液体石蜡)以外，可以包含各种赋形剂(例如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等)。用于肠外给予的制剂包括无菌水性溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂。作为非水性溶剂和混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。
根据本发明的一个实例，可通过静脉内途径、动脉内途径、腹腔内途径、肌内途径、腹腔内途径、胸骨内途径、经皮途径、鼻内途径、吸入途径、局部途径、直肠途径、口服途径、眼内途径或皮内途径，以常规方式向受试者给予药物组合物。
花色素苷-岩藻依聚糖复合物的优选剂量可根据受试者的状况和重量、疾病的类型和程度、药物形式、给药途径和持续时间而变化，并且可由本领域技术人员适当地选择。根据本发明的一个实例，日剂量可为0.01mg/kg至200mg/kg、具体地为0.1mg/kg至200mg/kg、更具体地为0.1mg/kg至100mg/kg，但不限于此。给药可以一天给予一次，也可以分为若干次给药，并且本发明的范围不限于此。
在本发明中，“受试者”可为哺乳动物，包括人，但不限于这些实例。
此外，本发明可提供包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的抗癌保健食品，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
上述保健食品可与花色素苷-岩藻依聚糖复合物以外的其它食品或食品添加剂一起使用，并可按常规方法适当地使用。活性成分的混合量可根据其使用目的(例如预防、保健或治疗处理)适当地确定。
保健功能食品中所含化合物的有效剂量可根据治疗剂的有效剂量使用。但是，在为了保健和卫生或健康控制的目的而长期摄入的情况下，可在上述范围或更低的范围内使用，并且明显的是，因为在安全性方面没有问题，活性成分能够以至少上述范围的量使用。
关于保健功能食品的种类没有特别的限制。保健功能食品的实例包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糖果糕点(confectionery)、披萨、拉面、其它面条、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料以及维生素复合物等。
此外，本发明可提供包含花色素苷-岩藻依聚糖复合物作为活性成分的抗癌佐剂，所述复合物包含由花色素苷和岩藻依聚糖组成的复合物，其中，花色素苷的溶液的阳离子与岩藻依聚糖的溶液的阴离子之间形成离子键，并且花色素苷分子之间形成π-π键。
抗癌佐剂可减轻由抗癌剂的给予引起的副作用，并且由抗癌剂的给予引起的副作用可选自于由体重减轻、免疫因子降低和恶病质所组成的组。
实施例
在下文中，将详细描述本发明的实施例以理解本发明。然而，本发明能够以许多不同的形式来实施，并不应限于本文阐述的实施方式，以便为本发明所属领域的技术人员清楚地说明本发明。
<实施例1>花青素-岩藻依聚糖复合物的制备
将20mg的腺肋花楸提取物(ABF)[JBK Lab.]溶解于20mL磷酸盐缓冲液pH3(PB 3)的水性溶液中，以致没有可见的沉淀，并将200mg岩藻依聚糖(Haewon Biotech)溶解于20mL蒸馏水中，以致没有可见的沉淀，然后向岩藻依聚糖溶液中添加花青素溶液并在室温下搅拌72小时，以制备花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)。
另一方面，将腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖以用于制备复合物相同的量溶解，并用作对比例。
<实施例2>花青素-岩藻依聚糖复合物性质的确认
1.花青素-岩藻依聚糖复合物形成的确认
从第1天到第6天，获得腺肋花楸提取物(ABF)溶液和花青素-岩藻依聚糖复合物的样品，将样品稀释至1/10后，用分光光度计(UV-1601，Shimadzu，日本)测量光密度。此外，用腺肋花楸提取物(ABF)溶液和花青素-岩藻依聚糖复合物原液获得光学照片。
结果，如图2所示，花青素-岩藻依聚糖复合物是由花青素的阳离子性质和岩藻依聚糖的阴离子性质形成的离子键而形成的，并且还发现花青素分子之间的π-π相互作用也有助于复合物的形成。此外，如图2所示，证实了花青素-岩藻依聚糖形成复合物时，通过π-π相互作用所具有的花青素的最大吸光度发生红移，并且从光学照片上证实，相比腺肋花楸提取物(ABF)溶液，形成复合物的样品具有紫色。
2.花青素-岩藻依聚糖复合物尺寸的确定
将2mL已完成的复合物放入聚苯乙烯比色皿(DTS0012)中后，使用ζ电位和纳米颗粒尺寸分析仪(Zetasizer nano ZS，Malvern Instruments Ltd.，英格兰)确认复合物的尺寸。此外，将10μL的已完成的复合物置于盖玻片上，并在60℃的烘箱中干燥过夜，以使用扫描电子显微镜(S-4800，HITACHI,Ltd.，U.S.A)获得图像。
参考图3左侧的照片(ζ电位和纳米颗粒尺寸分析仪分析的结果)，确认该复合物的纳米尺寸为约380nm。此外，扫描电子显微镜图像(图3右侧的图)的尺寸确认为约85nm。
3.不同pH条件下花青素的结构稳定性改善效果的确定
将通过制备花青素-岩藻依聚糖复合物的方法获得的40mL复合物以13000rpm离心30分钟后，去除上清液，将剩余的沉淀用PB 3(pH 3)和磷酸盐缓冲液(pH 7)重新分散，并且通过用分光光度计随时间测量花色素苷溶液来确认提高结构稳定性的效果。
结果，如图4所示，腺肋花楸提取物(ABF)在低pH环境(pH 3)中稳定，并且随pH的增加发生分解。
更详细而言，如果腺肋花楸提取物(ABF)在人体内处理，它将暴露于人体的pH7.4，并最终可期望分解；而确实如图4所示，花色素苷随时间而分解；但是已经证实，花青素-岩藻依聚糖复合物一定程度上随时间推移而保持吸光度值。
以上结果证实，花青素-岩藻依聚糖复合物即使在体内酸性条件下也展现出优异的稳定性。
<实施例3>花青素-岩藻依聚糖复合物的体外细胞毒性和细胞因子分泌的确认
1.花青素-岩藻依聚糖纳米颗粒的体外细胞毒性的确认
证实了花青素和岩藻依聚糖的复合物针对癌细胞的抗癌作用以及对正常组织细胞的毒性。
首先，制备了含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)的腺肋花楸提取物(ABF)溶液、或含有200μg/mL的岩藻依聚糖的岩藻依聚糖溶液、以及含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)和200μg/mL的岩藻依聚糖的花青素-岩藻依聚糖复合物样品，剩余样品的每8个样品用连续稀释法从上述初始浓度稀释至1/2。
将实验细胞HCT-116(人结肠细胞癌；韩国细胞系库)和HUVEC(内皮细胞；ATCC)分别在含有青霉素、链霉素和10％FBS的RPMI 1640(Wellgene)培养基中培养，将Hep-G2(人肝细胞癌；韩国细胞系库)和NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞；韩国细胞系库)在含有青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。
在24孔板上以每孔5×104个细胞接种细胞系并培养过夜。此后，将细胞与DMEM和FBS未添加的RPMI以及各种浓度的样品在37℃下孵育24小时，然后暴露于添加FBS的DMEM、RPMI培养基以及10％细胞计数试剂盒8(CCK-8)溶液(CCK-8试剂盒，Enzo Life Sciences,Inc.，韩国)中，并在37℃下孵育4小时，以在450nm的光密度下确认细胞毒性。
结果，如图5所示，HCT-116和Hep-G2的关于腺肋花楸提取物(ABF)溶液的IC50值分别为27μg/mL和17μg/mL，而关于花青素-岩藻依聚糖复合物的IC50值经证实为12μg/mL和5.2μg/mL。此外，在正常组织细胞NIH/3T3和HUVEC中，关于腺肋花楸提取物(ABF)溶液的IC50值分别为41μg/mL和53μg/mL，而关于花青素-岩藻依聚糖复合物的IC50值为38μg/mL和38μg/mL。
以上结果证实，花青素-岩藻依聚糖复合物对癌细胞的IC50值低于腺肋花楸提取物(ABF)溶液对癌细胞的IC50值，该复合物以比单独的腺肋花楸提取物(ABF)溶液更小的量有效地杀死癌细胞。此外，证实了花青素-岩藻依聚糖复合物对正常组织细胞的IC50值高于对癌细胞的IC50值，花青素-岩藻依聚糖复合物比单独使用腺肋花楸提取物(ABF)溶液时具有更高的抗癌效果，并且对正常组织细胞的细胞毒性低。
2.从花青素-岩藻依聚糖纳米颗粒所杀死的细胞分泌的细胞因子的确认
制备了含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)的腺肋花楸提取物(ABF)溶液、或含有500μg/mL的岩藻依聚糖的岩藻依聚糖溶液、以及含有50μg/mL的腺肋花楸提取物(ABF)和500μg/mL的岩藻依聚糖的花青素-岩藻依聚糖复合物的样品。
将实验细胞HCT-116(人结肠细胞癌；韩国细胞系库)和SKBR-3(人乳腺癌细胞；韩国细胞系库)在含有青霉素和链霉素以及10％FBS的RPMI 1640(Wellgene)培养基中培养，将Hep-G2(人肝细胞癌；韩国细胞系库)在含有青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。
将培养在6孔板上的各细胞系以每孔3×105个细胞接种并培养过夜。此后，将细胞在37℃下在含有各种浓度样品的2mL的DMEM和FBS未添加的RPMI培养基中培养24小时，并在回收培养基后，通过ELISA(酶联免疫吸附试验，Enzo Life Sciences，Inc.，韩国)确认IL-6、IL-1β和TNF-α细胞因子水平。
结果，三种细胞系均未分泌IL-1β和TNF-α的细胞因子，如图6所示，相比单独处理腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖时，用花青素-岩藻依聚糖复合物处理时IL-6的分泌更多。此外，证实了从用花青素-岩藻依聚糖复合物处理的细胞分泌的IL-6量高于从单独用腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖处理的细胞分泌的IL-6量之和。
<实施例4>花青素-岩藻依聚糖复合物的肿瘤抑制作用的确认
在用致癌剂和肿瘤促进剂处理的实验动物中，证实了花青素-岩藻依聚糖复合物抑制癌变的作用。
将Balb/c(n＝5)小鼠背部脱毛后，将致癌剂7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)200nmol/丙酮200μL施用于背部，并用肿瘤促进剂12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)4μg/丙酮200μL每周处理2次，共22周。
将实验动物分为PBS、腺肋花楸提取物(腺肋花楸生物活性组分，ABF)、岩藻依聚糖(Fu)和花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)实验组，向各实验组每天适当地口服给予800mg/kg的岩藻依聚糖(Fu)200μL(80mg/mL)、100mg/kg的腺肋花楸提取物200μL(10mg/mL)、以及Fu 800mg/kg和ABF 100mg/kg的Cyaplex-F8(Fu 80mg/mL，ABF 10mg/mL)200μL，连续22周，每周检查1次诱导肿瘤结节的面积和数量、以及重量、存活率。
结果，如图7至图9所示，PBS实验组从第9周开始出现肿瘤结节，该组施以致癌剂、肿瘤促进剂并给予药物，此后肿瘤数量和面积增加，但如图11所示，给予Fu或ABF的实验组证实了抑制癌变作用，特别是Cyaplex-F8实验组具有优异的癌变抑制作用。
此外，在实验最后一周第22周，提取各组每只动物的作为主要器官的心、肺、肝、脾组织，进行苏木精和伊红染色(H&E染色)。
结果，如图12所示，证实了每个实验组的主要器官没有明确的差异，但在如图13所示的背部诱发肿瘤组织的情况下，证实了PBS实验组中以最大的面积诱发肿瘤，而Cyaplex-F8实验组肿瘤诱发面积最小。
另一方面，从给药第11周起，用眼眶采血法从每只实验动物采集200μL血液，然后以13000rpm离心10分钟来分离血浆，用ELISA试剂盒(485-MI-100，R&D Systems,Inc，USA)定量分析血浆中存在的IFN-γ。
结果，如图14所示，证实了从第11周到第22周，所有实验组的体内免疫功能维持体内平衡，无显著差异。
<实施例5>花青素-岩藻依聚糖复合物与抗癌药物的联合给药效果的确认
根据花青素-岩藻依聚糖复合物和抗癌剂的联合给药证实了抗癌作用。
以1×105细胞/小鼠，将SK-BR-3(人乳腺癌)移植至Balb/c(n＝5)小鼠，移植后1周，每周一次静脉给予10mg/kg阿霉素(DOX)，持续2周，除阿霉素给药日外，各实验组分别每天两次口服给予800mg/kg的岩藻依聚糖(Fu)200μL(160mg/mL)、100mg/kg的腺肋花楸提取物(ABF；20mg/mL)200μL、以及Fu 1600mg/kg和ABF 200mg/kg的Cyaplex-F8200μL(Fu160mg/mL，ABF 20mg/mL)，持续2周。
结果，如图15和图16A所示，证实了在单独给予岩藻依聚糖、腺肋花楸提取物(ABF)或花青素-岩藻依聚糖复合物的实验组中，肿瘤尺寸增加，但是在用阿霉素和花青素-岩藻依聚糖复合物Cyaplex-F8联合处理的实验组中，肿瘤尺寸降低到与单独用阿霉素处理的实验组相似的水平。
此外，参考图16B和图16C，在单独用阿霉素处理的实验组中，在第二次静脉给予阿霉素后观察到实验动物体重迅速下降，但在用阿霉素和Cyaplex-F8联合处理的实验组中，发现与单独用阿霉素处理的组相比，体重减轻率小，并且存活寿命比阿霉素处理组延长更长。
此外，如表1所示(第37天的血细胞分析结果)，证实了在单独给予阿霉素的组的情况下白细胞水平为6.57×103细胞/μL，而DOX+Cyaplex-F8联合给予组的白细胞水平增至9.54×103细胞/μL。
[表1]
<实施例6>花青素-岩藻依聚糖复合物的免疫细胞活性作用的确认
如先前实验所证实的，由于发现花青素-岩藻依聚糖复合物增加白细胞水平，因此证实了花青素-岩藻依聚糖复合物对免疫细胞的作用。
在实验的第1天和第5天，用阿霉素(DOX)以每只10mg/kg对Balb/c(n＝5)小鼠进行处理(共2次)，并且除阿霉素处理日外，每天口服给予1600mg/kg的岩藻依聚糖(Fu)(160mg/mL)500μL、200mg/kg的腺肋花楸提取物(ABF)500μL(20mg/mL)、以及Fu 1600mg/kg和ABF200mg/kg的花青素-岩藻依聚糖复合物(Cyaplex-F8)500μL(Fu 160mg/mL，ABF 20mg/mL)。
阿霉素处理前，从所有实验组采集血200μL，用500μL红细胞裂解液处理，4℃反应5分钟，用DPBS稀释10倍，以1500rpm离心3分钟，然后使用抗CD3和抗CD8检测血液中细胞毒性T细胞的水平，并使用抗CD49b(DX5)进行血液中NK细胞的流式细胞术。
此外，在实验的第14天，即实验的最后一天，提取实验动物的脾，以测量脾重量/体重。
结果，如图17所示，在给予阿霉素后，所有实验组的免疫细胞均减少，但相比用腺肋花楸提取物(ABF)和岩藻依聚糖单独处理的实验组，用花青素-岩藻依聚糖复合物处理的实验组展现出更优的免疫细胞(CD8T细胞和NK细胞)恢复能力，并且如图18所示，证实了在用阿霉素和花青素-岩藻依聚糖复合物联合处理的实验组中，减少的体重的恢复最好。
以上结果证实，花青素-岩藻依聚糖复合物通过联合处理恢复由阿霉素处理而减少的重量。
虽然已经参照本发明的具体实施方式对本发明进行了具体描述，但显而易见，该具体描述仅为优选实施方式，并且对于本领域技术人员而言本发明的范围不限于此。也就是说，本发明的实用范围由所附权利要求及其等同物所限定。
