一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法
技术领域
本发明涉及宏基因组技术领域，更具体地，涉及一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法。
背景技术
目前，感染性疾病是当今世界上威胁人类健康的重点疾病。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原呈现多样化和复杂化的发展趋势，各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明原因的发热，都给人类健康带来巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病的诊断的真确性和实效性提出了更好的要求。
临床上传统的鉴定方法基于两种策略：一种是给予细胞培养的方法，作为鉴定病原微生物的金标准，但其依赖于样本，且对试验和技术条件十分严格限制其广泛应用；另一种是基于特异性引物/探针/抗体的方法，如抗原抗体反应，PCR反应，等特异性快速检测系统，但其基于特异性的方法只能检测已知的病原体，无法应对未知及人工改造的病原体，通量不够且阳性率低等短处，导致其无法解决很多临床问题。病原体的常规检测方法存在阳性率低，周期长，对操作人员的技术水平要求比较高等局限。
近年来高速发展的NGS技术因其不依赖于已知的核酸序列，无需特殊设计探针，课直接怼未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检测的局限性，在临床微生物领域展现量广阔的前景。
宏基因组学是以某一特定环境样品中的病原体群体基因组为研究对象，以测序分析为研究手段，以病原体多样性，种群结构，进化关系，功能活性，相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的病原体研究方法，宏基因组可不依赖培养，无需对病原体进行假设，同时，一旦发现病原体的基因组序列，即可实现有关溯源，耐药，毒力等多种分析，结果具有很高的实用价值，这些特点弥补了传统检测方式的不足。
但是，目前利用宏基因组技术检测病原微生物检测的灵敏度还需要进一步提高，以满足临床上的要求。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法，使得DNA和RNA一起建库上机，使得检测结果更为准去和灵敏。
本发明的目的是提供一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护一种宏基因二代测序的建库样本的制备方法，包括以下步骤：
采集样本，并制备样本溶液；
裂解样本溶液中的宿主细胞，并消化样本溶液释放出的DNA，通过酶法和机械法进行破壁，得到样本1；
对样本溶液进行DNA酶消化，得到样本2；
将样本1和样本2合并，提取总核酸；
总核酸分为两部分：一部分去除rRNA，反转录为cDNA，与另一部分混合；
其中，裂解样本溶液中的宿主细胞的方法为，样本溶液与皂苷溶液混合，至皂苷的终质量浓度为0.22％～2.2％，孵育10～60min，再加入NaCl反应。
最优选地，皂苷的终质量浓度为2.2％，孵育30min。
本发明针对的样本包括但不限于：痰液，脑脊液、支气管肺泡灌洗液、气道分泌物、全血、脓液、引流液、胸腹水、羊水、新鲜组织、血片、石蜡包埋组织切片、拭子、尿液、关节液、关节组织或超声震荡液、起搏器囊袋内组织、起搏器、导线或其赘生物等20种临床标本类型。
当样本为液样本使用DTT进行处理，得到溶液样本；当样本为羊水样本进行离心得到沉淀，得到溶液样本；当样本为组织样本进行消化处理，得到溶液样本；其他类型的溶液样本直接进行下一步。
优选地，利用HL-SAN Buffer和HL-SAN消化样本溶液释放出的DNA，离心，弃上清，洗涤并重悬沉淀。
优选地，使用溶菌酶和溶胞酶进行酶法破壁。
优选地，破壁的具体方法为：向产物中加入溶菌酶至终浓度61.4U/μL和20μL溶胞酶至终浓度0.35U/μL，37℃30min，之后加入锆珠，用组织研磨均质仪以6M/s速度破壁30s，之后12000g离心3min，取上清。
更优选地，破壁的具体方法为：向产物中加入溶菌酶和溶胞酶，37℃反应30min。反应结束后，加入500mg 0.1mm锆珠，用TGrinder H24组织研磨均质仪以6M/s速度破壁30s，静置30s后重复一次，结束后以12000g离心3min，吸取样本至新的离心管(提取管)。
优选地，使用DNase I Buffer和Recombinant DNase I进行DNA酶消化。
优选地，使用
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
利用本发明提出的针对二代测序的宏基因组建库样本的方法进行宏基因组测序，测序的检测能同时检测DNA和RNA病毒，以能保证不遗漏RNA病毒；检测可对样本中总核酸进行检测，检测的灵敏度高，对于样本中所有微生物均能检。
附图说明
图1为实施例4中A1的文库片段分布情况。
图2为实施例4中A2的文库片段分布情况。
图3为实施例4中A3的文库片段分布情况。
图4为实施例4中A4的文库片段分布情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1宏基因二代测序的建库样本的制备
一、样本的采集
样本类型包括痰液，脑脊液、支气管肺泡灌洗液、气道分泌物、全血、脓液、引流液、胸腹水、羊水、新鲜组织、血片、石蜡包埋组织切片、拭子、尿液、关节液、关节组织、超声震荡液、起搏器囊袋内组织、起搏器、导线或其赘生物20种临床标本类型。
二、样本前处理
痰液样本：加入3倍体积的1％DTT，37℃孵育30～60min至样本充分液化；
羊水样本：8000g离心10min，弃上清后加入1mL PBS重悬；
组织样本：剪取黄豆大小的组织于2mL螺口管，加入500mg 0.1mm锆珠用TGrinderH24组织研磨均质仪以6M/s速度研磨30s，结束后加入1mL PBS重悬；
其他类型的溶液样本直接进行下一步。
取1mL溶液样本，6000g离心10min，吸取上清500μL进行RNA前处理流程，剩余500μL进行DNA前处理流程
三、DNA前处理
1、DNA去宿主：向500μL溶液样本中加入400μL 5％质量分数皂苷(Tokyo ChemicalIndustry，S0019)，即皂苷的质量分数终浓度为2.2％，室温孵育10min以促进宿主细胞裂解，孵育完成后加入13.5μL 5M NaCl室温孵育30s进一步裂解细胞。然后6000g离心5min，离心完成后去除上清，加入100μL PBS重悬。加入100μL HL-SAN Buffer(0.5M Nacl和20mMMgCl)和10μL HL-SAN(Articzymes)，37℃孵育15min消化降解DNA。反应结束后6000g离心3min，用800μL PBS和1mL PBS洗两次，用500μL PBS重悬。
2、破壁：向上一步产物中加入50μL 10mg/mL的溶菌酶(终浓度61.4U/μL)和20μL10U/μL的溶胞酶(终浓度0.35U/μL)，37℃反应30min。反应结束后转移到2mL螺口管，加入250mg 0.1mm锆珠，用TGrinder H24组织研磨均质仪以6M/s速度破壁30s，结束后以12000g离心3min，吸取500μL样本至新的2mL离心管(提取管)。
四、RNA前处理
向500μL溶液样本中加入50μL 10X DNase I Buffer和20μL Recombinant DNaseI(Takara)，37℃孵育20min消化降解DNA。反应结束后加入25μL 0.5M EDTA，80℃孵育2min终止反应。
五、总核酸提取
将(三)和(四)处理完的样本合并成一管，使用磁珠法病原微生物DNA/RNA提取试剂盒进行总核酸提取(例如天根DP710-T6)，洗脱体积为40μL。
六、RNA去宿主
吸取上一步的提取的总核酸11μL，使用凯杰的
七、RNA反转录
对第上一步的的产物进行一链反转录，再用Klenow Fragment(3→5exo-)进行随机引物法DNA合成，并利用RNase H酶进行DNA修复和T4 DNA连接酶修补双链DNA杂合物上的单链缺刻合成cDNA。
将第(五)步剩余的样本与第(七)步的样本合并后进行后续建库。
实施例2宏基因二代测序
一、按照实施例1方法制备建库样本，进行片段化，并对片段化产物进行纯化。
使用NEBNext dsDNA Fragmentase试剂盒进行片段化，产生100～800bp的片段。
二、以上一步所得纯化产物为模板，在片段化好的DNA片段两端加上特定接头。
三、定量，质检，获得DNA和RNA文库
以PI接头进行扩增修复得到适合DA8600上机的文库：在片段选择中先使用对于上述纯化产物的1.2倍体积的磁珠去除大于500bp的大片段后纯化，再用对于上述纯化产物的0.8倍体积的磁珠去除小于50bp的小片段，最终得到最适的文库片段长度，文库平均长度在210bp到280bp。
四、以上一步所得文库为模板，在DA8600配套的OT进行模板富集和ES、上机测序得到下机数据。
五、以上一步所得下机数据进行数据分析，按快速分析微生物。
通过下载生物信息数据库中人的全部基因组序列信息，用生物信息分析软件建立人的基因组索引，然后将待测样本宏基因组测序结果与人的基因组索引比对，去除比对上100bp的序列和全部比对上人，无错配的序列；
将去除人的基因组后的序列与病原微生物宏基因组参考数据库比对，确定比对上的序列数并利用本地脚本统计序列数；
其中，病原微生物物种数据库通过以下方法建立得到：下载生物信息数据库中的全部基因组序列信息；将获得的信息根据基因组序列相似度和物种分类信息，进行冗余微生物的筛选和去除，生成一个包括所有微生物序列和物种分类信息的微生物物种数据库，并对这一数据库中分类别编号，得到3020种细菌，289种真菌，9371种病毒、100种衣/支原体、168种原生生物和111种分枝杆菌。
将未比对上病原微生物宏基因组参考数据库的序列数进行拼接，比对NR数据库做系统进化分析
从病原微生物宏基因组参考数据库中获得微生物的编号和名称信息；查阅文献获得微生物相关的生理生化及致病性信息。
实施例3模拟样本的检测
使用实施例2的方法对阳性质控样本的检测，其中模拟样本具体信息间表1。
表1：
检测三个MIX混合样本，具体实验信息如表2所示。
表2：
数据结果如表3所示。
表3：
其中，检出总序列数：经高通量测序方法检测得到的核酸序列总数；
微生物检测序列数：样本中检测到的微生物核酸序列总数；
内参检出率：设计一段非人源非微生物的序列质粒作为内参加入实验质控，内参序列的比对率；
覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值。
结果显示均检出所有微生物，包括耐药基因，同时能检测出具体的型别。
实施例4皂苷去宿主的测试
一、实验方法
使用实施例2的方法对阳性质控样本的检测，仅仅改变皂苷的终浓度，具体实验分组如表4所示。
表4皂苷处理：
二、实验结果
反转录结束后，将反转录产物与抽提产物混合，测定的浓度为cDNA浓度，由于B1、B2还未测定DNA浓度就与反转录产物混合，故DNA浓度未测；RNA测定浓度之前在4℃放置了3h左右，可能导致其中RNA降解。核酸提取和反转录的结果如表5所示。
表5：
测序文库构建的结果如表6和图1到4所示(其中，根据A2的cDNA浓度，确定片段化起始量为5ng，并将文库扩增循环数设置为13)。
表6：
上机测序结果如表7和8所示
表7：总非人源占比
表8：各种病原体检出reads
其中，4/1表示2.2％皂苷处理相对于完全空白对照检出reads提高倍数，4/2表示0.22％皂苷相对于完全空白对照检出reads提高倍数，3/1表示2.2％皂苷处理相对于相对平行对照检出reads提高倍数，3/2表示0.22％皂苷处理相对于相对平行对照检出reads提高倍数。
结果显示，提取结果的DNA浓度，皂苷裂解后DNA酶消化可以将大部分DNA消化掉，与原来不进行皂苷去宿主操作的实验对比，2.2％浓度的皂苷处理将DNA得率降低了25.74倍、0.22％浓度的皂苷处理则降低了39.99倍，而其实际降低的DNA比例分别是26.29和40.59倍，二者相差不大，可以认为实验过程中的温度改变对DNA影响不大。
由于皂苷消化了大部分的DNA，故将片段化起始量统一为5ng，从文库浓度和片段分布上看，5ng起始可以正常构建文库，皂苷处理除了会降低片段化起始量外对文库构建无影响。但值得注意的是，3组重复中皂苷处理组的文库浓度平均比对照组低3.3倍。
从样本中总的reads和人源序列reads来看，0.22％皂苷和2.2％皂苷处理均使非人源占比从16％提升到45％。
从各病原体检出reads数看，相对平行对照和完全空白对照结果中细菌真菌占比相差不大，说明实验过程中的温度变化对细菌、真菌影响不大，主要是皂苷和DNA酶处理影响了其占比，但由于3、4两组的病毒检出reads不高，无法有效得出温度对病毒，尤其是RNA病毒的影响。
可以看出，0.22％皂苷处理对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)和乙肝病毒的检出reads提高效果更好，分别提高了16.2393、27.7162、174.2553倍，对乙肝病毒效果明显。而2.2％皂苷处理对革兰阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌)和黑曲霉的检出reads提高效果更好，分别提高18.0249、71.7438、229.9004倍，对黑曲霉效果明显。
从细菌真菌的检出reads排序(代表丰度)来看，皂苷处理均能使各种预混的病原体在检出列表中的排序提高，更契合真实情况，尤其对对照组中检出reads较少的更为明显。
对于病毒，从两组对照组的检出reads上看，预混的阳性质控品的病毒滴度过低，各种病毒均只能检出1条或者完全检不出。但0.22％皂苷处理却能使乙肝病毒的检出reads数提高174.2553倍，而其他几种病毒则没有类似效果。考虑到同为DNA病毒的BK多瘤病毒的原液本身滴度就不高，所以阳性质控品中BK多瘤病毒的滴度极低，导致完全检不出，而丙肝病毒和登革热病毒均为RNA病毒，检测限势必更高。从结果可以看出皂苷对DNA病毒，至少乙肝病毒有一定效果，这是在预期之外的，其具体原因需要再讨论并设计实验确定，可以考虑提高病毒滴度进行验证。
