基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库和检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本建库和检测方法。
背景技术
传染病，比如泌尿类感染疾病是人类健康的主要威胁之一。感染的及时准确诊断关乎患者预后。目前以形态学和血清学为主的检测诊断方法具有培养时间长、灵敏度低等诸多不足。本世纪以来，随着核酸测序技术的快速发展和更新换代，基于基因序列分析的病原体分析已经在传染病领域被广泛的应用。但是我国目前就多种病原体同时检测的分子诊断方法尚缺乏，一般都是单一已知病原菌的定向检测，在临床实践中以及传染病防控中的覆盖范围有限。例如传统的PCR扩增分子诊断技术就存在着上述许多难以解决的瓶颈问题，难以满足临床诊疗的需求。
近十年来测序技术的快速发展将病原基因组学的研究推向了一个新阶段，病毒、细菌、真菌和寄生虫的全基因组信息日益增多；基因组学及生物信息学的发展，包括宏基因组学及相应的测序技术，极大扩展了针对包括病原体在内的复杂微生物研究手段。基因组学技术在传染病的预防和控制方面的应用的重要性也随着技术的发展而日益提高。
牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technology，ONT)纳米孔单分子测序技术具有三代测序长读长的优势，最长读长可高达900kb。其便携式测序仪产品MinION还以其U盘大小的体积，灵活控制的测序通量，实时数据产生的测序速度，以及测序与数据分析同步并行的算法，突破了时间和空间上的限制，完美地契合了临床检测的需求。而针对于临床感染的宏基因组分析恰好是纳米孔测序胜任并且具有得天独厚优势的应用领域，尤其适用于针对那些难于体外培养的病原体无法分离为纯株进行全基因组测序。
但纳米孔单分子测序技术对样本量要求极高，文库构建显得尤为重要，目前针对微生物的纳米孔测序建库方法主要为扩增法。该方法需要的核酸起始量少，较适合单独菌株的文库构建，然而该方法单样本成本高，测序通量偏低，如果面对的是富含宿主(人类)的临床样本，尤其是包含多种病原菌的临床样本，即需要解决的问题为宏基因组测序的时候，就会表现出GC偏好性以及大量的人类核酸占用数据量的情况。所谓GC偏好性即优先扩增基因组中GC含量较低的病原菌，少扩增甚至不扩增GC含量高的病原菌，造成在宏基因组这种混合病原菌中每种菌扩增的机会不相同，可能导致重要病原菌的漏测或者少测，影响结果输出的准确性。而与此同时如果人类的核酸占比过高，就可能进一步影响真正重要病原菌的检出及数据量。这就导致诸如泌尿类感染样本难以利用该方法有效检测，给下游测序及分析带来了瓶颈。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库方法，以缓解现宏基因组中人类核酸占比过高，以及感染菌扩增机会不等的问题，影响结果输出的准确性。
本发明的第二目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本检测方法，提供一种检测准确性更高的检测方法，改善漏测或少测的假阴性问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库方法，将待检测样本依次经去宿主和提取基因组后进行标记，得到的带标记模板再PCR扩增进行建库；
所述PCR扩增的反应体系中含有3-5％(v/v)的二甲基亚砜；
所述PCR扩增的反应程序促进高GC含量模板的解旋和延伸。
进一步地，所述二甲基亚砜的含量为为4％(v/v)。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序中预变性温度为96.5-97.5℃，预变性时间为2-4min，变性温度为96.5-97.5℃，变性时间为15-25s，延伸时间为5-7min；
进一步地，预变性温度为97℃，预变性时间为3min，变性温度为97℃，变性时间为20s，延伸时间为6.5min；
进一步地，所述PCR扩增的反应体系中还包括带标记模板、扩增通用引物、DNA聚合酶和缓冲液；
优选地，所述DNA聚合酶为LongAmp Taq DNA聚合酶；
优选地，所述带标记模板的浓度为0.02-0.1ng/μl。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序包括：
优选地，所述PCR扩增的反应程序包括：
进一步地，所述去宿主依次包括游离宿主DNA、降解宿主DNA和去除宿主DNA。
进一步地，游离宿主DNA包括待检测样本用0.1-0.5w/v％的皂苷处理5-15min；
优选地，降解宿主DNA包括待检测样本经游离宿主DNA后，用0.3-1％(v/v)的HL-SAN处理10-20min。
进一步地，所述标记包括将依次经去宿主和提取基因组后的待检测样本与FRM孵育反应；
优选地，所述孵育反应的程序包括：先29-31℃反应0.5-1.5min，再79-81℃反应0.5-1.5min，最后11-13℃保存；
优选地，所述孵育反应的程度包括：先30℃反应1min，再80℃反应1min，最后12℃保存。
一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本检测方法，包括上述的建库方法。
一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库试剂盒，所述试剂盒包含RPB004试剂盒中组分，还包括终浓度4％(v/v)的DMSO。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过对建库体系优化，获得一套适于泌尿感染样本的建库体系，其客观性强、准确度高，保证泌尿感染样本有效建库和测序；
2)本发明通过对于泌尿样本建库体系中加入4％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)，可显著促进高泌尿样本的GC含量模板的解旋和延伸，提高了建库效率。
3)本发明优化的泌尿感染样本的扩增体系，提升了变性和预变性温度，延长了变性和延伸时间，使解链更充分，助于产物浓度的增加，提高测序长片段占比，提升平均长度，减低测序难度。
4)本发明的建库方法针对泌尿样本简单易行，适于实用，建库后纳米孔测序准确性更高，有效改善漏测或少测的假阴性问题，提高检出率，适于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明对比例中建库各菌株占比结果统计；
图2为本发明实施例1中建库各菌株占比结果统计；
图3为本发明实施例2中2％的DMSO建库各菌株占比结果统计；
图4为本发明实施例2中4％的DMSO建库各菌株占比结果统计；
图5为本发明实施例2中5％的DMSO建库各菌株占比结果统计。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本的建库方法，将待检测样本依次经去宿主和提取基因组后进行标记，得到的带标记模板再PCR扩增进行建库，其中，PCR扩增的反应体系中含有3-5％(v/v)的二甲基亚砜，PCR扩增的反应程序促进高GC含量模板的解旋和延伸。
发明人针对目前现有的纳米孔测序建库方法当面对宏基因组中核酸GC含量差距较大的物种时，容易出现优先扩增GC含量低的菌株，从而导致检测出现扩增偏好的问题，该问题在低起始量的样本中显得更加严重，所以，本发明对目前的扩增体系以及扩增程序进行了优化，一方面在反应体系中加入二甲基亚砜减少扩增偏好性；另一方面使得反应程序促进高GC模板的解旋和延伸，给高GC含量模板更高的变性温度、变性时间、延伸时间等，通过改善扩增体系，保证建库的准确性、客观性以及效率问题。
需要说明的是，去宿主是指将宿主DNA清除的步骤，例如可以游离宿主DNA，再降解，最后去除宿主DNA；标记是指利用例如FRM等物质对经过去宿主和提取基因组后的待检测样本进行标记修饰；PCR扩增的反应体系中，二甲基亚砜的含量典型但非限制性的为3％(v/v)、4％(v/v)或5％(v/v)。
在优选地实施方式中，二甲基亚砜的含量为4％(v/v)。二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫的有机化合物，高极性、高沸点、热稳定性好，被誉为万能溶剂。在本发明的扩增体系中加入DMSO有利于减少DNA的二级结构，使GC含量高的模板易于完全变性，使扩增过程更易进行。但是过高的二甲基亚砜含量会抑制扩增酶的活性，甚至导致基因中GC含量高的模板优先扩增，而二甲基亚砜的含量过低又不能起到作用，本发明对二甲基亚砜的含量进行了优化和限定。
在优选地实施方式中，PCR扩增的反应程序中，预变性温度为96.5-97.5℃，预变性时间为2-4min，变性温度为96.5-97.5℃，变性时间为15-25s，延伸时间为5-7min。基因组中GC含量高的DNA链解链较GC含量低的DNA链更艰难，所需要的解链时间更长，因此在提升了变性及预变性温度的同时延长了变性时间，使解链更加充分，还可进一步助于产物浓度的增加；与此同时还增加了延伸时间，使DNA扩增酶有更加充裕的时间进行新核酸延伸，进一步增加长片段占比，提升平均长度。
在优选地实施方式中，PCR扩增的反应体系中还包括带标记模板、扩增通用引物、DNA聚合酶和缓冲液。DNA聚合酶优选为LongAmp Taq DNA聚合酶，带标记模板的浓度优选为0.02-0.1ng/μl,。扩增通用引物为现有技术中建库用的常用扩增引物。
在优选地实施方式中，PCR扩增的反应体系以50μl计，包括Nuclease-free water12μl；带标记模板4μl；RLB(01-12A)1μl；LongAmp Taq 2×master mix(NEB)25μl；25％(v/v)二甲基亚枫DMSO 8μl。其中，RLB为Rapid Barcode Primers，共12个分子标签(购于ONT，包含在RPB004试剂盒中)。
在优选地实施方式中，PCR扩增的反应程序包括：
在更优选的实施方式中，PCR扩增的反应程序包括：
在优选地实施方式中，去宿主包括依次游离宿主DNA和降解宿主DNA，再去除宿主DNA。
在优选地实施方式中，游离宿主DNA包括待检测样本用0.1-0.5w/v％的皂苷处理5-15min。
在优选地实施方式中，降解宿主DNA包括待检测样本经游离宿主DNA后，用0.3-1％(v/v)HL-SAN处理10-20min。
在优选地实施方式中，标记包括将依次经去宿主和提取基因组后的待检测样本与FRM(Fragmentation Mix，转座酶，使DNA片段化)孵育反应。孵育反应的程序优选包括：先29-31℃反应0.5-1.5min，再79-81℃反应0.5-1.5min，最后11-13℃保存。孵育反应的程度进一步优选包括：先30℃反应1min，再80℃反应1min，最后12℃保存。
一种应用本申请上述建库方法的基于纳米孔测序平台的泌尿宏基因组样本检测方法，该检测方法使得检测准确性更高，有效改善漏测或少测的假阴性问题，提高检出率。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明所用检测微生物：购买
本发明所用的基础建库试剂盒为RPB004试剂盒，购于ONT公司。
对比例
以ONT公司的RPB004试剂盒为基础进行试验，全部试剂包括建库引物均来源于该试剂盒。具体建库PCR扩增体系如下述，以此作为本发明的对比例。
方法：0.2ml PCR管中每例样本加入0.1ng/0.25ng/0.5ng/1ng共4个梯度的上述标准品和1μl FRM(包含在RPB004试剂盒中)，用于模仿实际应用中较低起始量的情况。
具体的PCR扩增程序为：
PCR结束后取1μl，用Qubit检测PCR产物浓度，质控标准为4ng/μl。
加入相当于体积0.6×beads，室温旋转孵育5min，瞬时离心放磁力架上去上清。200μl新鲜配制的75％酒精洗2次beads。加入12μl 10mM Tris-HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液，室温旋转孵育2min，瞬离放磁力架上至澄清。小心吸取11μl上清至1.5ml低吸附的离心管中。向上清10μl中加入1μl RAP，室温反应15min，准备上机。
按照牛津纳米孔上机流程：Priming and loading the SpotON Flow Cell进行上机。得到数据如下表1所示，百分比意为下机后某菌读长条数占所有读长条数的百分比，统计结果如图1所示：
通过该对比例得到数据如下表所示，数据结果见表1：
从对比例上表结果可以看出来，当不同GC含量细菌共同扩增的时候，各种细菌的扩增随GC含量升高而降低，非常不利于宏基因组检测。对比例的文库平均值大小为1.78kb，较难发挥出ONT测序的长读长优势。
实施例1建库pcr的温度和时间等参数优化
鉴于RPB004试剂仅是ONT公司的一种基础建库试剂盒，对于泌尿这种特殊样本而言，其建库效果并不显著(如上述对比例)，本申请在研发过程中对上述对比例的扩增体系进行了多因素的反复优化，包括预变性温度、变性温度、变性时间以及延伸温度和时间等，最终确定理想扩增参数体系。
方法：0.2ml PCR管中每例样本加入0.1ng/0.25ng/0.5ng/1ng共4个梯度的上述标准品和1μl FRM(RPB004试剂盒中组分)，用于模仿实际应用中较低起始量的情况。轻轻混匀离心，PCR仪上反应:30℃1min，80℃1min，12℃∞。
配制PCR mix体系(50μl)如下表：
优化后的PCR反应条件如下:
PCR结束后取1μl，用Qubit检测PCR产物浓度，质控标准为4ng/μl。
加入相当于体积0.6×beads，室温旋转孵育5min，瞬时离心放磁力架上去上清。200μl新鲜配制的75％酒精洗2次beads。加入12μl 10mM Tris-HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液，室温旋转孵育2min，瞬离放磁力架上至澄清。小心吸取11μl上清至1.5ml低吸附的离心管中。向上清10μl中加入1μl RAP，室温反应15min，准备上机。
按照牛津纳米孔上机流程：Priming and loading the SpotON Flow Cell进行上机。得到数据如下表所示，百分比意为下机后某菌读长条数占所有读长条数的百分比，统计结果如表2所示：
实施例1中可以看出，下机数据中序列的平均长度为2.22kb，高于对比例25％，说明改变扩增参数可以有效地延长扩增产物的平均长度，同时可以提高PCR产物浓度，利于测序分析，不过对于GC偏好问题改善不显著，详见图2。
实施例2建库pcr的DMSO引入和浓度优化
一、方法A：0.2ml PCR管中每例样本加入0.1ng/0.25ng/0.5ng/1ng共4个梯度的上述标准品和1μl FRM(购于ONT，包含在RPB004试剂盒中)，用于模仿实际应用中较低起始量的情况。
配制PCR mix体系(50μl)如下表，DMSO终浓度2％(v/v)：
PCR仪反应，条件如下:
PCR结束后取1μl，用Qubit检测PCR产物浓度，质控标准为4ng/μl。
加入相当于体积0.6×beads，室温旋转孵育5min，瞬时离心放磁力架上去上清。200μl新鲜配制的75％酒精洗2次beads。加入12μl 10mM Tris-HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液，室温旋转孵育2min，瞬离放磁力架上至澄清。小心吸取11μl上清至1.5ml低吸附的离心管中。向上清10μl中加入1μl RAP，室温反应15min，准备上机。
按照牛津纳米孔上机流程：Priming and loading the SpotON Flow Cell进行上机。测序分析得到数据如下表3所示，百分比意为下机后某菌读长条数占所有读长条数的百分比，统计结果如表3所示：
可以看出，少量的DMSO(2％v/v)在尿液样本的宏基因组扩增中略有改善GC含量偏多菌株优选扩增的现象，但效果并不显著，详见图3；同时，平均读长长度为2.6kb，高于对比例46％。
二、方法B，与A方法相同，不同的是，PCR扩增的反应体系中，25％二甲基亚枫用量为8μl(终浓度4％v/v)。
测序分析得到数据如下表所示，统计结果如表4所示：
从上表结果可以看出，DMSO的用量达到终浓度4％，当不同GC含量细菌共同扩增的时候，各种细菌的测序量趋于平衡(见图4)，并在理论占比范围(12％)上下波动，有利于宏基因组检测，同时测序平均读长大小为2.18kb，比对比例长度提高了22％。
三、与A方法相同，不同的是，PCR扩增的反应体系中，25％二甲基亚枫用量为10μl(终浓度5％v/v)。
测序分析得到数据如下表所示，统计结果如表5所示：
可以看出，当加大了DMSO用量达到终浓度为5％时，过于扩增了GC含量高的菌，导致GC含量低的菌的扩增收到了抑制，并不适合宏基因组的扩增，下机的测序读长长度平均读长为2.03kb，比对比例提高了14％，具体见图5。
综上，不同浓度的DMSO对扩增结果影响极其显著，过高(5％)或高低(2％)的DMSO浓度对于泌尿样本的建库效果差异显著，本实验确定4％的DMSO浓度最适于泌尿样本的建库。
实施例3临床样本检测
微生物：医院检验科收集的临床泌尿样本，每一份均有临床尿培养结果。样本4℃冷链运输，在生物安全柜中充分轻柔的混匀12300g离心5min，弃上清加1mLPBS重悬沉淀，再转移到2ml低吸附离心管中。
1去宿主：
a)取上一步需要去宿主样本，12300g离心5min。
b)小心弃掉上清(不要触碰到沉淀，可以留<＝50μl上清)，250μl PBS重悬沉淀，涡旋混匀，如有结块则用枪上下吹打充分混匀。
c)加入终浓度0.22％(w/v)的Saponin，涡旋混匀，在旋转混匀仪上室温旋转10min。加入350μl无菌水，涡旋混匀，30s后加12μl 5M NaCl，立刻震荡混匀。
d)10000g离心5min小心去上清(不要触碰到沉淀，可以留<＝50μl上清)，100μlPBS重悬沉淀，再加终浓度0.49％(v/v)的HL-SAN，37℃，1300rpm孵育15min。
e)用800μl PBS重悬沉淀，涡旋混匀。
2 MP FastPrep-24 5G破壁处理
a)临床样本去宿主处理后，直接用移液器吹打混匀后转移至MP Lysing Matrix Etube中，并按照MP FastPrep PROGRAM MANUALLY要求进行破壁处理，SPEED为6.0m/sec，ADAPTER为QuickPrep，TIME为40s，Lysing Matrix为E。
b)用Eppendorf 5424R型号离心机，14000rpm离心10min，转移上清进行下一步基因组的提取。
3 Maxwell RSC自动核酸提取
a)首先打开Maxwell RSC提取仪所连接的电脑，然后打开Maxwell RSC提取仪仪器。
b)选择其中“Whole Blood DNA(CATALOG NUMBER AS1520)”对应的程序，按照提示进行提取。
c)Qubit测定浓度。
4建库和上级测序分析
分别按照实施例2的方法2和对比例的方法进行对比检测，验证本发明的临床实验效果。具体结果如下：
结果表明，本发明方法在扩增产物浓度及产物平均值上均优于对比例，实施例。检出结果与临床培养的阳性一致率上，本发明方法也明显优于对比例：对比例临床对于27号样本、40号样本、60号样本均无法检测到混合感染，而6号样本尿液样本中可能细菌含量较少，比例无法检出，因此检出率＝9/13*100％＝69％；而本发明均全面且准确检出，其检出率＝13/13*100％＝100％，显著优于对比例。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
