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一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法

2023-01-05 14:49:31

一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法

  技术领域

  本发明涉及分子生物学技术领域,更具体地,涉及一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法。

  背景技术

  染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture,3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术,可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息,此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获,并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来,在第二代测序技术的迅速发展下,由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象,研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中,以整个细胞系为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛,贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的,在连接前,使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后,提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断,最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后,如果一对序列对应于不同的n段酶切片段,那么就认为这两个片段之间有n次相互作用,从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。

  常规的植物Hi-C高通量测序建库以植物叶片组织作为研究对象,其染色质环境相对海洋藻类较单一,更容易获得比较好的结果,但是限制了其使用范围,距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如海洋藻类不同于叶片组织,其复杂的细胞壁结构不能用单纯裂解细胞的方式释放细胞核。同时,试验发现,采用现有技术处理海洋藻类样本时,细胞核无法释放完全,同时内源多糖、多酚、矿物质影响后续酶切反应效果,从而影响文库数据的有效性。因此有必要开发一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法。

  发明内容

  针对现有技术中存在的技术问题,本发明通过大量实验对比分析,提出了一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法,该方法通过设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法,解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题,实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。

  为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:

  一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法,包括如下步骤:

  1)对海洋藻类样品进行甲醛交联;

  2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联物料,释放并收集细胞染色质;

  3)percoll纯化细胞染色质;

  4)纯化后的染色质依次经SDS灭活内源酶、MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切物料;

  5)酶切物料依次经粘性末端补平、分子内连接获得分子内连接物料;

  6)解交联分子内连接物料并纯化,打断纯化后的DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。

  进一步地,所述甲醛交联步骤包括:将海洋藻类样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联,孵育结束后加入甘氨酸终止交联。

  进一步地,所述percoll纯化步骤为:

  1)取2mL 2.5M蔗糖、5mL percoll溶液和1mL NIB重悬的细胞核悬液于离心管中;所述percoll溶液由NIB裂解液稀释,质量浓度为30%;

  2)3000g离心30min,取percoll层3.5-6.5mL溶液;

  3)用NIB裂解液稀释步骤2)的溶液3-5倍后,2500g离心5min,弃上清。

  进一步地,所述灭活内源酶的步骤包括:

  1)重悬percoll纯化后的沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管添加1.5μL20wt%的SDS溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;

  2)依次65℃ 900rpm孵育10min、37℃ 900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。

  更进一步地,灭活内源酶未反应的SDS采用Triton X-100中和,SDS中和的具体方法为:向步骤2)中获得的灭活内源酶体系中添加400μL的1×NEBuffer 2.1和70μL的20wt%TritonX-100,重悬细胞碎片,37℃950rpm震荡15min。

  进一步地,所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL,所述酶切反应条件为:900rpm,37℃孵育4h。

  进一步地,所述步骤5)中末端补平的反应体系包括以下用量的各组分:酶切物料500μL、NE Buffer 2.1(10×)10μL、10mM dATP 2.0μL、10mM dGTP 2.0μL、10mM dTTP 2.0μL、5mM biotin-14-dCTP 4.0μL、灭菌水65μL、5U/μL Klenowpolymerase 15μL。

  进一步地,所述步骤5)中分子内连接反应体系包括以下用量的各组分:10%TritonX-1001mL、10×T4 ligationbuffer 1mL、BSA(10mg/mL)100μL、H2O 7.85mL、5U/μLT4DNAligase 50μL。

  进一步地,所述步骤6)中纯化反应体系包括以下用量的各组分:解交联物料1μg、10x NEBuffer2.110μL、10mM dATP 1μL、3U/μLT4 DNAPolymerase 1.67μL、水85.33μL;所述纯化反应条件为:12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应。

  进一步地,所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。

  与现有技术相比,本发明的有益效果在于:

  (1)本发明提出的一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法,该方法针对海洋藻类细胞的特殊结构,设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法,使分析阶段背景噪音干扰显著减少,同时也解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题,实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的建库方法操作流程简便,可以复制到其他具备分子生物学基础的其他实验室。

  (2)本发明的建库方法增加了percoll纯化细胞核步骤,较传统Hi-C方法,显著提升了细胞核的纯度,减少了多糖、多酚及矿物质对于Hi-C建库过程中酶活的影响,此方法可以显著改善杂质对实验结果及分析过程造成的影响。

  (3)本发明的建库方法在细胞壁裂解步骤中,通过梯度条件摸索,得到了细胞壁裂解效果好、基因组完整性相对较好的破壁条件。

  (4)本发明的建库方法在内源酶灭活和SDS中和步骤上,较传统Hi-C方法,显著缩短了反应时间和提高了灭活效果;尤其针对杂质含量多的海洋藻类样品,此方法可以显著降低杂质多对实验结果及分析过程造成的影响;内源酶灭活体系上采用小体系灭活、大体系中和的原则,提高了样品的灭活效果;

  (5)在工具酶的选择上,选用适用性较广的MboI,整个反应体系全部可以使用NEBBuffer 2.1,省去了传统Hi-C方法频繁更换缓冲液体系的步骤,大大简化了操作步骤,MboI是四碱基酶,较传统方法的六碱基酶,提高了酶切的分辨率。

  (6)本发明构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。

  附图说明

  图1为本发明的适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法流程图。

  图2为实施例1鉴定紫菜基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。

  图3为实施例1构建的紫菜文库大小分布结果示意图。

  图4为对比例使用传统Hi-C方法鉴定紫菜基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。

  具体实施方式

  展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例,且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

  实施例1:

  本实施例以紫菜为研究对象,对新鲜叶片进行甲醛交联、裂解细胞核、percoll纯化细胞核、释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断,最后进行文库构建。本发明的适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法如图1所示。

  1、甲醛交联

  利用甲醛变性蛋白的能力,将海洋藻类样本加入一定浓度的甲醛交联固定蛋白,使得染色体的互作形态被固定下来;然后甘氨酸中和甲醛,终止交联。

  具体操作方法如下:

  1)取0.5g紫菜叶状体,剪成约0.5cm大小的碎片装入50mL离心管,并于离心管中加入预冷的35mLNIB裂解液(反应前加入35μL巯基乙醇和35μL 100mM PMSF)和2mL约37%的甲醛溶液(终浓度2wt%),冰上抽真空40min。

  2)加入7.5mL 2.0M甘氨酸并在真空下处理5min终止交联。

  3)去除溶液并用灭菌超纯水清洗2-3次,灭菌滤纸完全擦干叶片上的水;

  4)交联好的组织在-80℃冻存,可干冰运输。

  2、裂解、细胞核纯化及酶切

  液氮研磨交联物料10min至样本呈沙粒状后,用裂解液并行裂解研磨后物料,使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞核;细胞核进行percoll化,纯化后的细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料。

  1)准备研钵,纯水洗净,使用锡箔纸包裹,倒入酒精,烧5min,室温放凉,研钵中加入液氮预冷,将保存的交联组织倒入盛有液氮的研钵中,迅速磨碎样本(样品不要磨太碎,太碎容易降解,影响后续实验)。

  2)液氮研磨的样本装入-80℃预冷的空50mL离心管中,留存于-80℃冰箱或置于干冰中运输。

  3)把磨碎的紫菜样本加入50mL预冷的NIB裂解液(反应前加入50μL巯基乙醇和1片蛋白酶抑制剂),置于冰上,摇床上混匀15min。

  4)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上,过滤样本,滤液置于离心管中。

  5)4℃ 3000g离心15min收集裂解物;弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer2.1;4℃ 2500g离心5min,弃上清。

  6)15mL离心管中加入2mL 2.5M蔗糖,再加入5mL NIB裂解液稀释的30wt%percoll溶液,最后加入1mL NIB重悬的细胞核悬液。

  7)3000g离心30min,取percoll层3.5-6.5mL溶液;

  8)用NIB裂解液将上步得到的溶液稀释3-5倍后,2500g离心5min,弃上清。

  9)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加1.5μL20wt%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫。

  10)依次65℃ 900rpm孵育10min、37℃ 900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。

  11)中和SDS:添加400μL的1×NEBuffer 2.1、70μL的20wt%Triton X-100每管至终浓度3wt%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min。

  12)每管加入150U限制性内切酶(MboI,5000units/mL),900rpm 37℃4h(终体积530μL)。

  3、末端补平

  1)瞬时离心去除管盖液体;

  2)每管加入以下试剂,终体系600μL;生物素补平体系如表1所示:

  表1

  

  

  3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积700μL),混匀后,37℃孵育2h。

  4.分子内连接

  1)DNA分子内连接反应,分子连接体系如表2所示:

  表2

  

  2)每管加入10mL以上混合液于冰上放置的15mL离心管。

  3)转移每个Hi-C反应体系至上述15mL离心管,轻柔颠倒混匀。

  4)16℃孵育连接反应4h,每小时颠倒混匀。

  5、解交联

  1)每管加入20μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃过夜。

  2)将反应混合液冷却到室温,转移每个反应至一个50mL离心管,一倍氯仿分离回收上清,加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min,两次75vol%乙醇清洗(弹起沉淀),吹干,回收产物溶解在50μL EB,通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA。Qubit测定浓度,大约20-100ng/μL为正常浓度范围。(store at-20℃);

  3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。图2表明:本实施例得到的DNA为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾;酶切效果明显,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。

  6.末端去生物素

  1)取3μg解交联样品1×Ampure XPbeads纯化后Qubit测定浓度。

  2)取1μg样品用于末端去生物素,去生物素体系如表3所示。

  表3

  

  4)12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应。

  7、DNA打断

  1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右,超声选择400bp程序90s进行1次。

  2)1×Ampure XP beads回收DNA,溶解于52μL Tris,Qubit测定浓度大约10ng/μL左右为正常浓度范围。

  8、Illumina试剂盒建库

  1)Illumina建库试剂盒(NEBNext Ultra DNALibrary Prep Kit for Illumina)补平末端并+A及+Adaptor;

  2)使用Illumina建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤,回收+Adaptor后的DNA。

  9、生物素捕获

  生物素捕获使用试剂盒(MyOneTM Streptavidin C1,ThermoFisher),操作过程按照试剂盒说明书执行。

  10、Illumina试剂盒扩增嵌合片段

  1)Illumina试剂盒建库(100μL,PCR至6cycles,分别取3微升摸索循环数6、8、10、12cycles),选取能扩增出足量产物的最低循环数。

  2)1.5%agarose凝胶回收400-600bp条带。

  3)回收产物对文库大小分布进行检测,检测结果如图3所示。图3表明,文库大小集中在400-600bp之间,与凝胶回收预期范围一致。文库大小合适、分布均匀,可以进行高通量测序。

  11、对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤。

  表4本专利Hi-C方法对紫菜进行实验数据分析结果说明

  

  对比例:

  本实施例以紫菜为研究对象,使用传统Hi-C方法(CN201811086366.X)进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断,最后进行文库构建,具体实验过程参考专利CN201811086366.X。通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果,琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示,图4表明:紫菜叶状体的完整基因组DNA条带明显无拖尾;酶切效果明显,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。

  对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤:

  表5传统Hi-C方法对紫菜进行实验数据分析结果说明

  

  注:为SE(Single End)数据,其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括,valid pair,single side,selfcircles,dangling ends及unmapped等类型。其中:valid pair是指符合Hi-C实验预期,由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段;single side是指,仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段;selfcircles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA,它主要由单一酶切片段两端相连接,经超声波打断,捕获并测序产生;dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段,它源自未经过连接反应,最终却被捕获测序产生的数据;unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中,仅validpair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此,非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。

  结果分析:

  基于表4和表5的数据分别计算实施例与对比例测序的酶切率、dangling ends比例、extra dangling ends比例,计算结果如表6。

  表6实施例与对比例结果对比情况

  表6的数据显示实施例的酶切率显著高于对比例,实施例的dangling ends率、extra dangling ends率显著低于对比例,该结果表明本发明要求保护的建库方法用于海洋藻类的HI-C建库时,裂解得到的细胞核更干净,限制性内切酶工作效率更高,建库时获得的无效信息更少,从而使分析阶段背景噪音干扰显著减少。从有效数据率来看,本发明的方法能够成功用于海洋藻类的HI-C高通量测序建库。

  因此,本发明提出的一种适用于海洋藻类的Hi-C高通量测序建库方法,该方法通过设计合适的细胞壁去除方法、细胞核纯化方法,解决了海洋藻类细胞壁厚难释放细胞质、海洋藻类样品建库效果差的技术问题,实现了海洋藻类的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。

  以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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