一种用于检测人类NTRK1、2、3基因是否发生融合突变的引物组合的设计方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种用于检测人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因是否发生融合突变的引物组合的设计方法。
背景技术
NTRK融合是各种成人和儿童癌症的驱动因素。这些致癌改变要么在选择的肿瘤类型中高度富集，要么在包括常见肿瘤在内的其他癌症的子集中很少发现。第一代TRK抑制剂larotrectinib和entrectinib已证明在患有NTRK融合的多种癌症的成人和儿科患者中具有组织学依赖性和年龄独立活性。神经营养因子酪氨酸激酶受体（NTRK）基因包含NTRK1、NTRK2和NTRK3，分别负责编码原肌凝蛋白受体激酶（TrK）家族蛋白TrKA、TrKB和TrKC的合成，在中枢和周围神经系统发育及细胞生存过程中发挥重要作用。神经营养因子与TrK蛋白质结合后可诱导受体二聚体化、磷酸化并激活下游PI3K、RAS/MAPK/ERK和PLC-γ的信号级联通路。TRK信号通路的改变，能够导致激酶的组成型激活或过表达，引起肿瘤的发生和发展。
靶向NTRK融合基因的小分子药物Larotrectinib可能成为继PD-1单抗药物Keytruda（Pembrolizumab）之后的下一个“异癌同治”的典范。多项研究均推荐采用多种方法（FISH+NGS+PCR)联合检测NTRK1/2/3融合,避免NTRK1/2/3阳性患者漏检，丧失治疗机会。NTRK基因与其他基因发生融合就是其适用靶标，可有效治疗17种肿瘤类型（2017 ASCO报道）：肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、结肠癌、软组织肉瘤、唾液腺癌、婴儿纤维肉瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌。
目前，可以临床上检测融合基因突变的检测方法有NGS、RT-PCR、免疫组化、FISH，虽然成本低，但只能检测已知的融合，而且很有可能会得到假阴性结果，局限性很大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测人类NTRK1、2、3基因是否发生融合突变的引物组合的设计方法用。
本发明采用的技术方案是：
一种用于检测人类NTRK1、2、3基因是否发生融合突变的引物组合的设计方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：提取检测样本中的RNA,所述样本需来自新鲜样本，例如新鲜血液、手术切除/穿刺的肿瘤新鲜样本/超低温冷冻样本/保存在RNA稳定液中的样本；
步骤2：将提取的RNA逆转录为cDN，以cDNA为模板设计人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因的引物组合；
步骤3：预判融合突变发生后，NTRK1、NTRK2、NTRK3基因与其他基因的相对位置，根据相对位置关系设计引物组：
a.如果融合后，其他基因位于所述基因下游polyA端（即3’端），沿所述基因cDNA的外显子（从小到大）依次在每个外显子上设计上游引物，每个外显子上设计1-2个上游引物，组成引物组1，下游引物固定在polyA 3’端（人为添加固定序列接头）；
b.如果融合后，其他基因位于所述基因上游（即5’端），沿所述基因cDNA的外显子（从大到小）依次在每个外显子上设计下游引物，每个外显子上设计1-2个下游引物，组成引物组2，上游引物固定在5’端（人为添加固定序列接头）；
c.实际试验时无法预测所述基因与其他基因发生融合的相对位置，同时选用步骤a和步骤b中的两组引物组（即引物组1和引物组2）。
所述引物设计方法以cDNA为模板，沿可能的基因融合发生方向在每个外显子上依次设计引物，组成引物组合，所述引物组合的引物对人类NTRK1、NTRK2和NTRK3发生的未知融合进行扩增，并通过高通量测序的方法，有效分析出所述基因与其他基因发生的未知融合突变类型，本发明所述引物组合中，所述基因每个外显子上设计1-2个引物。
所述NTRK1基因可能发生融合的外显子编号为exon10，exon11，exon12；所述NTRK2基因可能发生融合的外显子编号为exon16；所述NTRK3基因可能发生融合的外显子编号为exon14，exon15，exon17。
所述用于检测NTRK1基因是否发生融合突变的引物组包括39条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:1-20、SEQ ID NO:68-86所示。
所述用于检测所述NTRK2基因是否发生融合突变的引物组包括52条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:21-46、SEQ ID NO:87-112所示。
所述用于检测所述NTRK3基因是否发生融合突变的引物组包括41条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:47-67、SEQ ID NO:113-132所示。
所述引物组合包括通用引物，所述通用引物的下游通用引物的序列如SEQ ID NO:133所示，所述上游通用引物序列如SEQ ID NO:134所示。
本发明的优点：使用特异性引物识别人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因是否发生融合突变，特异性引物设计方法以cDNA为模板，沿可能的基因融合发生方向在每个外显子上依次设计引物，组成引物组合对人类NTRK1、NTRK2和NTRK3发生的未知融合进行扩增，通过高通量测序的方法，有效分析出NTRK1、NTRK2和NTRK3基因发生的未知融合突变。本发明的试剂盒具有以下优点：准确度高，通过测序精确给出融合突变的基因序列，避免假阴性和假阳性结果；特异性好，能检测出其他未知基因与NTRK1、NTRK2和NTRK3基因发生融合突变的事件，不局限于某一种已知融合突变事件；样本检测范围广，样本可以是石蜡包埋组织、新鲜病理组织或胸积液。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细叙述。
图1为本发明检测NTRK1、NTRK2和NTRK3基因是否与其他基因发生融合突变的引物设计原理图。
具体实施方式
如图1所示，一种用于检测人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因是否发生融合突变的引物组合的设计方法，包括以下步骤：
步骤1：提取检测样本中的RNA,所述样本需来自新鲜样本，例如新鲜血液、手术切除/穿刺的肿瘤新鲜样本/超低温冷冻样本/保存在RNA稳定液中的样本；
步骤2：将提取的RNA逆转录为cDN，以cDNA为模板设计人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因的引物组合；
步骤3：预判融合突变发生后，NTRK1、NTRK2、NTRK3基因与其他基因的相对位置，根据相对位置关系设计引物组：
a.如果融合后，其他基因位于所述基因下游polyA端（即3’端），沿所述基因cDNA的外显子（从小到大）依次在每个外显子上设计上游引物，每个外显子上设计1-2个上游引物，组成引物组1，下游引物固定在polyA 3’端（人为添加固定序列接头）；
b.如果融合后，其他基因位于所述基因上游（即5’端），沿所述基因cDNA的外显子（从大到小）依次在每个外显子上设计下游引物，每个外显子上设计1-2个下游引物，组成引物组2，上游引物固定在5’端（人为添加固定序列接头）；
c.实际试验时无法预测所述基因与其他基因发生融合的相对位置，同时选用步骤a和步骤b中的两组引物组（即引物组1和引物组2）。
引物设计方法以cDNA为模板，沿可能的基因融合发生方向在每个外显子上依次设计引物，组成引物组合，引物组合的引物对人类NTRK1、NTRK2和NTRK3发生的未知融合进行扩增，并通过高通量测序的方法，有效分析出所述基因与其他基因发生的未知融合突变类型，本发明所述引物组合中，基因每个外显子上设计1-2个引物。
NTRK1基因可能发生融合的外显子编号为exon10，exon11，exon12；NTRK2基因可能发生融合的外显子编号为exon16；NTRK3基因可能发生融合的外显子编号为exon14，exon15，exon17。
用于检测NTRK1基因是否发生融合突变的引物组包括39条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:1-20、SEQ ID NO:68-86所示。
用于检测所述NTRK2基因是否发生融合突变的引物组包括52条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:21-46、SEQ ID NO:87-112所示。
用于检测所述NTRK3基因是否发生融合突变的引物组包括41条引物，其引物序列分别如SEQ ID NO:47-67、SEQ ID NO:113-132所示。
引物组合包括通用引物，通用引物的下游通用引物的序列如SEQ ID NO:133所示，所述上游通用引物序列如SEQ ID NO:134所示。
试剂盒包括前述的引物组合和其他检测试剂。
本发明还涉及一种测序前构建cDNA文库的方法，方法包括以下步骤：（1）提取RNA样本；（2）将RNA反转录成cDNA；（3）使用前述引物组1和引物组2，以及通用引物，进行PCR反应，扩增所述cDNA样本，获得可用于高通量测序的样本。
在一些具体的实施方式中，步骤（3）PCR的反应体系包括：DNA样本9.4µL，5×缓冲液4µL，引物组1和引物组2共5µL，通用引物0.8µL，DNA聚合酶0.8µL；
在一些具体的实施方式中，步骤（3）PCR的扩增程序包括：a.预变性：先95℃变性13min，再在98℃变性2min；b.循环扩增：先98℃变性15s，再68℃延伸10min，循环数8。
在一些具体的实施方式中，RNA样本需来自新鲜样本，例如血液、手术切除/穿刺的肿瘤新鲜样本/超低温冷冻样本/保存在RNA稳定液中的样本。
以下通过具体实施例对本发明进一步阐述
实施例1
NTRK1/2/3基因融合检测引物序列
在肿瘤组织中NTRK1/2/3可以和多种基因发生融合，如LMNA、SQSTM1、TPM3、ETV6等。本实施例设计能够用于检测NTRK1融合基因、NTRK2融合基因和NTRK3融合基因的引物组合，可以检测任何其他基因与所述基因发生融合的类型，其设计原则如下：
1、将提取的RNA逆转录为cDN，以cDNA为模板设计人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因（以下简称所述基因）引物组合；
2、预判融合突变发生后，NTRK1、NTRK2、NTRK3基因与其他基因的相对位置，根据相对位置关系设计引物组：
a. 如果融合后，其他基因位于所述基因下游polyA端（即3’端），沿所述基因cDNA的外显子（从小到大）依次在每个外显子上设计上游引物，每个外显子上设计1-2个上游引物，组成引物组1；
表1 NTRK1基因融合引物组合1：
表2 NTRK2基因融合引物组合1：
表3 NTRK3基因融合引物组合1：
b. 如果融合后，其他基因位于所述基因上游（即5’端），沿所述基因cDNA的外显子（从大到小）依次在每个外显子上设计下游引物，每个外显子上设计1-2个下游引物，组成引物组2；
表4 NTRK1基因融合引物组合2：
表5 NTRK2基因融合引物组合2：
表6 NTRK3基因融合引物组合2：
c. 因为实际试验时可能无法预测所述基因与其他基因发生融合的相对位置，一般同时选用步骤a和步骤b中的两组引物组（即引物组1和引物组2）；
3、设计固定在polyA 3’端和固定在5’端的通用引物，通用引物分别与引物组1、引物组2组成扩增引物对，优选地，通用引物与接头序列中至少一部分相同或互补配对；
表7 通用引物列表：
实施例2
NTRK1/2/3基因融合检测方法
本实施例检测试剂盒包括：NTRK1/2/3基因融合检测引物包括引物组合1（SEQ ID NO1-67）、引物组合2（SEQ ID NO 68-132）以及通用引物（SEQ ID NO 133-134），具体序列见表1-6；还包括逆转录酶、逆转录缓冲液、DNA polymerase、dNTP以及pcr反应缓冲液。
1、从样本中提取总RNA；
2、将提取的RNA进行逆转录反应，获得单链cDNA；
逆转录体系为：
逆转录反应程序为：72℃下在热盖热循环仪中孵育3分钟，以0.1℃ /秒缓慢降温至42℃，42℃孵育90分钟，再70℃下加热10分钟终止反应，加入90μL Elution Buffer（EB）稀释第一链反应产物，获得单链cDNA溶液。
3、以cDNA为模板，进行PCR循环数优化。
不同来源的RNA样本在PCR扩增过程中表现不同，所以建议进行循环数优化，尽量减少PCR扩增的偏向性。优选地，对于800 ng -1000 ng起始输入total RNA，最佳循环数通常为10-12。
PCR反应体系为：
PCR扩增反应程序为：
a、初始变性：- 98°C 30秒；
b、在以下温度和时间下进行10次循环：- 98°C，10秒、- 65°C，持续15秒、- 68°C，10分钟；
c、最终延伸：- 68°C，5分钟；
在10个循环后，取出5μL反应物并将其转移到标有“10”的管中，将剩余的45μL PCR反应返回到热循环仪，并进行上述扩增条件的两个循环。
在以下温度和时间下进行2次循环：
a、初始变性：- 98°C 30秒；
b、在以下温度和时间下进行2次循环：- 98°C，10秒、- 65°C，持续15秒、- 68°C，10分钟；
c、最终延伸：- 68°C，5分钟；
再次移除5μL并转移到标有“12”的管中。重复上述步骤，进行14个循环。
通常，800-1000ng的总RNA输入需要10到12个PCR扩增循环。输入总RNA <800 ng可能需要更多循环。将3份等分试样加载到1％琼脂糖凝胶或Lonza闪光凝胶上。
4、基因测序及检测结果分析。
高通量测序数据下机后，通过融合基因分析软件，自动筛选出可能发生融合突变的序列，再经校验后，可确定NTRK1/2/3基因融合结果。
本发明实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应认为是等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本发明使用特异性引物识别人类NTRK1、NTRK2和NTRK3基因是否发生融合突变，特异性引物设计方法以cDNA为模板，沿可能的基因融合发生方向在每个外显子上依次设计引物，组成引物组合对人类NTRK1、NTRK2和NTRK3发生的未知融合进行扩增，通过高通量测序的方法，有效分析出NTRK1、NTRK2和NTRK3基因发生的未知融合突变。本发明的试剂盒具有以下优点：准确度高，通过测序精确给出融合突变的基因序列，避免假阴性和假阳性结果；特异性好，能检测出其他未知基因与NTRK1、NTRK2和NTRK3基因发生融合突变的事件，不局限于某一种已知融合突变事件；样本检测范围广，样本可以是石蜡包埋组织、新鲜病理组织或胸积液。
