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一种基因芯片及试剂盒

2023-01-21 01:16:39

一种基因芯片及试剂盒

　　技术领域

　　本发明提供了一种基因芯片，特别是包括以两个以上重复靶核酸的串联体作为靶核酸探针的基因芯片。

　　背景技术

　　南美白对虾是重要的经济虾类品种，在沿海地区，其对渔业经济结构调整和渔民增收发挥了重要作用，具有相当大的经济效益和社会效益。然而，有资料显示，相关病害对于渔业产值的影响仅次于台风洪涝等自然灾害。而针对相关病原体，特别是对虾白斑病毒病(white spot syndrome virus，WSSV)、对虾急性肝胰腺坏死病Acute hepatopancreaticnecrosis disease，AHPND)、对虾皮下及造血组织坏死病毒病(Infectious hypodermaland hematopoietic necrosis virus，IHHNV)、对虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)和虾血虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)这五种病原体，是导致许多地区南美白对虾大批量死亡及减产的主要原因。对虾一旦被这些病原体侵入，无法治愈，且这些病原传播能力强，传播速度快，即使养殖环境中存在极微量的病原体，在条件合适的情况下，也可以迅速增殖，造成大量损失。所以如何从源头防止携带这些病原的虾苗进入养殖环境极其关键，这就要求要有准确高效灵敏的检测手段进行检测，对检出携带有病原体的苗种及时处理。因此，建立这五种病原体快速、便捷、经济、高效、灵敏的检测技术对于指导这些病害防控工作具有重要意义。

　　苗种检测往往要求快速，高效，全面，准确。而目前的使用的核酸检测手段远远无法满足这些需求。各种分子检测手段还有很大的局限性：各种病原检测的国家标准方法及行业标准多通过PCR或者巢式PCR进行。然而，采用PCR的方法往往灵敏度较低；采用巢式PCR的方法步骤较为繁琐，检测指标单一且易产生核酸污染。而荧光定量PCR法也同样具有其不足：使用染料法检测无法质控对虾提取步骤，且在指标较多时采用溶解曲线法容易造成误读；使用探针法则检测指标少，对于多数四通道的荧光定量PCR仪而言，无法实现单管检测四种以上病原体。此外，荧光探针和仪器成本较高，不利于大规模推广。由此，市场上亟需要一种产品，可以快速，方便，准确的一次性检测多种对虾病原体。

　　发明内容

　　本发明之一提供了一种基因芯片，其包括基质和至少一种靶核酸探针，所述靶核酸探针固定于所述基质上形成探针阵列，每种靶核酸探针为两个以上重复的所述靶核酸的串联体。

　　在一个具体实施方式中，所述靶核酸具有2个重复，且单个靶核酸重复的长度为12bp至23bp。

　　在一个具体实施方式中，所述基质选自尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和石英玻璃基质中的一种。

　　在一个具体实施方式中，所述基因芯片还包括固定于所述基质上的杂交阳性质控探针和/或DNA阳性质控探针，其中，所述杂交阳性质控探针用于检测杂交过程的有效性，所述DNA阳性探针用于检测杂交之前的过程的有效性。

　　在一个具体实施方式中，所述靶核酸选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5中的至少一种，其中所述SEQ ID No.1用于检测对虾白斑病病毒，所述SEQ ID No.2用于检测对虾急性肝胰腺坏死病，所述SEQ ID No.3用于检测对虾皮下及造血组织坏死病毒，所述SEQ ID No.4用于检测对虾肝肠胞虫，所述SEQ ID No.5用于检测虾血虹彩病毒。

　　在一个具体实施方式中，杂交阳性质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，DNA阳性质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

　　本发明之二提供了一种基因芯片试剂盒，所述试剂盒中包括如权利要求1至7中任意一项所述的基因芯片，以及成对的引物，所述成对的引物用于以待测样品的DNA为模板来扩增含有所述靶核酸的片段，所扩增的能够与所述靶核酸互补配对的单链所用的引物标记有生物素、地高辛和辣根过氧化物酶中的一种。

　　在一个具体实施方式中，所述成对的引物包括SEQ ID No.8/SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10/SEQ ID No.11、SEQ ID No.12/SEQ ID No.13、SEQ ID No.14/SEQ ID No.15、和SEQID No.16/SEQ ID No.17中的至少一对，其中，

　　SEQ ID No.8/SEQ ID No.9用于对虾白斑病病毒；

　　SEQ ID No.10/SEQ ID No.11用于对虾急性肝胰腺坏死病；

　　SEQ ID No.12/SEQ ID No.13用于对虾皮下及造血组织坏死病毒；

　　SEQ ID No.14/SEQ ID No.15用于对虾肝肠胞虫；

　　SEQ ID No.16/SEQ ID No.17用于虾血虹彩病毒。

　　在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括用于扩增能够与DNA阳性质控探针互补配对的片段的成对的DNA阳性质控引物。

　　在一个具体实施方式中所述试剂盒中还包括用于与杂交阳性质控探针互补配对的杂交阳性质控核酸。

　　在一个具体实施方式中，所述成对的DNA阳性质控引物的核酸序列如SEQ IDNo.18和SEQ ID No.19所示。

　　在一个具体实施方式中，所述杂交阳性质控核酸的序列如SEQ ID No.20所示.

　　在本发明中“/”表示为前后两者成对使用，例如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17构成成对的引物。

　　本发明的有益效果：

　　一直以来使用反向点杂交方法的基因芯片灵敏度一直不高，虽然增加探针长度可以有效的增加基因芯片的灵敏度，但是也特别容易产生非特异性信号，因而限制了此类基因芯片技术的发展。本发明利用两个及两个以上核苷酸序列串联的方式制备检测探针，可以有效的提高检测的灵敏度，且合适的串联次数可以规避由于探针长度过长所导致的特异性变差的现象。

　　将该串联探针应用于南美白对虾病原体检测，实现了五种病原体待检测对象同时PCR扩增用于基因芯片的检测，具有非常高的灵敏度和特异性，且使用方便简单快速，三个小时即可完成包括提取扩增在内的所有检测程序.具有相当高的实用价值。

　　附图说明

　　图1显示了探针在芯片上的一种示意性排布图。

　　图2显示了利用本发明的一种探针检测AHPND、WSSV、EHP、IHHNV和SHIV五种病原体的结果。

　　图3显示了探针在芯片上的另一种示意性排布图。

　　图4显示了利用不同的AHPND探针检测AHPND、WSSV、EHP、IHHNV和SHIV五种病原体的结果。

　　具体实施方式

　　下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

　　如无特别说明，以下实施例中使用的试剂均可市售获得。

　　实施例1

　　1.引物，探针设计

　　根据NCBI基因数据库五种病原体的特异性基因序列，参考Primer-BLAST引物，探针设计原则，设计引物和探针。引物长度约为20-23nt。由于本发明PCR反应重数较多，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物及探针，特别是序列重复探针的使用，从中筛选出灵敏度高且特异性好的引物及探针。

　　PC：虾基因组18s rDNA正向引物序列如SEQ ID No.18所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQ ID No.19所示；DNA阳性质控探针(PC)序列如SEQ ID No.7所示。

　　HC：杂交阳性质控核酸序列如SEQ ID NO:20所示，5'端修饰有生物素；杂交阳性质控探针(HC)的序列如SEQ ID No.6所示。

　　AHPND pirB基因正向引物序列如SEQ ID No.10所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQ ID No.11所示；单个重复的探针序列如SEQ ID No.2所示。

　　EHP 18s rDNA正向引物序列如SEQ ID No.14所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQ ID No.15所示。单个重复的探针序列如SEQ ID No.4所示。

　　WSSV vp28基因正向引物序列如SEQ ID No.8所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQ ID No.9所示；单个重复的探针序列如SEQ ID No.1所示。

　　IHHNV特异性CDS(Sequence coding for amino acid sin protein)基因正向引物序列如SEQ ID No.12所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQ ID No.13所示；单个重复的探针序列如SEQ ID No.3所示。

　　SHIV特异性扩增靶标特异性CDS(Sequence coding for amino acid sinprotein)基因正向引物序列如SEQ ID No.16所示，5'端修饰有生物素；反向引物序列如SEQID No.17所示；单个重复的探针序列如SEQ ID No.5所示。

　　引物、探针的单个重复的探针、两个重复的探针以及三个重复的探针由生工生物有限公司合成，探针由英潍捷基生物有限公司合成。

　　2.PCR产物的扩增

　　PCR扩增试剂(10×缓冲液、Taq酶、UNG、dUTP和dNTP)购自大连宝生物生物科技有限公司，购自德国赛多利斯。

　　按下表比例配制反应体系见表1。

　　表1

　　将制得的PCR反应体系震荡混匀后，加入3μL DNA模板进行PCR扩增。其中，各上游引物的用量约是下游引物用量的2倍，以扩增出大量的与探针互补配对的单链，从而省去后续变性的步骤。

　　扩增程序为：

　　50℃2min

　　94℃4min；

　　(94℃30s，53℃30s，72℃10s)，40个循环；

　　(94℃30s，68℃30s，72℃10s)，3个循环；

　　4℃保存。

　　扩增得到的PCR产物不经纯化用于下一步的芯片杂交。

　　3.对虾病原体基因芯片的制备

　　硝酸纤维素膜购自德国赛多利斯。

　　1)将带正电荷的尼龙膜裁剪成膜条；

　　2)将裁剪的膜条放置灭菌蒸馏水中浸泡10min后，悬空晾干；

　　3)将各探针分别溶于探针缓冲液(组分：0.4N NaOH，0.1M EDTA)中，配制成4μM的溶液，得到探针溶液，取2μl探针溶液按顺序地固定于尼龙膜上；

　　4)将点好探针的湿膜在紫外照射5min，取出自然干燥。

　　4.PCR反向点杂交

　　核酸杂交液I、核酸杂交液II、杂交洗涤液、显色液、核酸杂交晶格均来自江苏猎阵生物科技有限公司。微孔板恒温振荡器购自杭州奥盛生物有限公司。

　　1)将核酸杂交液I和核酸杂交液II放置水浴锅中预热至45℃备用，其中核酸杂交液I成分为6×SSC，2.5％脱脂奶粉和1％SDS，杂交液II成分为碱性磷酸酶标记的链酶亲和素溶液；

　　2)提前设置微孔板恒温振荡器温度为45℃，使微孔板恒温振荡器里的温度达到45℃的最适杂交温度；

　　3)用无菌镊子镊取对虾病原体基因检测芯片膜片放入离心管中，加入预热的核酸杂交液I 600μL，备用；

　　4)将第4小节所得的PCR产物加入第5小节所得放有芯片的晶格中，于1500rpm、45℃恒温振荡器里杂交10min；

　　5)杂交完成后，加入1μL预热核酸杂交液II，于1500rpm、45℃恒温振荡器里振荡3min；

　　6)弃晶格中的杂交液，加入2ml预热杂交洗涤液，杂交洗涤液成分为2×SSC，于1500rpm、45℃恒温振荡器里洗涤2min，重复两次；

　　7)弃晶格中的洗涤液，加入500μL预热显色液，显色液成分为BCIP和NBT的预混液，于1500rpm、45℃恒温振荡器里显色3min；

　　8)结果判读：在晶格内直接进行判读，杂交质控探针位，全程质控探针位出现棕色亮斑说明检测有效，对应的探针位出现棕色亮点即为含有对应的病原体。

　　实施例2

　　对虾基因组的获取

　　用来自江苏猎阵生物科技有限公司的动物组织提取试剂盒提取该对虾的基因组，通过现有技术的方法从对虾样本中筛选出没有携带AHPND、WSSV、EHP、IHHNV及SHIV五种病原体的对虾，最终得到没有携带AHPND、WSSV、EHP、IHHNV及SHIV五种病原体对虾基因组溶液。

　　其中，检测AHPND病原体的方法为OIE推荐方法(Sirintip Dangtipa,RatchanokSirikharinb1,Piyachat Sanguanrut，et al.AP4method for two-tube nested PCRdetection of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus[J].AquacultureReports,2015,2:158-162.)；检测WSSV的方法为GB/T 28630.2-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法[S]；检测IHHNV的方法为GB/T 25878-2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法[S]；检测EHP的方法为亚太水产中心网(NACA)推荐方法(NACA(2018).A New and Improved PCR detection methodforEnterocytozoonhepatopenaei(EHP)based on a gene encoding a spore wallprotein,Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific,Bangkok,Thailand)；检测SHIV的方法同样为亚太水产中心网(NACA)推荐方法(Qiu,Liang,Chen,Meng-Meng,Wan,Xiao-Yuan,et al.Characterization of a new member ofIridoviridae,Shrimp hemocyte iridescent virus(SHIV),found in white leg shrimp(Litopenaeus vannamei)[J].Scientific Reports,7(1):11834)。

　　实施例3

　　对供试质粒标准品的检测

　　分别取AHPND的pirB基因、WSSV的vp28基因、EHP的18s rDNA基因、IHHNV的特异性病毒CDS区域及SHIV的特异性病毒CDS区域的特异性基因片段进行扩增，将各病原体的片段分别插入到pMD19-T载体中，将连接产物转化到DH5α感受态细胞中并进行培养，待长出新菌落后通过PCR和测序(生工生物工程(上海)有限公司)检测插入目的片段，筛选到阳性菌落后提取阳性质粒，得到质粒标准品。其中，AHPND的质粒标准品称为AHPND质粒标准品；WSSV的质粒标准品称为WSSV质粒标准品；EHP的质粒标准品称为EHP质粒标准品；IHHNV的质粒标准品称为IHHNV质粒标准品；SHIV的质粒标准品称为SHIV质粒标准品。

　　用超微量分光光度计测定阳性质粒DNA的浓度和纯度，根据摩尔定律，计算提取到的样品中单位体积所含的质粒DNA拷贝数浓度，最后利用实施例2制备的对虾基因组溶液(没有携带AHPND、WSSV、EHP、IHHNV及SHIV五种病原体)将各病原体的质粒标准品分别稀释至3fg·μL-1以分别用作各病原体PCR扩增的DNA模板；另外利用实施例2制备的对虾基因组溶液(没有携带AHPND、WSSV、EHP、IHHNV及SHIV五种病原体)配制同时含有各病原体的质粒标准品的溶液用作PC PCR扩增的DNA模板，其中，各病原体的质粒标准品在其中的浓度分别为3fg·μL-1。其中，质粒拷贝数＝[质粒浓度(ng·μL-1)×质粒溶液体积(μL)×6.02×1023]/[(质粒长度bp+插入片段(即靶核酸)长度bp)×660g·mol-1]。

　　将3μL如上制备的PCR DNA模板分别加入到实施例1第2小节表1中的反应体系中，接着按照实施例1第2小节中的程序进行PCR扩增，分别得到五种病原体的PCR扩增产物。同时将3μL对虾基因组溶液加入到实施例1第2小节表1中的反应体系中，接着按照实施例1第2小节中的程序进行PCR扩增，得到PC PCR扩增产物。

　　基于对对虾五种病原体的检测，将对虾病原体基因芯片的设计为4×3的阵列。在阵列中，探针按照如图1所示的排布顺序根据实施例1第3小节的步骤固定于硝酸纤维素膜上，各病原体探针均为两个重复的探针。其中包括PC和HC 2个阳性质控点和5个病原体检测点，共计7个点，PC为DNA阳性质控点，用于检测虾基因组中的18s rDNA基因，从而监控样本DNA的提取和PCR扩增过程的有效性；HC为杂交阳性质控点，监控杂交过程。

　　使用如图1排布的基因芯片检测HC杂交阳性质控核酸、PC PCR扩增产物以及如上五种病原体的PCR扩增产物，平行三次实验。结果见图2。

　　图2的结果表明检测信号点均清晰指示对应的病原体，没有非特异性信号点。

　　实施例4

　　不同重复程度的探针的检测效果

　　制备分别包含AHPND 1个重复、2个重复、3个重复、与AHPND 2个重复的探针等长的探针(如SEQ ID.21所示，由生工生物有限公司合成)的基因芯片来确定不同重复程度的探针的灵敏度和特异性。此四组AHPND基因芯片的排布图均如图3所示，其中，以HC为杂交阳性质控点，监控杂交过程。检测对象分别为实施例3的五种病原体的PCR扩增产物。结果见图4。

　　图4的结果表明在3fg/μL AHPND质粒标准品的模板浓度下，单个重复的探针无法检出信号，说明其灵敏度较低。而2个重复以及3个重复的探针均出现明显的阳性信号；但在3个重复的探针中，使用其他四种病原体的PCR扩增产物进行检测出现了假阳性信号；此外，与两个重复等长的探针同样存在其他四种病原体PCR扩增产物的假阳性信号。

　　故采用2个重复的串联序列作为探针是优选方案。

　　实施例5

　　对供试样本的检测

　　携带AHPND、WSSV、EHP和SHIV四种病原体的对虾组织样本来源于中国水产科学院黄海所，为国家农业农村部2019年对虾病原体检测能力验证的盲检样本。共计20只样本。于江苏如东当地采样获得8只对虾组织样本。

　　动物组织提取试剂盒来自江苏猎阵生物科技有限公司，用于分别提取上述28个待测样本中的基因组。

　　以所提取的基因组作为DNA模板，分别加入到实施例1第2小节表1中的反应体系中，接着按照实施例1第2小节中的程序进行PCR扩增，得到待测样本的PCR扩增产物，利用实施例3制备的基因芯片进行检测。

　　此外，还采用实施例2中的现有技术对五种病原体进行了验证检测。

　　其中，6只对虾待测样本用于检测是否存在AHPND病原体，4只对虾待测样本用于检测是否存在WSSV病原体，8只对虾待测样本用于检测是否存在IHHNV病原体，6只对虾待测样本用于检测是否存在EHP病原体。

　　结果见表2。从表2可以看出，本发明2个重复探针的基因芯片的检测结果与现有技术的检测结果完全吻合。

　　表2

　　虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。

　　序列表

　　<110> 江苏猎阵生物科技有限公司

　　<120> 一种基因芯片及试剂盒

　　<130> LHA1960784

　　<160> 21

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 20

　　<212> DNA