对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)节要求2017年3月14日提交的Yushen Du、NicholasC.Wu和Ren Sun的题为“GENOME-WIDE IDENTIFICATION OF IMMUNE EVASION FUNCTIONS INA VIRUS AT AMINO ACID RESOLUTION AND RATIONAL DEVELOPMENT OF IMMUNETHERAPIES-REDUCTION TO PRACTICE WITH ANTI-INTERFERON FUNCTIONS ONINFLUENZAVIRUS”，(2017-515-1)的共同未决且常规指定的美国临时专利申请序列第62/471,269号的权益；该申请通过引用并入本文。
序列表
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技术领域
本发明涉及用于增强免疫应答和/或制备药物组合物的系统和方法。
发明背景
大多数病毒快速地适应多种选择压力，这对部署安全并且有效的疫苗提出了挑战。例如，流感病毒的特征是跨越多种亚型的大遗传多样性和快速的抗原漂移和转变，这对于传统的疫苗策略带来了问题。病毒的减毒或失活倾向于降低免疫应答的强度和广度，无法产生有效的针对抗原变化的保护(1-3)。先前的流行病和最近的流感爆发突出了开发引发有效免疫应答并且赋予广泛保护的安全疫苗的需要。甲型流感病毒野生型WSN/1933(H1N1)毒株在本领域是熟知的，并且完整序列可在参考文献(51)中找到。
I型干扰素(IFN)系统是先天免疫应答的主要组分(4-6)。IFN应答通过诱导数百个IFN-刺激的基因(ISG)(其中的许多具有抗病毒活性)的表达提供针对病毒感染的第一道防线(7)。IFN应答对于树突细胞成熟、B细胞和T细胞的发育、和记忆形成、连接先天免疫和适应性免疫也至关重要(8-12)。大多数病毒已经进化到有效地抑制IFN的产生和功能以允许体内复制。去除流感病毒中表征最充分的IFN调节物-即NS1蛋白-已经在1/2期临床试验中显示出疫苗候选物(delNS1)的前景(14，15)。虽然研究已经表明除NS1之外的流感病毒蛋白具有IFN-调节功能(16，17)，但全基因组鉴定和消除IFN-调节功能而不影响病毒体外复制适合度(replication fitness)仍然是有挑战性的任务。
发明概述
免疫疗法中使用的常规疫苗和/或病毒载体通常从天然分离物构建或使用现有知识再生。如下文详细讨论的，我们已经发现并且开发了一种不同的用于疫苗开发的方法，该方法涉及系统性地鉴定疫苗中使用的病原体基因组(例如，病毒诸如流感)的免疫逃逸功能，并且然后消除免疫逃逸功能同时维持或调节病毒基因组的复制适合度。虽然甲型流感被用作本发明的说明性工作实施方案，但该方法广泛适用于在各种各样的病原体中开发疫苗。
我们的方法的实施方案使用系统性高通量诱变系统来实施以揭示跨越病毒基因组(甲型流感)的潜在IFN敏感突变。该诱变系统可以产生具有氨基酸或核苷酸分辨性的综合信息，该综合信息能够促进具有期望的特性的新型载体的构建。此外，可以进行多次筛选以鉴定其他增强产品的特性的突变/特征。在这种情况下，通过控制病毒基因组中的突变的组合，可以对复制/免疫应答权衡(trade-off)进行微调以在病毒基因组作为疫苗或作为治疗剂被施用时实现期望的效率和安全性。在使用流感病毒的本发明的说明性实施方案中，仔细地选择的核苷酸突变的组合产生的发明出乎意料地能够刺激升高的抗体应答，而同时在体内被高度减毒，因为这些突变造成病毒复制被抑制。
在本发明的针对甲型流感病毒基因组的说明性实施方案中，核苷酸突变的组合使用遗传学系统来工程化。在该说明性工作实施方案中，本发明提供了一种单核苷酸分辨率高通量遗传学方法，该方法同时地测量/分析(profile)甲型流感病毒基因组中＞50％的核苷酸位置处的突变在不同条件下对适合度的影响。应用该方法，我们已经通过测量在干扰素存在或不存在下的病毒适合度来系统性地鉴定了跨整个流感A/WSN/33基因组的抗干扰素功能残基。特别地，我们鉴定并且验证了跨流感A/WSN/33基因组的干扰素敏感突变，并且验证了在与干扰素系统相互作用的PB2和M1处的突变簇。除了NS1之外，干扰素敏感突变还存在于大多数区段(segment)上。在PB2和M1处的突变簇可以诱导较高的干扰素产生。通过将多个突变组合在一起(例如，通过将PB2、M1和NS1上的多个突变组合)，我们产生了干扰素高度敏感株作为减毒活疫苗候选物，我们称其为高干扰素敏感(HIS)病毒株(在一个或更多个实例中，也称为DAI-1(抗干扰素缺陷)株，DAI-1在于2017年3月14日提交的优先权美国临时专利申请序列第62/471,269号中被提及)。HIS毒株可以在干扰素缺陷的细胞系(例如，Vero细胞)和小鼠(例如，干扰素缺陷型小鼠，诸如IFNRA-/-小鼠)中有效地复制。尽管HIS在正常细胞中被减毒并且在野生型小鼠(BALBc)中被高度减毒，但HIS仍然在小鼠中产生了出乎意料和预料不到地稳健的抑制野生型流感病毒的攻击感染的抗体应答和T细胞应答。
此外，由于多个突变的组合可以位于不同的基因区段中并且对于病毒复制大多是中立的，无需干扰素选择，所以由于新发生突变(de novo mutaiton)或基因分配(geneassortment)导致回复体的风险大大降低。
本文描述的方法广泛适于制备可用作疫苗和/或治疗剂和/或药物组合物的遗传工程化的病原体。包含根据本文描述的一种或更多种方法遗传工程化的病原体的治疗剂对于感染了药物耐受性病毒的患者将是特别有用的。
从以下详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将对本领域技术人员变得明显。然而，将理解的是，详细描述和特定实例虽然指示了本发明的一些实施方案，但是是通过说明性而非限制性的方式给出的。可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，而不偏离其精神，并且本发明包括所有这样的修改。
附图简述
图1使用定量高通量基因组学鉴定IFN-敏感性突变。(A)跨流感A/WSN/33基因组的单个突变在具有IFN选择(右)和没IFN选择(左)的A549细胞中的相对适合度(RF)评分。(B和C)用PB2蛋白[蛋白数据库(PDB)ID，4WSB](38，39)作为实例鉴定IFN敏感突变。红色和橙色分别代表强和中等的IFN敏感性。(D)用单独地重建的突变体验证IFN敏感性(n＝4)。非表面病毒体蛋白上的前8个突变以黑色示出。(E)用WT病毒或指示的突变体感染的A549细胞在感染后6小时的IFN-β表达的诱导，模拟感染作为对照(Ctl)(n＝3)。误差线，SD。*P＜0.05，**P＜0.01[双尾t检验，与WT(D)或与Ctl(E)相比]。氨基酸残基的单字母缩写如下：A，Ala；C，Cys；D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；和Y，Tyr。
图2HIS病毒中的突变的组合增加IFN敏感性和IFN产生。(A和B)WT、NS1突变体和HIS病毒在A549(A)和Vero(B)细胞中的复制动力学。(C)WT、NS1突变体和HIS病毒的IFN敏感性(n＝4)。(D)指示的病毒在A549细胞中在感染后6小时对IFN-β表达的诱导，模拟感染作为Ctl(n＝3)。(E)用指示的病毒感染的A549细胞中的全面基因表达通过RNA测序检查(n＝2)。热图显示出HIS感染的细胞中与模拟感染的细胞相比显著差异化表达的基因。IFN应答基因用黑色条标记于左侧。(F)HIS感染的细胞中与模拟(上)或WT感染(下)的细胞相比被上调的基因的GO富集分析。(G)原代人类肺泡巨噬细胞(AM)、人类肺泡上皮细胞(AEC)、人类小气道上皮细胞(HSAEC)和人类支气管上皮细胞(HBEC)被指示的病毒感染后6小时对IFN-β表达的诱导，模拟感染作为Ct1(n＝3)。(H)原代人类AM在感染后6小时对指示的ISG和炎性细胞因子的诱导(n＝3)。(I)对指示的ISG的诱导。误差线，SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001[具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)]；n.s，不显著。
图3HIS病毒在体内是复制缺陷的并且诱导瞬时IFN应答。(A和B)在鼻内感染后的存活率和体重减轻的百分比(n＝5)。(C和D)在感染后第2天WT病毒和HIS病毒在小鼠肺组织中的病毒滴度(n＝4)(C)和复制动力学(n＝3)(D)。(E)在感染后6小时、24小时、48小时和120小时(h)小鼠肺组织中对指示的ISG的诱导(n＝3)，显示为相比于模拟感染的诱导倍数。RNA酶H，核糖核酸酶H。(F)小鼠肺组织中指示的炎性细胞因子的基因表达通过RNA测序检查(n＝2)。(G)在感染后第9天的肺组织的HE(苏木精和伊红)染色。粗箭头，细支气管；细箭头，血管；红色三角形，炎性细胞浸润。(H)在感染后第9天BAL细胞涂片(cytospin)中的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的百分比(n＝3)。(I)通过Luminex多重测定测量的BAL样品中的细胞因子(n＝4)。(J)指示的病毒在IFNAR-/-小鼠的肺组织中的复制(n＝4)。(K)雪貂(ferret)鼻洗液、气管和肺组织中的WT和HIS病毒的病毒滴度(n＝3)。虚线代表检测限值。(L)示出了指示的病毒在肺组织中的病毒滴度。用105TCID 50的指示的病毒对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠鼻内感染，在感染后2天提取小鼠肺组织(N＝3)。(M)指示的病毒在IFNAR-/-小鼠中的复制。用105TCID 50的指示的病毒对IFNAR-/-小鼠鼻内感染，在感染后2天提取小鼠肺组织(N＝3＝每组小鼠的数目)。(G)检查用WT或HIS病毒感染6h或24h的小鼠肺样品的指示的ISG的诱导。(N)用1uminex多重测定检查在感染后第2天收集的BAL样品的指示的细胞因子的诱导(N＝3)。误差线，SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001[对数秩检验用于(A)；具有Bonferroni多重比较检验的ANOVA用于(C)、(H)和(J)；和双尾t检验用于(D)、(E)、(I)和(K)]。
图4HIS病毒在小鼠和雪貂中诱导强的适应性免疫应答。(A至D)在疫苗接种后第28天小鼠血清中的HA-结合IgG(n＝7)、HA中和抗体(n＝7)和NP-和NA-结合IgG(n＝4)。HAI，血凝素抑制。(E)在疫苗接种后第28天的BAL样品中的HA-结合IgA(n＝4)。ELISA的光密度(OD)为450nm。(F)在疫苗接种后第22天的雪貂血清中的HA中和抗体水平(n＝3)。虚线代表检测限值。(G)未被小鼠血清中和的突变(红色)被映射到HA结构上(PDB ID，1RUZ；n＝5)(40)。其他五种颜色代表五个良好表征的中和表位。(H)在疫苗接种后第10天的小鼠肺(左)和脾(右)中的抗原特异性CD8 T细胞的四聚体染色(n＝10)。(I)小鼠肺和脾中的抗原特异性记忆前体效应细胞的百分比(n＝3)。(J)在来自用指示的病毒疫苗接种的小鼠的肺组织中的再次应答期间的NP抗原特异性CD8 T细胞(n＝4)。(K)由指示的病毒诱导的CD4T细胞的细胞内IFN-γ染色(n＝3)。(L和M)在初次(n＝5)(L)或再次(n＝4)(M)应答期间，NP抗原特异性CD8 T细胞的TCRβ序列的克隆性。(N)箱形图显示出T细胞表位或抗体表位上的突变的适合度分布。(O&P)来自感染的小鼠血清的特异性HA结合IgG(O)和中和抗体(P)通过ELISA和血凝素抑制(HAI)测定检查。用105TCID 50的指示的病毒对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠鼻内感染(N＝7)，在感染后第28天获得血清。血清被热失活用于HAI测定。(Q)来自感染的小鼠血清的特异性NP结合IgG通过ELISA检查(N＝4)。(R)初次T细胞应答通过流式细胞术与四聚体染色检查。用105TCID50的指示的病毒对雌性C57/B6小鼠鼻内感染(N＝5)。单细胞悬浮液从感染后8天提取的肺和脾组织制备。红细胞用ACK裂解缓冲液裂解。对100万个细胞用CD3、CD8和具有H-2Db+甲型流感病毒NP366-374(NPP，ASNENMETM)和H-2Kb甲型流感病毒PB1703-711(SSYRRPVGI)的四聚体复合物进行流式细胞术分析。(S)显示出在疫苗接种后进行攻击感染的TCID50。用105TCID50的指示的病毒对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠鼻内疫苗接种(N＝4)。在疫苗接种后28天，用105TCID50的WT病毒攻击小鼠。在攻击后2天时提取肺组织。病毒滴度使用A549细胞通过TCID50测定测量。虚线代表TCID50测定的检测限值。误差线，SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001[具有Bonferroni多重比较检验的ANOVA用于(A)至(D)、(F)、(H)、(J)和(K)；双尾t检验用于(I)、(L)和(M)；而Wilcoxon秩和检验用于(N)]。
图5HIS病毒保护小鼠和雪貂免受广泛的病毒攻击。(A和B)在攻击后第2天小鼠肺组织中的病毒载量(n＝4)。DV，用HIS病毒以1×104TCID50两次疫苗接种，间隔28天；HD，用HIS病毒以1×106TCID50高剂量疫苗接种。虚线代表检测限值。(C)在疫苗接种后第35天在WSN病毒攻击后的雪貂鼻洗液中的病毒复制动力学(n＝3)。(D和E)HIS疫苗接种的小鼠在用同源株和异源株攻击后的存活率和体重减轻(n＝10)。(F)在疫苗接种后35天在A/California/07/09病毒攻击后的雪貂鼻洗液中的病毒复制动力学(n＝3)。误差线，SD。*P＜0.05，***P＜0.001[具有Bonferroni多重比较检验的ANOVA用于(A)和(B)，双尾t检验用于(C)和(F)，和对数秩检验用于(D)]。
图6：疫苗开发方法的实验设计和原理
流程图显示出我们的疫苗开发方法的实验设计和原理。通过开发定量高通量基因组学系统(18，19，59-61)，我们能够测量病毒基因组中的单核苷酸突变在不同选择条件下对表型的影响。我们将由病毒蛋白编码的抗IFN功能区域与病毒复制必需的那些功能区域分开，并且系统性地鉴定了病毒基因组上的IFN敏感突变。通过将多个突变组合，我们产生了减毒活疫苗候选物：高干扰素敏感(HIS)病毒。该方法同时满足对于疫苗的安全性、效力和生产的要求(14，62)。
图7：跨整个流感基因组的单核苷酸突变文库的构建(A)定量高通量基因组学系统及其用于系统性地鉴定IFN敏感突变的示意图。(B)覆盖整个流感A/WSN/33基因组的52个质粒文库的布置。每个质粒文库建立在长度为240bp的片段上并且包含～1000个不同的点突变。(C)突变体文库重建和选择程序(19，36，37)的示意图。3000万个293T细胞用每个小质粒文库与七个其他野生型质粒一起转染以重建突变体病毒文库。然后，1500万个A549细胞以0.05的MOI感染24h以将突变体病毒文库传代。对于转染和感染步骤都检查了生物学重复。通过Illumina MiSeq对转染和感染后的突变体质粒文库、突变体病毒文库以250bp成对末端读段(reads)进行高通量测序。
图8：来自独立生物学重复的相对适合度评分(RF评分)的相关性。生物学重复的RF评分之间的相关性用散点图示出。对每个病毒区段单独地进行突变体文库的重建和选择。获得了生物学重复之间的RF评分的强相关性。区段2、3和7未经IFN选择的突变体RF评分先前已被报道(21-23)，并且被本研究使用。将每个突变体的最后RF评分计算为重复之间的平均值。
图9：高通量适合度分析的验证(A)同义突变和无义突变的RF评分的直方图。同义突变的RF评分集中在1左右(log10 RF评分集中在0左右，平均值＝-0.08，V＝0.27)，表明大多数同义突变对于病毒复制是中立的。在同义突变和无义突变之间观察到清楚的分布分离，表明在病毒突变体文库的传代期间的有效选择。(B)随机地选择跨基因组的具有各种各样的RF评分的26个单核苷酸突变。在整个病毒的情况下对突变体单独地进行重建。每个突变体的相对生长能力通过TCID50测定检查并且与适合度分析中的RF评分比较。由于7个突变体的TCID50低于检测限值(在线性标度中绘制为0)，散点图以线性(左)标度和对数(右)标度二者示出。单独地重建的突变体病毒的相对生长与适合度分析数据良好相关。
图10：错义突变的适合度分布。示出了所有单核苷酸错义突变的适合度效应分布(DFE)。使用同义突变作为基准，我们指定如果RF评分＜平均值-2V，则突变是有害的，如果RF评分＞平均值+2V，则突变是有益的，并且如果RF评分在平均值-2V和平均值+2V之内，突变是几乎中立的。跨整个病毒基因组，大约50.7％的错义突变是有害的并且仅1.5％是有益的。
图11：潜在IFN敏感突变的鉴定。示出了对在PB1、PA、NP和M1上选择的可能的IFN敏感突变的验证。PB2和NS1上的突变在图1C和S7中示出。因为HA和NA是高度可变的并且NS1已经被广泛研究(16，63-66)，所以关注的是非表面病毒体蛋白(PB2、PB1、PA、NP、M1和M2)。推定的IFN敏感突变以橙色和红色突出。区段2、5和7的橙色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.2的RF评分的突变；区段2、5和7的红色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.1的RF评分的突变。区段3的橙色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.3的RF评分的突变；区段3的红色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.2的RF评分的突变。将对应的残基以相同的颜色映射到蛋白结构(PDB：4WSB，2IQH&1EA3)上(38-40，48-50)。我们优先地选择簇集在蛋白表面上的IFN敏感突变用于验证。每个区段高达7个突变被选择用于实验验证。
图12：建立用于突变体病毒文库的干扰素选择的条件(A)测量了I型IFN(IFN-D2)对WT WSN病毒复制的剂量应答曲线。A549细胞用不同剂量的IFN-D2预处理20h，并且用WT病毒以0.1的MOI感染。细胞在感染后2h用PBS洗涤两次并且向细胞提供相等浓度的IFN-D2。在感染后24h收集上清液并且通过实时PCR测量病毒拷贝数。选择1000U/ml IFN-D2作为用于筛选的浓度，所述浓度为IC80。(B)标记了在干扰IFN通路中具有功能作用的NS1蛋白的已知残基及其对应的突变(26，27，67)。我们将RNA结合结构域中的R37、Q40、K41、R46和K62鉴定为干扰IFN功能的关键残基。然而，在具有已知抗IFN功能的残基(诸如R38、E96和E97)处的一些突变未被鉴定为最佳IFN敏感的突变，指示我们的筛选结果中存在假阴性。(C)推定的在NS1上鉴定到的IFN敏感突变以橙色和红色突出(PDB：4OPH)(68)。橙色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.3的RF评分的突变；红色：在没有IFN的情况下具有＞0.7的RF评分并且在具有IFN选择的情况下具有＜0.2的RF评分的突变。(D)分析结果用在NS1上单独构建的突变体病毒进行验证。先前报道的双突变(R38A/K41A)被用作阳性对照。误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(双尾t-检验，与WT相比)。
图13：用单独突变体病毒对IFN敏感性的验证(A)选择的IFN敏感突变体的病毒复制能力。病毒通过将包含单个突变的质粒与编码其他野生型蛋白的7个质粒一起共转染来重建。用指示的突变体以0.1的MOI感染A549细胞。在感染后24h收集上清液并且病毒滴度通过TCID50测定测量。所有突变体对于病毒复制是中立或几乎中立的(N＝2)。(B)对于聚合酶复合物蛋白中的单个突变的相对聚合酶活性(N＝3)。大多数突变体显示出几乎完整的聚合酶活性。误差线指SD。
图14：IFN敏感突变体在体外诱导IFN产生
(A)对于用IFN预处理的细胞，IFN-E表达的诱导更显著。A549细胞在感染前用1000U/ml IFN-D2预处理20h或不处理。然后用WT或指示的突变体以1的MOI感染细胞。在感染后6h提取RNA。IFN-E基因表达通过实时PCR定量并且计算为与WT感染的细胞相比的诱导倍数(N＝3)。误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(双尾t-检验)。(B&C)。示出了WT和指示的突变体对ISG54表达的诱导(N＝3)。以1的MOI感染A549细胞。在感染后6h提取RNA。ISG54基因表达通过实时PCR定量并且显示为针对模拟感染的细胞(Ctl，B)或实际CT数(C)(69)归一化的诱导倍数。误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(双尾t-检验，与Ctl相比)。
图15：在用WT或指示的突变体感染后的IRF3的核易位通过免疫荧光分析检查。以1的MOI感染A549细胞。在感染后8h将细胞固定并用针对IRF3蛋白的抗体进行免疫荧光分析(IFA)。PB2上的三个突变(N9D、Q75H、T76A)和M1上的三个突变(N36Y、R72Q、S225T)，但不是WT，显示出IRF3清楚的核定位，指示它们在IRF3的上游与IFN通路相互作用的功能。
图16：MAVS是PB2和M1突变体诱导高水平IFN-E所必需的。在STING或MAVS敲除的THP1细胞中检查了对ISG54表达的诱导。稳定过表达Cas9蛋白的THP1细胞被用作对照。用WT或指示的突变体以1的MOI感染细胞并且在感染后6h提取RNA。ISG54基因表达通过实时PCR定量并且计算为针对WT感染的细胞归一化的诱导倍数(N＝3)。误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(双尾t-检验，与对应细胞类型的WT感染相比)。
图17：HIS病毒诱导的IFN产生(A)指示的病毒在感染后6h对A549细胞中中的IFN-β表达的诱导，模拟感染作为Ct1(N＝3)。显示了实时PCR分析的实际CT数。(B)在用WT、NS1突变体或HIS病毒感染后1h、2h和4h检查对IFN-E表达的诱导(N＝3)。(C)指示的ISG表达的诱导。用WT或HIS病毒以0.1的MOI感染THP1细胞。在感染后24h提取RNA。基因表达通过实时PCR定量并且计算为与模拟感染的细胞相比的诱导倍数(N＝3)。(D)A549细胞中通过RNA测序定量的指示的病毒区段的每百万平均读段(RPM)(N＝2)。(E)在用指示的病毒感染后的细胞存活力。用指示的病毒以0.1的MOI在96孔板中感染A549细胞72h。细胞存活力通过CCK8测定检查(N＝3)。(F&G)检查PR8背景下的HIS病毒的相对IFN敏感性(F)和IFN-E诱导(G)(N＝3)。相同的8个突变(PB2：N9D、Q75H、T76A，M1：N36Y、R72Q、S225T，NS1：R38A、K41A)通过反向遗传学系统引入PR8中。PR8背景下的HIS病毒显示出与WT PR8或NS1突变体(R38A/K41A)相比更高的IFN敏感性和IFN-E诱导。对于所有的图，误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA))。
图18：对WSN毒株中的冷适应(CA)病毒WSN-CA的表征(A)示出了在不同温度下评估的WT和WSN-CA病毒的病毒滴度。用指示的病毒以0.1的MOI感染A549细胞并且在感染后72h收集上清液。病毒滴度通过TCID50测定确定(N＝3)。(B)用WT或指示的突变体感染的A549细胞中的IFN-β表达的诱导通过实时PCR检查，模拟感染作为对照(Ctl)(N＝3)。对于所有图，误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(双尾t-检验用于图A并且具有Bonferrohi多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)用于图B)。
图19：具有产生IFN的能力的(IFN-competent)小鼠中的HIS病毒的复制和细胞因子的诱导(A&B)对于指示的病毒，肺组织中的病毒滴度作为相对拷贝数显示出。用1×104TCID50的指示病毒对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内感染。在感染后第2天收获肺组织(N＝3)。病毒拷贝数通过实时PCR检查并且针对WT感染的小鼠归一化。虚线代表检测限值。(C)在感染后第2天的肺组织的HE染色。(D)上皮完整性通过在感染后第2天收集的小鼠BAL样品中的白蛋白浓度检查(N＝4)。WT感染的小鼠显示出比HIS或模拟感染的小鼠显著更高的白蛋白浓度，而HIS未引起肺完整性的显著损失。(E&F)BAL细胞涂片显示出WT或HIS感染的小鼠在感染后第2天的指示的细胞类型的百分比(E)和数目(F)。(G&H)在感染后第2天(G)和感染后第9天(H)，在HE染色载玻片上对肺的病理学评分定量。对于每只小鼠，对4-5个区域取平均值(N＝4)。(I)BAL细胞涂片显示出WT或HIS感染的小鼠在感染后第9天的指示的细胞类型的数目(N＝3)。(J)通过Luminex多重测定检查在感染后第2天收集的BAL样品的指示的细胞因子的诱导(N＝4)。显示出WT、HIS或模拟感染的小鼠BAL样品中的每种细胞因子的浓度。(K)使用VeriKine小鼠干扰素αELISA试剂盒确定在感染后的第2天BAL样品中的IFN-D的浓度(N＝4)。对于所有的图，误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001(具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)用于图A，双尾t-检验用于图B、D-F、I&J，Mann-Whitney U检验用于图G&H)。
图20：通过HIS疫苗接种诱导的抗体应答。(A)疫苗接种的小鼠的血清中的中和抗体。用1×104TCID50的指示的病毒对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内感染(N＝4)。获取感染后第28天的血清并且热失活用于中和抗体测定。(B&C)通过ELISA(B)和血凝抑制(HAI)测定(C)在指示的时间点检查疫苗接种的小鼠血清的HA特异性IgG和HA中和抗体(N＝3)。以下来自四种不同病毒株的HA蛋白被纯化并且用作用于IgG结合的靶：WSN/H1、PR8/H1、HK68/H3和Viet04/H5(60)。WT和HIS感染的小鼠引发针对同一HA组(PR8/H1、Viet04/H5)内其他毒株的抗体应答，但不跨越不同的HA组(HK68/H3)引发。与WT疫苗接种的组相似，HIS免疫的小鼠中的HA抗体滴度从疫苗接种后第14天、第21天至第28天稳定地增加。(D)在感染后21天通过HAI测定检查疫苗接种的小鼠血清中的HA中和抗体(N＝3)。HIS诱导比失活的WT或失活的HIS病毒更高水平的HA中和抗体。(E)通过ELISA检查在感染后第28天小鼠血清中的M1特异性IgG抗体(N＝4)。(F)通过ELISA检查在感染后第28天的BAL样品中的NP特异性IgA抗体(N＝4)。(G)在感染后15天、22天和50天通过HAI测定检查疫苗接种的雪貂的血清中的HA中和抗体(N＝3)。由HIS诱导的抗体应答稳定并且持久。对于所有的图，误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001(具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)用于图D&E，双尾t-检验用于图C)。
图21：不被疫苗接种的小鼠的血清中和的突变体病毒的HA突变体文库分析(A)显示出在用指示的小鼠血清选择下跨HA蛋白的氨基酸位置的HA点突变的相对富集评分(RE评分)。HA单核苷酸突变体文库是经浓度为IC80的WT或HIS疫苗接种的小鼠的血清选择的。来自模拟感染的小鼠的血清被用作对照。每个突变体的RE评分被计算为与对照相比在血清选择下的相对适合度。(B)示出了对于每只小鼠的未被中和的突变的数目，表明不同小鼠中抗体应答的相似多样性。未被中和的突变被定义为对于每种条件具有＞5的RE评分并且具有＞0.05的RF评分的突变。(C)示出了位于HA蛋白的头和茎区域中的未被中和的突变的百分比。在WT和HIS疫苗接种的组中，用多于一种血清选择分别鉴定出51个和61个未被中和的突变(N＝5)。这些突变中的～60％位于HA蛋白的头结构域中，而这些突变中的～40％位于茎区域中。两组之间的百分比是相似的。
图22：HIS病毒诱导的稳健的T细胞应答(A)CD8 T细胞应答通过四聚体染色和流式细胞术检查。显示出肺和脾样品的代表性流式细胞术点图。右上象限指示NP表位特异性CD8T细胞的部分，其对CD3、CD8和NP366-374四聚体呈阳性。(B)小鼠肺组织中的NP特异性CD8 T细胞通过四聚体染色和流式细胞术检查。(C&D)指示的病毒诱导的小鼠脾(C)和肺(D)组织中的病毒抗原特异性CD8 T细胞的数目使用针对NP或PB1的四聚体通过流式细胞术检查(N＝10)。(E)通过对脾细胞进行肽刺激和细胞内IFN-J染色检查在疫苗接种后第28天的CD8 T细胞应答的功能。对针对来自PA、PB2和NP的指示的病毒肽的IFN-J阳性CD8 T细胞的百分比定量(N＝3)。(F)小鼠肺和脾组织中的抗原特异性短寿命效应细胞(SLEC)的百分比使用四聚体+CD127低KLRG1高作为标志物通过流式细胞术检查(N＝3)。(G)小鼠肺和脾组织中的抗原特异性中枢记忆样CD8 T细胞的百分比使用四聚体+CD44+CD62L+CCR7+作为标志物通过流式细胞术检查(N＝3)。(H)小鼠肺和脾组织中的抗原特异性效应记忆样CD8 T细胞的百分比使用四聚体+CD44+CD62L-CCR7-作为标志物通过流式细胞术检查(N＝3)。(I)检查来自用指示的病毒疫苗接种的小鼠的肺组织在再次应答期间的NP抗原特异性CD8 T细胞的数目(N＝4)。对于所有的图，误差线指SD。*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001(具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)用于图B、C、D&I，双尾t-检验用于图E-H)。
图23：HIS病毒诱导的T细胞应答的多样性(A&B)分析HIS或WT感染的小鼠中的初次应答(A)和再次应答(B)期间的NP特异性CD8 T细胞对TCR VE基因的使用。对流感NP366-374特异性CD8 T细胞的TCRE基因座进行深度测序。对于初次应答，在感染后第10天收获小鼠肺和脾组织。对于再次应答，在感染后第28天用WT病毒攻击疫苗接种的小鼠，并且在攻击后第10天收获组织。通过FACS分选出NP特异性T细胞，并且提取基因组DNA用于深度测序。误差线指SE。(C&D)对于初次应答(C)和再次应答(D)显示出不同小鼠之间通过CDR3重排鉴定出的T细胞谱系的重叠率。对于初次应答，CDR3重排在不同的小鼠之间是不同的，如以WT和HIS疫苗接种的组之间或之内的低重叠示出的。然而，对于再次应答，重排在组内收敛，如以同一疫苗接种组内组间比较相比显著更多的重叠(双尾t-检验，p＝0.00008)示出的。
图24：HIS疫苗接种的小鼠免受病毒攻击的保护(A)疫苗接种的小鼠免受WT感染的保护通过肺组织中的相对病毒拷贝数定量。用1×104TCID50的指示的病毒对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内疫苗接种(N＝4)。在疫苗接种后28天，用1×104TCID50的WT病毒攻击小鼠。在攻击后第2天提取肺组织。病毒拷贝数通过实时PCR定量并且针对WT疫苗接种的小鼠归一化。虚线代表检测限值。(B)HIS疫苗接种的小鼠免于WT感染的保护效率通过高剂量疫苗接种或两次疫苗接种检查。DV：用1×104TCID50 HIS病毒双重疫苗接种，间隔28天；HD：用HIS病毒以1×106TCID50高剂量疫苗接种。用1×104TCID50的WT病毒攻击小鼠，并且通过实时PCR定量在攻击后第2天的肺组织中的病毒生长。虚线代表检测限值(N＝4)。(C)疫苗接种的小鼠免受WT PR8感染的保护通过肺组织中的相对病毒拷贝数定量。虚线代表检测限值(N＝4)。(D)用同源病毒株和异源病毒株攻击的小鼠的临床评分。用A/WSN/33(H1N1)、A/PR8/34(H1N1)和A/Cal/04/09(H1N1)以LD90剂量以及用A/X-31(H3N2)以LD50剂量攻击HIS疫苗接种的或模拟(PBS)疫苗接种的C57/B6小鼠(N＝10)。每天两次获取临床评分，持续10天。(E)通过体重减轻的百分比显示HIS疫苗接种的雪貂免受A/California/07/09病毒攻击的保护(N＝2)。4月龄至6月龄之间的雌性雪貂用HIS或PBS(Ctl)疫苗接种。在疫苗接种后的第35天，用1×106TCID50的A/Califomia/07/09病毒攻击雪貂。每天两次获取临床评分，持续10天。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(具有Bonferroni多重比较检验的单向方差分析(ANOVA))。对于所有图，误差线指SD。
图25：病毒攻击后的再次T细胞应答。再次T细胞应答通过四聚体染色和流式细胞术检查。在疫苗接种后的第28天，用A/WSN/33、A/PR8/34、A/Cal/04/09或A/X-31攻击HIS疫苗接种的小鼠。在攻击后14天，从来自每个攻击组的疫苗接种的小鼠收集肺和脾样品(N＝5)。检查针对H-2Db甲型流感病毒NP366-374(NPP，ASNENMETM)和H-2Kb甲型流感病毒PB1703-711(SSYRRPVGI)的抗原特异性CD8 T细胞。在所有攻击组中观察到针对NP表位的稳健的CD8 T细胞反弹性应答(rebound response)。
图26是图示使用遗传学平台制备基因组的方法的流程图。
图27是图示制备物质的组合物的方法的流程图。
发明详述
在对本发明的详细描述中，可以参考附图，附图构成本发明的一部分，并且其中通过图示的方式示出了可以实施本发明的特定实施方案。应当理解的是，可以利用其他实施方案，并且可以做出不偏离本发明的范围的其他结构性变化。如整个说明书指示的，本文还引用了多个不同的出版物。这些不同的出版物的列表可以见于下文题为“参考文献”的章节。本文引用的所有出版物、专利和专利申请(例如，“Simultaneous and complete genomesequencing of influenza A and B with high coverage by Illumina MiSeqPlatform”Journal of Virological Methods，第193卷，第2期，2013年11月，第394-404页)在此出于所有目的以其整体通过引用并入。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或术语学意图具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含这样的定义不应必然地被解释为代表实质上不同于本领域通常理解的术语的定义。本文描述或引用的许多技术和程序通常是本领域技术人员充分理解的并且通常使用常规方法学来使用。如适当，除非另有说明，涉及使用商购可得的试剂盒和试剂的程序通常按照制造商定义的方案和/或参数来实施。
本发明的实施方案描述了一种用于开发减毒活疫苗的出乎意料地不同并且全新的方法：控制疫苗中的干扰素敏感突变的组合以对复制/免疫应答权衡进行微调来实现最佳或期望的效率与足够的安全性。在一方面，干扰素敏感性使病毒在体内减毒。在另一方面，诱导更高的干扰素应答的能力诱导更高且更有效的适应性免疫应答。
以下实施例中公开了本发明的其他方面和实施方案。
I.实施例：甲型流感病毒
本公开内容描述了检查跨整个流感基因组的单个突变的适合度效应的高通量遗传学平台的建立。
为了应对本文描述的挑战，我们开发了一种定量高通量基因组学系统，该系统将饱和诱变和下一代测序结合以全面地鉴定整个病毒基因组中的IFN调节功能区域(18)。该系统已经使我们能够平行定量地测量大量突变体在特定条件下的复制能力(18，19)。我们对整个流感基因组进行了在具有IFN选择和没有IFN选择的情况下的比较分析，这导致鉴定出多个病毒区段上的IFN-调节功能区域。通过将跨病毒基因组的八种IFN-敏感突变结合，我们产生了一种高干扰素敏感(HIS)病毒，该病毒在体外具有复制能力但在体内在具有产生IFN能力的宿主中被极大地减毒。HIS病毒显示出作为安全并且有效的减毒流感活疫苗所期望的特性，具有稳健的体液应答和细胞应答，并且它在小鼠和雪貂中提供针对同源病毒攻击和异源病毒攻击的广泛保护。
与先前的方法相比，我们显著地改善了质量和重现性，消除了来自多个突变的噪声。此外，据我们所知，本文描述的遗传学分析系统是对流感病毒的首次全基因组适合度分析。
a.甲型流感病毒基因组的单核苷酸分辨率适合度分析
携带流感A/WSN/33(H1N1)病毒基因组的八质粒反向遗传学系统被用于构建突变体质粒文库(20)。突变体被分成52个子文库，每个子文库在由易错聚合酶链式反应产生的240个碱基对的小基因组区域中包含单核苷酸突变(图7A)(21-23)。通过将编码突变体子文库的质粒与编码野生型(WT)病毒蛋白的其他7个质粒共转染到人类胚胎肾293T细胞中重建病毒突变体文库。为了系统性地鉴定IFN-调节功能区域，在具有或没有外源IFN处理(处于抑制浓度80的IFN-α2)的A549细胞中选择所有病毒文库(19)。使用Illumina测序鉴定每个突变体并且计算每个子文库内对应的频率。突变体病毒的相对适合度(RF)评分被计算为选择的病毒文库中的相对频率与质粒文库中的相对频率的比率(图1A)。转染和选择的生物学重复之间存在强相关性(图8)。我们观察到同义突变和无义突变之间的适合度效应分布的清楚分离(图9A)，指示对病毒突变体的有效选择。为了进一步验证适合度分析的准确性，我们随机地选择了26个错义突变并且单独地表征了对应的突变体病毒。每个突变体的复制能力与来自适合度分析的RF评分高度相关(图9B)。使用同义突变作为基准，跨整个基因组的50.7％的错义突变是有害的，与先前的发现一致，即RNA病毒的基因组中对单个突变的耐受差(图10A)(24，25)。
b.IFN-敏感突变的系统性鉴定
将大多数突变体在存在和不存在外源IFN处理下的RF评分相关联；然而，我们观察到这样的一组突变，其在不存在IFN时几乎是中立的但在IFN选择下是高度有害的(图1B和图11)。这些推定的IFN敏感突变广泛分布在多个病毒区段上。在所有甲型流感病毒蛋白中，NS1因其与IFN通路相互作用而被广泛研究(19，26，27)，这在我们的适合度分析和单独构建的NS1突变体病毒二者中被验证(图12)。为了进一步探索跨越基因组的IFN-调节功能区域，我们集中于NS1外部的IFN-敏感突变，特别是在聚合酶复合物(PB2、PB1、PA和NP)以及M1和M2蛋白中暴露于溶剂的和在结构上成簇的残基(图1C和图11)。单独地构建了26个突变，其中大多数对于病毒复制几乎是中立的，具有几乎完整的聚合酶活性(图13)。这些包括先前表征的突变PB2-N9D和M1-D30N，该PB2-N9D已知对抗(counteract)MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)的抑制-由PB2诱导IFN-β产生(16)，该M1-D30N已经被证明诱导IFN-β产生(17)。与WT相比，若干突变显著地增加了IFN敏感性，并且选择前八个用于进一步表征(图1D)。它们中的六个(PB2-N9D、PB2-Q75H、PB2-T76A、M1-N36Y、M1-R72Q和M1-S225T)升高了IFN-β和ISG54的表达(图1E和图14)并且刺激了IRF3的核易位(图15)。我们还观察到IFN诱导是依赖MAVS而不依赖STING(干扰素基因的刺激物)的(图16)。此外，这六个突变体对IFN产生缺陷的Vero细胞中的IFN处理不敏感。然而，另外两个突变(PB1-L155H和PA-E181D)不诱导更高的IFN产生(图1E)，并且在Vero细胞中仍然是IFN敏感的，表明这些突变可能影响IFN产生下游的过程。
c.将突变组合增加体外IFN敏感性和IFN诱导
为了使IFN敏感性和IFN诱导最大化，我们将PB2上的三个诱导IFN的突变(N9D、Q75H和T76A)、M1上的三个诱导IFN的突变(N36Y、R72Q和S225T)和NS1上的两个先前报道的诱导IFN的突变(R38A和K41A)组合以产生HIS病毒。HIS病毒在具有产生IFN能力的A549细胞中的生长显示出与WT病毒的生长相比显著减弱(在36小时减少1.4个对数，并且在60小时减少1.8个对数)，但在IFN缺陷的Vero细胞中完全恢复(图2A和2B)。HIS病毒的IFN敏感性显著高于NS1-R38A/K41A突变体的IFN敏感性，指示在PB2和M1上的突变的独立的作用(图2C)。来自肺上皮细胞系和巨噬细胞系(A549和THP1)的基因表达数据显示出HIS病毒诱导更高的IFN产生和应答(图2D和图17A至17C)。使用RNA测序，我们评价了用WT、NS1-R38A/K41A或HIS病毒感染的A549细胞中的整体基因表达变化。在感染后6小时，HIS感染的细胞中120个基因的表达显著地上调(倍数变化＞2并且P＜0.001)，其中24％是IFN应答基因(图2E、图17D)。基因本体(GO)富集分析揭示了与IFN产生和应答相关的通路是被HIS病毒在比WT或模拟感染更大的程度上活化的主导性通路(图2F)。此外，HIS病毒诱导凋亡过程的负调控物，诸如TNFAIP3，TNF-介导的凋亡的一种重要抑制剂。观察到HIS感染的细胞死亡比WT感染更慢(图17E)。
我们用一组人类肺细胞进一步定义了HIS病毒的表型，所述人类肺细胞包括永生化的小气道上皮细胞、支气管上皮细胞、原代肺泡上皮细胞和原代肺泡巨噬细胞(图2G)。HIS病毒在原代肺泡巨噬细胞(流感感染的重要靶)中诱导了IFN-β表达的最强上调(相对于WT的～50倍)(图2G)，以及比WT病毒大的ISG的上调(图2F)。HIS病毒不增强其他炎性细胞因子[CXCL1、CXCL5或白细胞介素-1β(IL-1β)]在感染的巨噬细胞中的表达，突出了其对IFN通路的特异性作用(图2H)。HIS病毒的表型不限于WSN背景：将这八个突变引入另一种流感H1N1毒株A/PR8/34(PR8-HIS)，导致了相似的表型(图17F和17G)。IFN通路的上调需要有效的病毒感染，考虑到福尔马林失活的HIS病毒损失了诱导更高IFN-β表达的能力(图2G)。
d.HIS病毒在具有产生IFN能力的小鼠和雪貂中被高度减毒
我们接下来测量了HIS病毒在小鼠和雪貂中的复制和致病性，小鼠和雪貂是最通常使用的用于流感病毒的动物模型。用WT或HIS病毒以不同的剂量对BALB/c小鼠鼻内接种。虽然WT病毒的中位致死剂量为5×105TCID50(50％组织培养物的感染剂量)，并且1×103TCID50在所有动物中引起明显的体重减轻，但在给予1×107TCID50(我们已经测试的最高剂量)的HIS感染的小鼠中，没有观察到体重减轻，也没有观察到指示性临床症状(图3A和3B)。为了将HIS病毒方法与FluMist中使用的减毒活疫苗策略比较，我们将来自FluMist的五个冷适应(CA)突变整合到WSN背景中并且产生了WSN-CA病毒(28，29)。WSN-CA病毒在33℃复制良好，但在39℃高度减弱并且诱导IFN-β表达至与WT病毒相似的、显著地低于由HIS病毒诱导的水平(图18)。在接种后第2天，在小鼠肺组织中HIS病毒的复制地显著低于WT病毒的复制(减少～3.6个对数)或NS1-R38A/K41A突变体的复制(减少～2个对数)并且与WSN-CA病毒的复制相当(图3C和图19A)。与对于在48小时达到峰的WT感染观察到的稳健的病毒复制相比，在任何测试的时间点没有在HIS感染的小鼠中检测到病毒拷贝数的增加(图3D)。与WT PR8病毒相比，PR8-HIS病毒在小鼠肺组织中也被显著地减毒(图19B)。虽然复制高度减弱，但在感染后6小时和24小时，HIS病毒显示出瞬时但显著的IFN和ISG上调，其后应答减弱(图3E)。相比之下，WT病毒在整个感染过程诱导稳健的促炎性应答，通过在感染后48小时和120小时的CXCL10高诱导例示(图3F)。这些结果与感染的肺和支气管肺泡灌洗(BAL)液的细胞涂片的组织学分析良好相关(图3G和3H、和图19C至19G)。HIS感染的肺在感染后第2天显示出中性粒细胞和淋巴细胞的浸润；然而，浸润是瞬时的并且在第9天被清除。观察到WT感染的肺的持续炎症和组织损伤，其在感染后第9天变得更加严重(图3H、和图19H和19I)。我们还通过Luminex多重测定检查了感染后48小时的BAL样品中的细胞因子应答(图3I、和图19J和19K)。WT感染显示出显著更高水平的IL-6和CXCL1，与观察到的严重炎症相符。相比之下，HIS病毒诱导更高量的IL-12和G-CSF，这对于粒细胞刺激和T细胞发育是重要的。此外，在IFNAR-/-小鼠中，HIS病毒的复制完全恢复到WT水平，指示不能对抗IFN应答是HIS病毒在野生型小鼠中复制被高度减弱的潜在机制(图3J)。在雪貂模型中，我们也观察到了HIS病毒的显著减毒(图3K)。在感染后第3天，与WT病毒相比，HIS病毒显示出在气管中的～2个对数的减少和在肺组织中的～1.5个对数的减少。此外，与WT感染期间观察到的稳健的病毒脱落相比，在HIS感染的雪貂的鼻洗液中没有检测到感染性病毒颗粒。
e.HIS病毒诱导强并且广泛的适应性免疫应答
然后我们检查了HIS病毒诱导体液应答和细胞应答的能力。在用WT、HIS或WSN-CA病毒单剂量(1×104TCID50)疫苗接种后第28天收集小鼠血清和BAL样品。HIS病毒诱导稳健的抗体应答，如通过ELISA(酶联免疫吸附测定)和血凝素(HA)抑制和中和抗体测定测量的(图4A至4E、和图20)。由HIS病毒引发的HA抗体应答的水平低于WT病毒，但显著地高于WSN-CA病毒、失活的WT病毒和失活的HIS病毒的(图4A和4B和图20C和20D)。已经被证明在限制病毒复制方面起重要作用的针对NP、NA和M1蛋白的免疫球蛋白G(IgG)抗体(30，31)在HIS疫苗接种的小鼠的血清中也在与WT感染的小鼠的水平相当的水平上被检测到(图4C和4D、和图20E)。此外，由针对HA和NP蛋白的分泌性IgA抗体指示的黏膜免疫应答通过HIS疫苗接种被引发(图4E和图20F)。稳健的HA抗体应答也在用HIS病毒疫苗接种的雪貂中被观察到(图4F和图20G)，其在疫苗接种后持续至少50天。为了检查由HIS病毒产生的中和抗体的表位覆盖，我们在存在或不存在小鼠血清抗体的情况下通过使用高通量基因组学方法(32)分析了HA突变体。在头区域(Ca2和Sa位点)和茎区域二者中观察到未被血清中和的突变，而WT病毒和HIS病毒之间的突变的数目或分布无显著差异(图4G、图21)。这表明HIS病毒诱导的中和抗体的广度和多样性与WT病毒诱导的中和抗体的广度和多样性相当。
除体液应答之外，HIS病毒引发NP和PB1抗原特异性CD8 T细胞应答，与WT病毒相似并且比WSN-CA病毒、失活的WT病毒和失活的HIS病毒强得多(图4H和图22A至22D)。由WT和HIS病毒诱导的CD8 T细胞在被病毒表位肽刺激后具有相似的产生IFN-γ的能力(图22E)。我们通过定量KLRG1、CD127、CD44、CD62L和CCR7的表达进一步检查了病毒特异性T细胞的表型。在感染后第21天，由WT病毒和HIS病毒诱导的NP和PB1抗原特异性CD8 T细胞显示出相似水平的具有CD127高KLRG1低表型的记忆性前体效应细胞和具有CD127低KLRG1高表型的短寿命效应细胞(图4I和图22F)。这些病毒特异性CD8 T细胞还显示出相似的效应/记忆性表型，如通过CD62L、CD44和CCR7表达测量的(图22G和22H)。一致地，在疫苗接种后1个月的攻击感染后，HIS病毒诱导与WT相似但比WSN-CA病毒更强的再次CD8 T细胞应答(图4J和图22I)。此外，WT病毒和HIS病毒引发相似频率的流感特异性CD4 T细胞(图4K)。为了检查初次T细胞应答和再次T细胞应答的多样性，我们通过对用WT病毒或HIS病毒疫苗接种的小鼠中的NP特异性CD8 T细胞的β T细胞受体(TCRβ)基因座进行测序，分析了T细胞受体库(T cellreceptor repertoire)。初次T细胞应答和再次T细胞应答的Vβ使用和克隆性在WT病毒和HIS病毒之间是相当的，证明了由HIS疫苗接种诱导的T细胞谱系的多样性(图4L和4M、和图23)。
我们在群体水平分析了免疫应答对病毒基因组的潜在影响。我们的全基因组适合度分析提供了用于检查病毒序列的遗传灵活性的数据集。我们计算了先前鉴定出的B细胞表位和T细胞表位中的突变的适合度成本。若干T细胞表位上而不是抗体表位上的突变通常与较低的适合度评分相关(图4N)。我们的结果表明，从T细胞选择中逃逸将对病毒施加更高适合度成本，并且因此T细胞应答针对疫苗逃逸将是有效的。
f.HIS病毒针对同源和异源病毒攻击保护
我们检查了HIS疫苗接种是否可以提供针对同源和异源病毒攻击的保护。在疫苗接种后28天用1×104TCID50的WT病毒攻击免疫的小鼠。HIS病毒疫苗接种使病毒复制降低了～3个对数，而没有体重减轻的迹象(图5和图24)。通过以高剂量(1×106TCID50)的一次疫苗接种或以低剂量(1×104TCID50)的两次疫苗接种，在肺中实现了没有能够检测到的病毒滴度的完全保护(图5B和图24B)。在疫苗接种后第35天被1×107TCID50的WT病毒攻击的雪貂中观察到相似的保护作用。在攻击后的第1天、第3天、第4天、第7天和第9天收集鼻洗液，并且在整个该时间段内没有在来自HIS疫苗接种的雪貂的鼻洗液中检测到感染性病毒颗粒(图5C)。
为了测试HIS疫苗接种是否提供针对异源毒株的保护，我们首先用PR8病毒攻击免疫的小鼠并且在攻击后第2天检查病毒滴度。HIS疫苗接种与模拟疫苗接种相比使病毒滴度降低了～3个对数，并且显著地多于WSN-CA疫苗接种(图24C)。我们进一步用致死剂量的以下三种不同的流感毒株攻击疫苗接种的小鼠：H1N1亚型A/PR8/34和A/Cal/04/09和H3N2亚型A/X-31。在所有的测量项目包括存活率、体重减轻的百分比和临床评分中观察到HIS疫苗接种的保护(图5D和5E、和图24D)。对于所有的毒株，在攻击的小鼠中观察到强的再次抗原特异性T细胞应答(图25)。HIS疫苗接种还保护雪貂免受异源A/CaI/07/09攻击，如通过洗鼻液中的病毒滴度和体重减轻的百分比显示的(图5F和图24E)。
g.对于实施例的结果的讨论
虽然NS1是流感基因组中研究得最充分的IFN拮抗剂，但其他蛋白中的抗IFN功能区域最近已经被认识到。据报道，PB2和PB1F2可以与MAVS结合并且抑制干扰素产生；PB1和PA中的ESIE基序可以介导I型干扰素应答，并且新出现的H7N9的NP可以对抗抗病毒ISG：MxA。在此，使用高通量遗传学方法，我们已经鉴定出PB2、PA、PB1和M1蛋白中的多个IFN敏感突变，教导了对应的WT蛋白的抗IFN功能。因为抗IFN功能区域对于有效的体内病毒复制是必需的，所以这些功能区域分布在不同的区段中是合理的。鉴定出的IFN敏感突变也对IFN系统的不同的部分起作用。PB2和M1上的突变可以诱导更高的IFN产生，指示它们在IFN系统的上游起作用。在另一方面，PB1和PA上的突变不能够诱导更高的IFN产生和应答，并且在IFN缺陷的Vero细胞中仍然保持敏感性，表明它们可能与JAK/STAT通路或特异性抗病毒ISG相互作用。这些突变的鉴定为剖析根本性机制打开了道路。
开发疫苗的常规方法使病毒无致病力但也降低了免疫原性。我们开发了一种定量高通量基因组学方法以系统性地鉴定和消除病毒基因组中的免疫调节功能区域同时维持体外复制适合度。这是一种增强病毒免疫原性同时减弱复制和致病性的基于系统的策略。在这项原理验证性(proof-of-principle)研究中，我们产生了具有八个IFN敏感突变的组合的HIS病毒。这些突变还诱导更高的IFN产生和应答。我们证明了HIS病毒在体内被高度减毒，但能够诱导瞬时的IFN应答，引发稳健和多样化的体液免疫和细胞免疫，并且在小鼠和雪貂中提供针对同源和异源病毒攻击的保护。
最近的研究已经建议了设计减毒活疫苗的若干种策略(74，15，33-37)。我们的方法在以下方面中是独特的：(i)我们系统性地研究了全病毒基因组，并且我们消除了多个基因座处的免疫逃逸功能，获得了没有能够检测到的体内复制的安全毒株；(ii)我们选择了诱导更高的IFN应答的突变体，因为瞬时IFN应答已经被证明对于适应性免疫(包括强并且多样化的T细胞应答)是必需的；(iii)HIS病毒选择性地诱导瞬时IFN应答，但不选择性地诱导其他所测试的炎性应答，这对于将来的临床使用降低了潜在的致病性或副作用。我们还将这种方法应用于DNA病毒并且产生了有效的疫苗候选物。
通常地，这种无偏且定量性的高通量基因组学系统可以广泛地应用于其他病原体以定义基因组范围的突变在某些选择条件下的影响。对病毒基因组的相似分析可以在体外和体内用其他免疫组分诸如细胞因子、自然杀伤细胞或T细胞进行。使病毒中另外的免疫逃逸功能失活将进一步增加其衍生物用于预防或治疗的安全性和免疫原性。
II.用于第I节的实施例(甲型流感病毒)的材料和方法。
a.病毒、细胞、小鼠和雪貂
流感A/WSN/33病毒(WSN)和流感A/PR8/34病毒(PR8)被用于产生WT病毒和突变体病毒。利用八个质粒反向遗传学系统重建WT病毒(20，41)。活的减毒的冷适应WSN毒株(WSN-CA)通过在3个聚合酶基因中引入5个突变：PB1(391E、581G和661T)、PB2(265S)和NP(34G)来产生。这5个突变来源于A/Ann Arbor/6/60，其在疫苗FluMist的骨架(backbone)中被鉴定到(28，42，43)。除WSN和PR8之外，流感A/X-31(H3N2)和A/Cal/04/09(H1N1)、A/Cal/07/09(H1N1))也被用于小鼠和雪貂的攻击实验。
293T细胞培养在具有10％FBS(Corning)的DMEM(Corning)中。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞培养在具有10％FBS的DMEM中，但对于具有PR8背景的病毒感染更换为具有0.8mg/ml TPCK胰蛋白酶的OPTI-MEM(Thermo Fisher)。A549细胞和THP1细胞培养在具有10％FBS的RPMI1640(Coming)中。具有敲除的THP1细胞使用表达gRNA(靶向STING或MAVS)和Cas9-T2A盒的慢病毒通过CRISPR-Cas9产生(44)。THP1细胞用慢病毒转导并且用5μg/ml嘌呤霉素(Life Technologies)选择。人类小气道上皮细胞(HSAEC)培养在具有生长补充剂(Lonza)的小气道上皮细胞基础培养基(SABM)中。人类支气管上皮细胞(HBEC)培养在包含牛垂体提取物(BPE，30Pg/ml)和hrEGF补充剂(0.2ng/ml)(Invitrogen)的角质形成细胞无血清培养基中。如先前描述的，人类肺泡巨噬细胞从隐去身份(de-identified)的供体的肺分离并培养(45)。为了培养人类肺泡上皮细胞，将分离的ATII细胞铺板在大鼠尾胶原蛋白包被的组织培养板的具有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecoo改良Eagle培养基(DMEM)中，并且在粘附2天后，将培养基转换为具有5％FBS的DMEM。再培养AEC4天，然后进行流感病毒感染。涉及死者的研究和临床培训监督委员会(the Committee for Oversight of Researchand Clinical Training Involving Decedents)和皮兹堡大学机构审查委员会(theUniversity of Pittsburgh Institutional Review Board)批准了这些人类组织的使用。
使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratory)来确定安全性、病理学、体液免疫应答和保护。使用同龄雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory)用于T细胞研究。使用C57BL/6J背景的IFNAR-/-小鼠用于病毒复制研究(46)。4-6月龄的雌性雪貂(体重约1kg)从Wuxi Cay Ferret Farm(Jiangsu，China)购买，以确定疫苗的安全性和有效性。
b.流感突变体质粒文库的构建
干扰素敏感性使用高通量遗传学系统定义。图7A图示了用于系统性地映射干扰素敏感突变的示例性单核苷酸分辨率高通量遗传学方法。因此，我们提出了一种用于疫苗开发的新型方法：在对病毒进行全基因组功能表征后，系统性地对生物学功能重编程。
如先前描述的，流感A/WSN/33突变体病毒的文库使用八个质粒转染体系产生(18，21-23，47)。使用WSN毒株产生突变体文库，因为它提供将大的复杂的突变体文库在多种细胞系中传代的灵活性。简而言之，将全长流感基因组分离成52个各240bp的小片段。单独地用易错聚合酶突变酶II(Stratagene)对于每个片段进行随机诱变。我们已经小心地控制突变率以将点突变的比例最大化。预期将对于每个模板产生0-3个突变。对于每个小文库，将突变的片段扩增并凝胶纯化，BsaI或BsmbI(NEB)消化，连接到载体并且转化到MegaX DH10BT1R细胞(Life Technologies)中。因为预期每个小文库具有～1,000个单个突变，所以收集了～50,000个细菌克隆以覆盖～50×的复杂性。来自收集的细菌的质粒被中量制备(midi-prepped)作为输入质粒文库。在每个小文库中，单核苷酸突变占整个群体的30％。先前已经构建了PB1、PA和M区段的突变体文库(211，22)。
c.病毒文库的重建、选择和滴定(titering)
为了重建突变体病毒文库，～3000万个293T细胞使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)用每个质粒文库(52个小文库的一个)与编码WT病毒蛋白的其他7个质粒(总计32Pg的DNA)一起转染。在转染后24h更换培养基。在转染后72h收集病毒。病毒滴度(TCID50)使用具有A549细胞的有限稀释通过观察细胞病变效应(CPE)来测量。为了将未经IFN处理的病毒文库传代，～1000万个A549细胞用单独突变体病毒文库以0.05的MOI感染。在感染后2h用PBS洗涤细胞三次。在感染后24h从上清液收集病毒，清除细胞碎片并且以等分试样储存在-80℃。为了在外源I型IFN处理下选择，A549细胞用1000U/ml IFN-D2(PBLAssay Science)预处理20h，并且然后用病毒文库以0.05的MOI感染。在感染后2h用PBS洗涤细胞三次，并且将1000U/ml IFN-D2加回培养基中。相似地，在感染后24h从上清液收集病毒，清除细胞碎片并且以等分试样储存在-80℃。
d.将突变体文库测序和数据分析
如先前描述的，制备测序文库(21，22)。简而言之，使用QIAamp病毒RNA Mini试剂盒(Qiagen Sciences)提取病毒RNA。进行DNA酶I(Life Technologies)处理，随后使用Superscript III系统(Life Technologies)逆转录。
将使用实时PCR定量病毒拷贝数。使用至少1×106个病毒RNA拷贝扩增突变的片段。然后用BpuEI或BpmI消化扩增的片段，并且与测序衔接子连接，该衔接子具有三核苷酸多路复用ID(three-nucleotide multiplexing ID)以区分不同的样品。
深度测序通过Illumina PE250进行。原始测序读段使用三核苷酸ID解多路复用(de-multiplexed)。测序错误通过过滤掉低质量读段(质量评分＜30)以及正向读段和反向读端之间的不匹配的碱基对来校正。我们实现了对于每个核苷酸位置至少20,000×测序覆盖。突变通过比较测序读段与野生型序列来调用。包含两个或更多个突变的读段被从下游分析中排除，这使我们能够消除由多个突变引起的可能的复杂情况(complication)。
RE评分突变体i
＝突变体i的相对频率感染
/突变体i的相对频率质粒
其中突变体i的相对频率＝突变体i的读段/野生型的读段
计算每种情况下单独突变的相对适合度评分(RF评分)。为了降低估计相对适合度中的采样误差，仅报告了输入质粒文库中具有＞0.05％的频率的那些突变。
其中突变体i的相对频率＝突变体i的读段/野生型的读段。
所有的数据处理和分析是用存放在https://github.com/YushenDu/Influenza-Vaccine处的定制的python脚本进行的。
e.具有一个或更多个特异性突变的病毒的构建
具有一个或更多个特异性突变的病毒使用基于PCR的定点诱变策略产生。为了在WSN背景上重建突变体病毒，用4Pg质粒DNA转染150万个293T细胞。转染使用Lipofectamine2000(Life Technologies)进行。在转染后72h收集病毒。在A549细胞中进一步扩增突变体病毒。收集上清液，清除碎片并且以等分试样储存在-80℃。病毒滴度用A549细胞通过TCID50测定测量。提取病毒体RNA并且逆转录成cDNA。PCR扩增所有突变体的编码序列并进行Sanger DNA测序以便确认。为了测量突变体病毒的生长动力学，将～100万个A549细胞用每种突变体病毒以0.1的MOI感染并在指示的时间收集上清液。为了在PR8背景上产生突变体，150万个293T细胞用4Pg DNA转染并与MDCK细胞共培养。在转染后24h，将培养基更换为具有0.8mg/ml TPCK胰蛋白酶的OPTI-MEM。在转染后72h收集病毒。用MDCK细胞通过TCID50测定测量病毒滴度。突变体病毒在MDCK细胞中进一步扩增，收集上清液，清除碎片并且以等分试样储存在-80℃。
在一个或更多个实例中，使用沉默突变作为基准，我们观察到平均～60％的错义突变对于流感病毒复制是有害的，并且仅～2％是有益的。与先前的结果相似，高百分比的有害突变表明RNA病毒基因组的一般保守特性。然而，甲型流感基因组中的不同蛋白也显示出不同水平的突变耐受性。我们定量了平均适合度成本以及每种病毒蛋白的致死突变的百分比。聚合酶亚基(PB2、PB1、PA和NP)是高度保守的，而NS1和M2是相对地可突变的。
f.使用单独构建的突变体病毒选择可能的IFN敏感突变用于测量IFN-敏感性
因为NS1蛋白的抗IFN功能已经被广泛研究，我们集中于蛋白(PB2、PB1、PA、NP、M1、M2)的进一步验证。为了选择可能的IFN敏感突变，我们遵循以下标准：1)在没有IFN选择的A549细胞中RF评分＞0.7；2)在干扰素选择下RF评分＜0.3；3)当突变为不同的氨基酸时给出相似的干扰素敏感表型的残基是优选的。此外，我们将潜在的干扰素敏感残基映射到蛋白结构(PDB：4WSB、1RUZ、2IQH和1EA3)上(38-40，48-50)，并且优先选择簇集在蛋白表面上的潜在干扰素敏感残基用于验证。选择高达7个突变/区段。
为了使用单独构建的突变体病毒测量IFN敏感性，100万个A549细胞用1000U/mlIFN-D2(PBL Assay Science)预处理20h或留置不处理。然后用指示的病毒以0.1的MOI感染细胞。在感染后2h用PBS洗涤细胞三次，并且将1000U/ml IFN-D2加回培养基中。在感染后24h收集上清液并且通过实时PCR对病毒拷贝数定量。每一个突变体的相对IFN敏感性被计算为在具有IFN选择情况下的病毒拷贝数变化针对WT归一化的倍数。
在一个或更多个实施方案中，我们的干扰素筛选捕获了熟知的干扰素敏感突变。例如，NS1蛋白的RNA结合结构域的氨基酸，特别是R37、R38、K41、R46被证明是干扰素高度敏感的。据报道，该结构域对于将病毒dsDNA与细胞质RNA传感器隔离和抑制某些ISG功能是重要的。我们的筛选结果与已报道的对于该功能的关键残基良好相关。
g.聚合酶活性测定
将质粒DNA(100ng的PB2、PB1、PA、和NP；50ng的病毒诱导型萤光素酶报告物和5ngPGK-海肾萤光素酶报告物)共转染到24孔板中的293T细胞中(51)。在转染后24h裂解细胞并且接着进行双萤光素酶测定(Promega)。
h.免疫荧光测定
IRF3蛋白的细胞内定位通过免疫荧光确定。将感染的A549细胞在2％多聚甲醛中固定，用0.1％Triton-X100透化，并且用3％BSA和10％FBS封闭。病毒NP蛋白用抗NP单克隆抗体(GeneTex)检测。IRF3用抗IRF3兔多克隆抗体(Cell signaling)检测。使用Hoechst33342染料对DNA染色。
i.细胞存活力(CCK8)测定
用WT、NS1 R38A/K41A或HIS病毒以0.1的MOI在96孔板中感染A549细胞。模拟感染被用作对照。感染后72h，将CCK8溶液(VitaScientific)添加在每个孔中，并在37℃孵育4h。检测在OD 450nm处的信号。
j.RNA-seq文库制备和测序
RNA-seq文库使用基于ScriptSeq mRNA-Seq文库制备试剂盒(Epicentre)的修改的方法制备(48)。多重测序用在UCLA临床微阵列核心(UCLA Clinical Microarray Core)的Illumina HiSeq 2000机器通过50bp单末端读段进行。在默认参数下使用TopHat将原始读段与人类基因组组装体(human genome assembly)(hg19)或小鼠基因组组装体(mm10)比对(52，53)。结果通过每百万总读段的读段(RPM)定量。差异表达分析用edgeR进行(54)。基因本体富集分析通过metascape进行(55)。与某些细胞通路相关的基因从MsigDB提取(56，57)。
k.测量小鼠中的病毒复制
为了测量病毒复制，将BALB/c小鼠用异氟醚(IsoFlo，Henry Schein)麻醉并且用指示的病毒以30P1的体积进行鼻内接种。每天监测体重减轻，持续14天。为了对小鼠肺组织中的病毒生长定量，用指示的病毒以1×104TCID50的剂量对小鼠鼻内接种并且在感染后第2天处死。将DMEM用作感染对照。为了通过TCID50定量病毒滴度，肺组织被收集，匀浆，并且冷冻-解冻三次以释放病毒。为了对病毒基因组拷贝数定量，使用Trizol(Thermo Fisher)从小鼠肺组织提取RNA。相似地，为了对小鼠肺组织中的病毒生长动力学和基因表达定量，在感染后2h、6h、24h、48h和120h收集肺样品。病毒拷贝数和基因表达通过实时PCR定量。所有小鼠实验按照UCLA、中国CDC、Trudeau研究所和匹兹堡大学批准的动物实验指导进行。
l.测量小鼠中的致病性
为了确定病理学和细胞因子表达，用指示的病毒以1×104TCID50的剂量对BALB/c小鼠鼻内接种。在感染后第2天和第9天收集支气管肺泡灌洗(BAL)和肺样品。BAL中的白蛋白浓度使用小鼠白蛋白ELISA定量试剂盒(Bethyl Alboratories)确定，并且细胞因子应答通过Lincoplex(BioRad)分析。BAL细胞细胞涂片载玻片用HEMA-3染色试剂盒(FisherScientific)染色用于炎性细胞差异计数。此外，肺组织用10％中性缓冲福尔马林(EMDMillipore)固定并且石蜡包埋以便组织学分析。苏木精和伊红(H&E)染色的肺组织载玻片用以下标准(评分1-5)对它们的病理学进行评分：
1＝观察不到病理学。
2＝血管周围/支气管周围或肺实质炎性浸润＜25％的叶部分。
3＝血管周围/支气管周围或肺实质炎性浸润25％-50％的叶部分。
4＝血管周围/支气管周围或肺实质炎性浸润50％-75％的叶部分。
5＝血管周围/支气管周围或肺实质炎性浸润＞75％的叶部分。BAL样品中的细胞因子根据产品方案(Bio-Rad)通过Bio-Plex Pro小鼠细胞因子23-plex测定测量。
m.测量小鼠中的抗体应答和T细胞应答
为了测量抗体应答，用指示的病毒以1×104TCID50的剂量对BALB/c小鼠鼻内接种。DMEM被用作对照。在感染后第14天、第21天和第28天收集小鼠血清。在感染后第28天收集血清和BAL样品。将血清用于免疫球蛋白G(IgG)抗体检测、血凝抑制和中和测定。将BAL样品用于免疫球蛋白A(IgA)抗体检测。
为了测量T细胞应答，用指示的病毒以1×104TCID50的剂量对C57BL/6J小鼠鼻内接种。为了检查初次T细胞应答，在感染后第10天收获肺和脾。将新鲜细胞用于四聚体染色和流式细胞术。对于T细胞的肽刺激，在感染后第28天收获脾。为了检查再次T细胞应答，在用HIS病毒疫苗接种后第28天在指示的病毒攻击后14天收集肺和脾。
n.对小鼠免受攻击感染的保护
对于保护研究，用指示的病毒以1×104TCID50或1×106TCID50的剂量对BALB/c小鼠鼻内接种。DMEM用作对照。然后用1×104TCID50 WT对小鼠进行鼻内攻击。在攻击后第2天通过TCID50和实时PCR测定二者定量病毒滴度。
为了检查免受同源病毒攻击和异源病毒攻击的保护，用HIS病毒或PBS作为对照对C57BL/6J小鼠鼻内疫苗接种。在疫苗接种后第28天，将A/PR8/34(H1N1)、A/Cal/04/09(H1N1)和WSN(H1N1)以LD90的剂量(分别为600050％卵感染剂量(EID50)、8000EID50和14,000EID50)用于鼻内攻击。因为难以达到LD90，A/X-31(H3N2)以45,000EID50(LD50)提供。每天两次监测体重减轻，持续14天。将使用以下临床评分对临床症状定量：
0＝无可见的疾病迹象
1＝轻微的皮毛起皱
2＝褶皱的毛皮、降低的活动性
3＝皱褶的皮毛、降低的活动性、呼吸急促
4＝皱褶的皮毛、最小的活动性、蜷缩的外观、急促和/或吃力的呼吸
5＝发现死亡。
o.酶联免疫吸附测定(ELISA)
病毒蛋白特异性IgG和IgA抗体使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。用在碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中的1Pg/ml重组病毒蛋白(HA-WSN、HA-PR8、HA-HK68、HA-Viet04、NP、NA或M1)在4℃过夜包被96孔ELISA板(Costar，Corbing)。在每个步骤之间用PBST将孔洗涤3-5次。然后用在PBS中的10％FBS在室温将孔封闭1h。在封闭缓冲液中稀释血清或BAL样品并添加到孔以在4℃孵育过夜。在封闭缓冲液中稀释HRP缀合的抗小鼠IgG抗体(Cell Signaling)或HRP缀合的抗小鼠IgA抗体(Thermo Fisher)并且在室温添加到孔中，持续1h。使用SIGMA FAST OPD(Sigma)检测OD 450nm处的信号。
Luminex多重测定根据制造商的方案(Bio-Rad)进行。小鼠BAL样品中的IFN-D浓度根据制造商方案使用VeriKine小鼠干扰素αELISA试剂盒(pbl Assay Science)确定。
p.血凝抑制(HAI)测定
将小鼠血清在56℃预处理30min。将4个HA单位的WT病毒与2倍连续稀释的血清在37℃在V形96孔板中孵育1h。血清的起始浓度为1∶4。将洗涤过的火鸡红细胞(Lampire)以0.5％的浓度添加到每个孔中并且在室温孵育30min。然后将HA滴度读出为防止血凝的血清的最高稀释度。
q.抗体中和测定
将小鼠血清在56℃预处理30min。将WT病毒与连续稀释的血清在37℃孵育1h。来自模拟感染的小鼠的血清被用作对照。孵育后的病毒滴度使用A549细胞通过TCID50测定测量。
r.确定未被血清抗体中和的HA蛋白上的突变
小鼠血清针对WT病毒复制的剂量应答曲线通过抗体中和测定测量。将关于HA蛋白重建的突变体病毒文库与浓度为IC80的单独小鼠血清(来自WT疫苗接种的组的5只小鼠和来自HIS疫苗接种的组的5只小鼠)在37℃孵育1h。来自未疫苗接种的小鼠的血清被用作模拟对照。在用血清孵育后，将突变体文库用于感染3000万个A549细胞，并且在感染后2h用PBS洗涤两次。将与IC80匹配的对应的血清加回培养基中。在感染后48h收集上清液，提取病毒RNA并且逆转录。如之前描述的，每个突变体的相对频率通过Illumina MiSeq PE250确定。
对于每种小鼠血清选择条件，HA点突变的相对富集评分(RE评分)通过比较具有和没有血清选择的突变的相对频率来计算。
RE评分突变体i
＝突变体i的相对频率血清
/突变体i的相对频率模拟
其中
突变体i的相对频率＝突变体i的读段/野生型的读段
将具有＞5的RE评分并且具有＞0.05的RF评分的突变分类为未被对应的血清抗体中和的突变。选择并且比较了出现在WT或HIS组中的至少两种小鼠血清中的突变。
s.病毒特异性CD4 T细胞的定量
在37℃在1Pg/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A)的存在下用WT WSN病毒刺激脾细胞16h。对细胞用CD3-efluorofore450、CD4-FITC染色并且用IFNJ-PE细胞内染色。IFNJ阳性CD3+CD4+细胞的百分比通过流式细胞术定量。
t.确定T细胞受体库的使用
对来自初次应答和再次应答二者的流感NP366-374特异性CD8 T细胞的TCRE基因座进行深度测序。对于初次应答，在感染后第10天收集小鼠肺和脾组织。对于再次应答，在感染后第28天用WT病毒攻击疫苗接种的小鼠，并且在攻击后第10天收集组织。为了分离NP特异性CD8细胞，收集小鼠肺和脾组织并且产生单细胞悬浮液。T细胞群体使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒(Stemcell)富集，并且用CD3-efluorofore450、CD8a-FITC和与PE缀合的NP366-374四聚体染色。NP阳性CD8 T细胞通过FACS分选出。对总计18个样品进行了深度测序(Adaptivebiotech)，包括用于初次应答的10只小鼠(5只用于WT疫苗接种并且5只用于HIS疫苗接种)和用于再次应答的8只小鼠(4只用于WT疫苗接种并且4只用于HIS疫苗接种)。对于每个样品，通过immunoSEQ分析仪分析VDJ重组。将NP特异性T细胞的克隆性计算为归一化的香农熵(Shannon’s entropy)的倒数。
u.确定雪貂中的病毒复制和保护效果
雪貂实验在中国疾病控制与预防中心(Center for Disease Control andPrevention，China)的ABSL-2实验室的动物设施中进行。所有动物通过HAI确定为对循环季节性流感病毒为血清阴性的。为了评价HIS和WT病毒的复制，将18只雪貂分成3组(每组6只雪貂)并且用500Pl的1×106TCID50 HIS或WSN对它们进行鼻内接种。PBS用作对照。每天观察并且记录体重、体温和临床症状。在接种后第1天、第3天、第4天、第7天、第9天和第14天，将鼻洗液和直肠拭子收集在1.5ml PBS中。在接种后第3天，将HIS或WSN组中的3只雪貂和PBS组中的1只雪貂无痛处死并且收集组织样本(肺、气管和鼻甲)。
为评价保护效率，将8只雪貂用1×106TCID50HIS接种。PBS用作对照。在接种后第35天，分别用1×107TCID50的A/WSN/33(H1N1)或1×106TCID50的A/California/07/09(H1N1pdm)对雪貂进行鼻内攻击。每天记录体重、体温和临床症状。在攻击后第1天、第3天、第4天、第7天和第9天，将鼻洗液和直肠拭子收集在1.5ml PBS中。在攻击后第3天，将每组中的2只雪貂无痛处死。将组织样本(肺、气管和鼻甲)收集在1ml PBS中并使用不锈钢球和组织裂解仪(TissueLyserII QIAGEN)在25Hz运行5min来匀浆。匀浆的组织、鼻洗液和直肠拭子的上清液中的病毒滴度使用TCID50在MDCK细胞上检查。雪貂实验被中国国家病毒性疾病控制与预防研究所的动物伦理委员会(Animal Ethics Committee of NationalInstitute for Viral Disease Control and Prevention，China)批准。
v.用于雪貂实验的病毒滴度测定
在96孔平底细胞培养板中用包含2μg/ml TPCK-胰蛋白酶的病毒培养基在MDCK细胞中检测鼻洗液、直肠拭子和组织样品的病毒滴度(TCID50)。将鼻洗液和直肠拭子的连续半log10稀释液50μl或组织样品的10倍稀释液50μl添加到MDCK细胞并且在37℃孵育1小时。将100μl的病毒培养基添加到每个孔并且在37℃孵育18h至20h。细胞用预冷的80％丙酮固定10min，随后使用1∶4000的抗甲型流感NP单克隆抗体池(IRR)和1∶2000的与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(KPL)进行ELISA。每个样品以一式三份滴定。每个样品的TCID50通过ReedMuench方法计算。
w.分析T细胞和抗体表位区域中的突变的适合度成本
T细胞表位、抗体线性表位和抗体构象表位序列根据免疫表位数据库和分析资源(IEDB)提取(58)。我们包括了对于WSN病毒具有＞90％的保守性的表位的分析。对于T细胞表位，仅考虑人类表位。比较了表位区域内或外的突变的RF评分。
x.向蛋白结构、基因表达、病毒复制、聚合酶活性的映射
我们将潜在的干扰素敏感残基的列表映射到蛋白结构上。我们推断，如果一个残基与干扰素通路相互作用，那么它更可能位于可暴露的表面。此外，同一结构域或同一口袋周围的多个突变显示相似的表型是可能的。例如，我们观察到干扰素敏感突变的两个簇，分别地位于PB2蛋白和M1蛋白的N末端。因此，我们优选地挑选簇集在蛋白表面的残基用于验证(图1D)。我们总计构建24个单突变并且在病毒复制的背景下检查它们的干扰素敏感性。引入NS1上的R38A-K41A双突变作为阳性对照。我们首先通过用MOI0.1感染A549细胞来评价这些突变的病毒复制。在感染后48h对TCID50定量。对于病毒复制，所有突变显示为中立或几乎中立。此外，我们通过小基因组复制子测定测量了聚合酶复合物(PB2、PB1、PA和NP)中的突变的聚合酶活性。与病毒生长一致，所有选择的突变的聚合酶活性是几乎完整的。我们通过用具有和没有干扰素选择的A549细胞感染它们进一步检查了这些突变的干扰素敏感性。因为在干扰素选择下病毒生长的减少更显著，所以与野生型WSN病毒相比，所有突变体显示出更高的敏感性。虽然不如NS1上的R38A-K41A突变那样引人注目，但内部基因上的24个突变中的8个显示出与野生型相比更高的干扰素敏感性。它们中的8个显示出显著更高的干扰素敏感性。
为了进一步检查每个突变体是否可以诱导更高的干扰素产生或是抑制干扰素应答缺陷的，我们用不同的突变体以MOI＝1感染A549细胞并且在感染后6h通过RT-qPCR检验基因表达。与野生型相比，PB2上的三个突变(N9D、Q75H、T76A)和M1上的三个突变(N36Y、R72Q、S225T)诱导显著更高的IFN-β基因表达(图1F)。可以观察到ISG54的诱导是更引人注目，与IFNb相同，ISG54还是IRF3靶基因。我们还检查了感染后的IRF3核易位。与基因表达结果一致，诱导更高的IFNb表达的这6个突变还诱导强的IRF3核易位，指示更强的IFN产生和应答。IFN的更高诱导依赖MAVS而不依赖STING，因为敲除MAVS将消除诱导，而STING敲除则无影响。这些结果表明PB2上的三个突变(N9D、Q75H、T76A)和M1上的三个突变(N36Y、R72Q、S225T)可能在感染后的早期时间点损失抑制干扰素产生的功能。然而，另外两个突变(PB1L155H、PA E181D)不诱导更高的干扰素产生。这两种突变在IFN产生具有缺陷的vero细胞中仍然是IFN敏感的，指示它们可能损失对下游干扰素通路(JAK-STAT通路或ISG功能)的抑制。可以进行JAK-STAT通路或ISG的siRNA筛选或cDNA过表达筛选以鉴定与突变体相互作用的细胞因子。
y.安全性、效率和体外生长
安全性和效率是疫苗开发的两个主要考虑因素。干扰素敏感突变的组合产生对干扰素更敏感的病毒，并且该病毒促进了对作为减毒活疫苗候选物的潜在用途的探索。在一方面，干扰素敏感表型将使病毒在体内极大地减毒，在另一方面，干扰素系统的更高诱导可能诱导更强的适应性免疫应答。此外，因为多种突变的组合位于不同的基因区段中并且对于没有干扰素选择的病毒复制大多是中性的，所以由于新发生突变或基因分配导致回复突变体的风险大大减少。
产生减毒活疫苗候选物的另一个重要考虑因素是病毒体外生长的能力。毒株应当保留足以用于大规模生产的生长能力。因此，为了产生一种组合毒株，我们首先挑选那些可以诱导更高干扰素产生的毒株，然后我们尝试添加另外的干扰素敏感突变同时保持病毒体外复制能力。在测试了多于一种组合后，我们选择了这些组合中的一种，我们称其为HIS毒株。它包含来自PB2的3个突变(N9D、Q75H、T76A)、M1上的3个突变(N36Y、R72Q、S225T)和NS1上的2个突变(R38A、K41A)。HIS病毒对干扰素处理高度敏感(图2C)。干扰素敏感性显著高于NS1突变(R38A-K41A)，指示PB2和M1上的突变的累积影响。我们还通过TCID50测定对具有IFN能力的A549细胞和IFN缺陷的vero细胞中的WT、NS1突变体和HIS病毒的病毒生长进行定量。在A549细胞中，HIS病毒与WT相比显示出约2个对数的减毒，这比单独的NS1双突变更有害。然而，HIS病毒在Vero细胞中的生长被恢复，Vero细胞与野生型细胞相比以相似的速率生长并且达到相似的峰值病毒载量。HIS病毒在A549细胞中诱导更高的干扰素产生和应答(图2D、2I)。在感染后的早期时间点(6h)，它可以诱导更高的IFNb和ISG54基因转录。并且在感染后24h，某些ISG(ISG15、IFI6、RIG-I、Mx1)的诱导也显著高于野生型。为了检查基因转录的全面变化，我们在感染后6h对WT、NS1 R38A-K41AHIS和模拟对照病毒感染的A549细胞进行mRNA测序。进行生物学重复。将原始读段与人类基因组组装体比对，并且将单独基因的表达水平表示为每百万总读段的读段(RPM)。使用Edge包用于统计学分析。与模拟感染的细胞相比，对于HIS感染的细胞，381个基因显著地上调(倍数变化＞2并且p＜0.01)(图2E)，并且181个基因下调。对上调的基因的基因本体(GO)富集分析揭示I型干扰素产生和应答相关的基因被高度富集。前4个GO项(term)全部与干扰素相关的防御应答相关。与NS1突变相比，干扰素产生和ISG的上调在HIS中更显著。这表明HIS和野生型病毒的细胞应答的关键差异依赖于诱导干扰素应答的能力。
为了检查HIS病毒的IFN敏感表型是否是WSN背景非依赖的，我们将相同的8个突变引入PR8背景中。如预期的，HIS病毒在PR8背景上也显示出比WT PR8或NS1突变更高的IFN敏感性。
我们接下来在小鼠模型中研究了HIS病毒的复制和致病性。用WT病毒或HIS病毒以105TCID50或106TCID50的剂量对6-8周Balb/c小鼠鼻内接种。每天监测体重减轻持续10天。106TCID50的WT病毒导致所有动物的显著体重减轻，而相同量的HIS不引起体重减轻。105TCID50的WT病毒引起非常轻的(～5％)体重减轻并且快速地恢复。因此，我们一致地使用105TCID50作为用于进一步研究的疫苗接种剂量。
FDA批准的唯一LAIV是一种重组病毒，其内部(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)区段来源于冷适应的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)，因此是温度敏感(TS)并且减毒的。温度敏感表型来自3个聚合酶基因的5个突变：PB1(391E、581G和661T)、PB2(265S)和NP(34G)。相似的表型可以通过在不同的毒株中引入相同的突变实现，包括我们在本文使用的A/WSN/33毒株。因此，我们构建并且使用温度敏感WSN(WSN-TS)毒株作为对照。我们进一步研究了疫苗接种的小鼠的肺中的病毒复制。小鼠肺的病毒滴度通过在疫苗接种后第2天的TCID50和病毒拷贝数定量(图3L)。HIS病毒的复制显著低于WT和NS1 R38A-K41A突变，并且与WSN-TS病毒相当。我们还对HIS和野生型病毒进行时间标度病毒复制测定。在疫苗接种后2小时、6小时、24小时、48小时和120小时收集小鼠肺样品并且对病毒拷贝数定量。WT病毒显示出稳健的病毒复制能力，病毒峰出现在48h。相比之下，HIS病毒在肺组织中仅在早期时间点显示出非常有限的复制，随后拷贝数稳定下降。这表明HIS病毒在动物模型中是高度减毒的，其作为疫苗候选物是安全的。为了检查减毒是否是由于IFN敏感性，我们进一步测试IFNAR-/-小鼠的病毒复制。HIS病毒的复制被完全挽救回WT在IFNAR-/-小鼠中的水平，指示IFN应答能力使HIS病毒在野生型小鼠中减毒(图3M)。
为了进一步检查在体内感染后的全面基因转录变化，我们在HIS和WT病毒感染后6小时、24小时、48小时、120小时进行了肺样品的mRNA测序。与模拟感染的对照相比，IFN通路在野生型病毒感染后48小时上调最显著，与病毒复制相关。虽然复制高度减弱，但HIS病毒还显示出某些IFN相关的基因的早期但显著的上调(图3E、3F)。观察到上调在感染后6h和24h最明显。
z.适应性免疫应答和保护
因为HIS病毒在体内高度减毒，因此然后我们检查了它是否仍然可以诱导稳健的适应性免疫应答用于保护。我们首先评价了体液应答。用105TCID50 WT病毒和HIS病毒对Balb/c小鼠进行鼻内感染。在感染后14天、21天和28天，收集血清样品，并且通过ELISA评估HA特异性抗体。我们从不同的病毒株：WSN、PR8、HK68、和Viet04纯化了4种类型的HA蛋白。WSN和PR8属于H1，HK68是H3，并且Veit04是H5。根据HA蛋白的分类，H1和H5属于I类，而H3属于II类。对于WT和HIS疫苗接种的小鼠，在所有三个时间点，都检测到针对WSN、PR8和Veit04HA蛋白的特异性抗体。抗体滴度在整个感染后的几天内一直递增。HIS病毒引发与WT相比更少量的特异性抗体，主要是由于减弱的复制。值得注意地，使用ELISA测定对于WT病毒和HIS病毒的针对HK58 HA的抗体都在检测限值下，表明可以识别跨I类和II类HA的保守表位的抗体可能有限。我们还通过血凝素抑制(HI)测定进行了中和测定(图4E)。将8个HA单位的WSN病毒与热失活的血清的连续稀释液在37度孵育2h，随后检查HA能力。与ELISA结果一致，HIS病毒引发显著量的中和抗体，尽管不如WT那样高。
我们然后检查了HIS病毒诱导T细胞应答的能力。对6-8周雌性C57/B6小鼠感染105TCID50的WT病毒和HIS病毒或用DMEM模拟感染。从小鼠肺样品制备了单细胞悬浮液，并且通过四聚体染色检查T细胞应答。HIS病毒产生了与野生型相比相似水平的NP特异性T细胞，虽然复制低三个对数。此外，我们通过肽刺激测定评价疫苗接种后1个月的记忆性T细胞应答。将管细胞与已知表位的病毒肽孵育过夜，并且通过细胞内细胞因子染色对分泌IFN-g的CD8 T细胞的量定量。同样，在HIS和WT疫苗接种的小鼠之间观察到相似水平的记忆性T细胞应答。这些结果表明因为免疫逃逸功能的敲除，HIS刺激更稳健的T细胞应答。
最后，我们检查了HIS病毒是否可以保护小鼠免受攻击。对6-8周雌性C57/B6小鼠鼻内接种105TCID50的WT、NS1 R38A-K41A、HIS、WSN-TS病毒或用DMEM模拟感染。每组使用4只小鼠。所有小鼠在疫苗接种后21天用105TCID50的WT病毒攻击，并且在攻击后第2天对肺组织中的病毒滴度定量。通过RT-qPCR和TCID50测定二者，我们观察到HIS疫苗接种的小鼠中与模拟疫苗接种相比～3个对数的滴度下降。病毒滴度的减少比WSN-TS疫苗接种的组更显著(图4Q)。
我们然后用三种异源毒株(PR8、A/Cal/04/09和X31)以致死剂量攻击了HIS疫苗接种的小鼠。在广泛的存活率、体重减轻的百分比和临床评分方面，观察到强的保护(图5D、5E)。
虽然NS1是流感基因组中研究得最充分的IFN拮抗剂，但其他蛋白中的抗IFN功能区域最近已经被认识到。据报道，PB2和PB1F2可以与MAVS结合并且抑制干扰素产生；PB1和PA中的ESIE基序可以介导I型干扰素应答，并且新出现的H7N9的NP可以对抗抗病毒ISG：MxA。在此，使用高通量遗传学方法，我们已经鉴定出PB2、PA、PB1和M1蛋白中的多个IFN敏感突变，教导了对应的WT蛋白的抗IFN功能。因为抗IFN功能区域对于有效的体内病毒复制是必需的，所以这些功能区域分布在不同的区段中是合理的。鉴定出的IFN敏感突变也对IFN系统的不同的部分起作用。PB2和M1上的突变可以诱导更高的IFN产生，指示它们在IFN系统的上游起作用。在另一方面，PB1和PA上的突变不能够诱导更高的IFN产生和应答，并且在IFN缺陷的Vero细胞中仍然保持敏感性，表明它们可能与JAK/STAT通路或特异性抗病毒ISG相互作用。
III.过程步骤
a.使用遗传学平台鉴定干扰素敏感突变
为了系统地鉴定跨整个流感基因组的干扰素敏感突变，我们使用高通量遗传学平台进行干扰素选择。
图26是图示使用遗传学平台制备基因组的方法的流程图。
该方法包括以下步骤。
框2600代表任选地构建突变体质粒文库。
在一个实例中，在流感A/WSN/1933(H1N1)毒株的骨架上构建了突变体质粒文库。为了控制突变体文库大小，将整个病毒基因组分成240bp的小片段，并且使用易错聚合酶将随机突变引入每个小片段中以产生混合的突变体群。在一个或更多个实例中，每个得到的质粒群体被认为是突变体质粒文库，具有～1000个不同的突变，并且建立了总计52个质粒文库以覆盖整个基因组。
框2602代表将突变体DNA文库与多于一个编码病原体基因组的不同片段的质粒共转染，以形成突变体病原体文库。在一个或更多个实例中，3000万个293T细胞用DNA文库与七个其他野生型质粒一起转染以重建突变体病毒文库。
框2604代表将所述突变体病原体文库在具有干扰素和没有干扰素的宿主细胞中传代，以形成从用具有干扰素的宿主细胞传代获得的多于一个第一感染的区段和从用没有干扰素的宿主细胞传代获得的多于一个第二感染的区段。在本文描述的说明性实施方案中，将突变体病毒文库在经历浓度为1000U/ml的干扰素选择的A549细胞中传代，在选择后24h收集病毒，并且还进行了生物学重复。在一个或更多个实例中，使用1500万个A549细胞以MOI 0.05传代病毒文库24h。在一个或更多个实例中，对于转染和感染二个步骤进行生物学重复。
框2606代表将每个感染的区段进行基因测序以鉴定单核苷酸突变或一个或更多个核苷酸突变。
框2608代表计算每个感染的区段中的每个单核苷酸突变、或一个或更多个核苷酸突变的每一个的相对适合度评分(RF评分)，其中RF评分是感染的区段/感染文库中的单核苷酸突变或一个或更多个核苷酸突变的频率与突变体DNA文库的频率相比的比率。例如，突变体病毒的相对适合度(RF)评分可以被计算为选择的病毒文库中的相对频率与质粒文库中的相对频率的比率。在一个或更多个实例中，跨越基因组的～90％的核苷酸位置被覆盖，并且～95％的单个突变在DNA文库中被检测到。在一个或更多个实施方案中，为了进一步增加病毒适合度的测量，进行过滤以鉴定仅在输入文库中出现＜0.05％的突变。在一个或更多个实例中，沉默突变形成正态分布，RF评分集中在1附近。在一个或更多个实例中，沉默突变和致死突变之间存在清楚的分离，表明在传代期间的足够选择。
此外，在一个或更多个实施方案中，干扰素敏感性可以被计算为具有和没有干扰素选择的相对适合度的差异，并且可以观察生物学重复之间的相关性。
框2610代表选择在第一感染的区段中具有少于0.2的RF评分并且在第二感染的区段中具有大于0.5的RF评分的所述突变，以形成选择的突变。在一个或更多个实例中，用于选择的基本标准包括适合度的RF评分＞0.5；在干扰素选择下的适合度的RF评分＜0.2；并且优选当突变成不同的氨基酸时给出相似干扰素敏感表型的残基。
框2612代表形成包含选择的突变的基因组。物质的基因组组合物可以以许多方式实现，包括但不限于下文列出的以下实施方案。
1.一种遗传工程化的病原体基因组，其中，与野生型病原体相比，遗传工程化的基因组包含核苷酸突变的组合，所述核苷酸突变的组合被选择以(1)增加病原体对I型干扰素的敏感性，和(2)当用作体内免疫原时诱导对病原体的抗体和/或T细胞应答，所述病原体的抗体和/或T细胞应答是当缺乏多于一个突变的野生型病原体基因组被用作体内免疫原时诱导的抗体和/或T细胞应答的至少10％；或与在干扰素不存在下的病原体在宿主细胞中的复制相比，将在I型干扰素存在下病原体在宿主细胞中的复制抑制至少50％。这种物质的基因组组合物可以以许多方式实现，包括但不限于下文列出的以下实施方案。
2.根据实施方案1所述的物质的组合物，其中组合将包含干扰素的宿主细胞中的病原体的复制与没有干扰素的宿主细胞中的复制相比抑制例如至少10倍、至少100倍的倍数或10-1000范围内的倍数。
3.根据先前实施方案1-2中任一项所述的物质的组合物，其中组合包含核苷酸突变，在包含干扰素的宿主细胞中，每个核苷酸突变具有少于0.2的相对适合度评分(RF)，并且在没有干扰素的宿主细胞中，每个核苷酸突变具有大于0.5的RF评分，RF评分定义为宿主细胞中核苷酸突变的频率与突变体DNA文库中核苷酸突变的频率的比率。
4.根据前述实施方案1-3中任一项所述的物质的组合物，其中病原体是甲型流感病毒，并且组合至少维持对病毒的抗体应答。
5.根据前述实施方案1-4中任一项所述的物质的组合物，其中突变不包括仅在少于例如0.1％或1％或0.1％-5％的突变体DNA文库中出现的突变。
6.根据前述实施方案1-5中任一项所述的物质的组合物，其中每个核苷酸突变位于基因组的不同区段中。
7.根据前述实施方案1-6中任一项的物质的组合物，其中组合选自在基因组中例如＞50％、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％或50％-95％的核苷酸位置处的突变的集合。
8.根据前述实施方案1-7中任一项所述的物质的组合物，其中核苷酸突变包括单核苷酸突变、双核苷酸突变或三核苷酸突变，使得组合被选择为具有单核苷酸分辨率、双核苷酸分辨率或三核苷酸分辨率。
9.根据前述实施方案1-8中任一项所述的物质的组合物，其中核苷酸突变改变由基因组编码的多肽的氨基酸序列(例如，具有单氨基酸分辨率，例如，使得蛋白可被编码为具有单氨基酸分辨率)。
10.根据前述实施方案1-9中任一项所述的物质的组合物，其中组合包括例如至少4个核苷酸突变、至少5个核苷酸突变、至少6个核苷酸突变、至少7个核苷酸突变或4-8个范围内的多个核苷酸突变。
11.根据前述实施方案1-10中任一项所述的物质的组合物，其中病原体是流感病毒(例如甲型流感)。
12.根据实施方案11所述的物质的组合物，其中病原体是甲型流感病毒，并且甲型流感病毒基因组编码突变，该突变包括PB2中的氨基酸位置N9、Q75或T76处的至少一个氨基酸置换；M1中的氨基酸位置N36、R72或S225处的至少一个氨基酸置换，和/或NS1中的氨基酸位置R38或K41处的至少一个氨基酸置换。
13.根据实施方案12所述的组合物，其中病原体是甲型流感病毒，并且甲型流感病毒基因组编码突变，该突变包括PB2中的选自N9D、Q75H和T76A的至少一个氨基酸置换；M1中的选自N36Y、R72Q和S225T的至少一个氨基酸置换，和/或NS1中的选自R38A和K41A的至少一个氨基酸置换。
14.根据前述实施方案1-13中任一项所述的物质的组合物，其中病原体包含含有残基的蛋白，并且基因组编码蛋白以在蛋白的表面上形成簇集的残基。
15.根据前述实施方案1-14中任一项所述的物质的组合物，其中遗传工程化的基因组包含核苷酸突变的组合，所述核苷酸突变的组合被选择用于抑制病原体在I型干扰素存在下在宿主细胞中的复制，使得用1×107pfu的物质的组合物疫苗接种小鼠不导致小鼠的死亡。
框2614代表任选地制备包含框2612的物质的组合物的疫苗、治疗剂或其他药物组合物。
因此，图26进一步图示了制备基因组的方法，该方法包括系统性地鉴定基因组的免疫逃逸功能区域；并且消除免疫逃逸功能区域以调节基因组的复制适合度和对包含基因组的病原体的抗体应答。
本文描述的示例性方法可以被用于以单核苷酸分辨率或单氨基酸分辨率鉴定影响IFN的产生和对IFN的敏感性的突变。在一个或更多个实施方案中，高分辨率使我们能够精确地对病毒重新工程化，这在以前是不可能的。例如，我们能够理性地改变一个定义的位置处的一个氨基酸。在另一方面，如美国专利第9,387,240号(50)中描述的，缺失突变可能影响病毒蛋白的其他功能。然而，如本文说明的，我们鉴定并且利用了与专利9,387,240(50)中描述的突变不同的(例如，8个)突变。8个突变的每一个对INF诱导非常特异并且不影响其他功能。此外，在本文实施例章节中描述的甲型流感突变体的实施方案在体内被强烈地抑制，并且即使在1×10∧7pfu不导致任何疫苗接种的小鼠的死亡。然而，美国专利第9,387,240号(50)描述了在用NS1-99以5×10^6pfu疫苗接种后2只小鼠死亡。
b.制备物质的组合物并且产生免疫应答的方法
图27图示了制备物质的组合物例如包括图26中的框2612的物质的组合物的方法。
框2700代表将野生型甲型流感病毒的基因组突变以产生具有多于一个突变的甲型流感病毒基因组，所述多于一个突变被选择用于(A)增加甲型流感病毒对I型干扰素的敏感性；和(b)当用作体内免疫原时，诱导对甲型流感病毒的抗体和/或T细胞应答，所述抗体和/或T细胞应答为当缺乏多于一个突变的野生型甲型流感病毒基因组被用作体内免疫原时诱导的抗体和/或T细胞应答的至少5％、10％、25％或50％。
框2702代表最后结果，即包含甲型流感病毒基因组的物质的组合物，该甲型流感病毒基因组具有多于一个突变，所述多于一个突变被选择用于(a)增加甲型流感病毒对I型干扰素的敏感性；和(b)如框2700中描述的，诱导对甲型流感病毒的抗体和/或T细胞应答。这种物质的基因组组合物可以以许多方式实现，包括但不限于下文列出的实例。
1.物质的组合物，其中多于一个突变中的至少一个是甲型流感病毒基因组：PA、PB1、PB2、NS1或M1基因中的至少一个单核苷酸突变。
2.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中至少一个突变存在于PB2中的氨基酸位置N9、Q75或T76处，和/或存在于M1中的氨基酸位置N36、R72、S225处，和/或存在于在NS1中的氨基酸位置R3A、K41处。
3.根据前述实施方案1-2中任一项所述的组合物，其中至少一个突变选自PB2中的N9D、Q75H、T76A中的至少一个，和/或选自M1中的N36Y、R72Q、S225T中的至少一个，和/或选自NS1中的R38A、K41A中的至少一个。
图27中图示的方法可用于通过向人类、猪或鸟施用本文公开的组合物而在人类、猪或鸟(例如鸭)中产生对甲型流感的免疫应答。
优点和改善
具有快速的基因组复制、高突变率和基因组分配，流感病毒不断地进化并且适应于多种选择压力，包括不同的宿主应答。I型IFN系统(IFN)是先天免疫应答的最至关重要的组分之一，对于限制流感复制起着必不可少的作用。它还是先天免疫应答和适应性免疫应答之间的桥梁。确定哪些病毒蛋白，更特别地是哪些结构域或残基参与管理干扰素应答，对于更好地理解病毒-宿主相互作用的机制至关重要并且为疫苗设计提供信息。
因为这些蛋白对于病毒复制是必需的，产生突变是在病毒复制的背景下检查它们的潜在抗IFN功能的最直接方法。特别地，使用I型IFN系统是先天免疫应答的关键因素(player)的事实，我们通过将IFN逃逸基因突变将病毒工程化为IFN敏感并且从而有效地将病毒在体内减毒。因为IFN对于T细胞和B细胞应答的产生至关重要，所以用作疫苗的诱导IFN的毒株刺激更稳健的适应性免疫应答(尽管病毒的复制降低)。此外，病毒的抗IFN功能区域通常处于多个基因座上：通过选择引入到疫苗株中的突变的组合，可以对复制的水平和诱导保护性免疫应答的能力进行微调，以最大化效力并限制风险。
最后，因为NS1是流感基因组中主要的IFN对抗物，不同形式的截短的NS1蛋白(deltaFlu)也被用作疫苗候选物并且显示出令人印象深刻的CD4、CD8 T细胞发育和抗体产生。然而，一个缺陷是因集中于一种蛋白，存在基因重排产生回复突变体的风险。在另一方面，本发明的实施方案使用全基因组筛选以系统性地鉴定跨全基因组的对病毒复制中立的IFN敏感突变。通过将位于不同的基因区段的多个突变组合在一起，降低了由于新发生突变或基因分配的回复体的风险同时维持疫苗接种的效率。
因此，我们在此公开了一种用于开发减毒活疫苗的框架：系统性地鉴定病毒基因组上的免疫逃逸功能区域，然后消除免疫逃逸功能区域，同时维持和/或调节复制适合度。该系统性方法是用于开发减毒活疫苗和/或治疗剂的一种普遍适用的方法，所述疫苗和/或治疗剂刺激对一般病毒(包括但不限于流感病毒、寨卡病毒和NiV病毒)以及其他类型的病原体的抗体应答。包含根据本文描述的一种或更多种方法遗传工程化的病原体的治疗剂将对于感染有药物耐受性病毒的患者特别地有用，并且这样的患者群体将适用于第一组临床试验。此外，本文描述的一种或更多种方法适于在人类和农业(例如家禽、猪)应用中使用。
关于本发明的一个或更多个实施方案的其他信息可以见于参考文献(47)中。
IV.本文描述的蛋白和病毒的序列。
a.根据本发明的实施方案的甲型流感WSN毒株HIS
第一区段(WSN_flu1)(SEQ ID NO：1)
第二区段(WSN_flu2)
第三区段(WSN_flu3)
第四区段(WSN_flu4)
第五区段(WSN_flu5)
第六区段(WSN_flu6)
第七区段(WSN_flu7)
第八区段(WSN_flu8)
b.PB1(聚合酶碱性蛋白1)(SEQ ID NO：2)
c.PB2(聚合酶碱性蛋白2)(SEQ ID NO：3)
d.PA(聚合酶酸性蛋白)(SEQ ID NO：4)
e.M1(基质蛋白1)(SEQ ID NO：5)
f.M2基质蛋白2(SEQ ID NO：6)
g.NS1非结构蛋白1(SEQ ID NO：7)
参考文献
注意：本申请引用了多个不同的出版物，如整个说明书通过括号中包括的参考编号例如(x)指示的。根据这些参考编号排序的这些不同出版物的列表可以见于下文。
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1.M.T.Osterholm，N.S.Kelley，A.Sommer，E.A.Belongia LancetInfect.Dis.12，36-44(2012).
2.A.C.Tricco et al.，BMC Med.11，153(2013).
3.M.Darvishian，M.J.Bijlsma，E.Hak，E.R.van den Heuvel，LancetInfect.Dis.14，1228-1239(2014).
4.A.Garcia-Sastre，Virus Res.162，12-18(2011).
5.J.M.González-Navajas，J.Lee，M.David，E.Raz，Nat.Rev.Immunol.12，125-135(2012).
6.A.Iwasaki，P.S.Pillai，Nat.Rev.Immunol.14，315-328(2014).
7.J.W.Schoggins et al.，Nature 472，481-485(2011).
8.J.P.Huber，J.D.Farrar，Immunology 132，466-474(2011).
9.A.Le Bon et al.，Immunity 14，461-470(2001).
10.R.M.Welsh，K.Bahl，H.D.Marshall，S.L.Urban，PLOS Pathog.8，e1002352(2012).
11.A.Le Bon，D.F.Tough，Curr.Opin.Immunol.14，432-436(2002).
12.J.Crouse，U.Kalinke，A.Oxenius，Nat.Rev.Immunol.15，231-242(2015).
13.F.Krammer，P.Palese，Nat.Rev.Drug Discov.14，167-182(2015).
14.J.Talon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，4309-4314(2000).
15.C.
16.K.M.Graef et al.，J.Virol.84，8433-8445(2010).
17.M.Pérez-Cidoncha et al.，J.Virol.88，4632-4646(2014).
18.N.C.Wu et al.，Sci.Rep.4，4942(2014).
19.N.C.Wu et al.，J.Virol.88，10157-10164(2014).
20.E.Hoffmann，G.Neumann，Y.Kawaoka，G.Hobom，R.G.Webster，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6108-6113(2000).
21.Y.Du et al.，MBio 7，e01801-16(2016).
22.N.C.Wu et al.，PLOS Genet.11，e1005310(2015).
23.N.C.Wu et al.，BMC Genomics 17，46(2016).
24.S.F.Elena，P.Carrasco，J.-A.Daròs，R.Sanjuán，
EMBO Rep.7，168-173(2006).
25.E.Visher，S.E.Whitefield，J.T.McCrone，W.Fitzsimmons，A.S.Lauring，PLOSPathog.12，e1005856(2016).
26.B.G.Hale，R.A.Albrecht，A.Garcia-Sastre，Future Microbiol.5，23-41(2010).
27.B.G.Hale，R.E.Randall，J.Ortin，D.Jackson，J.Gen.Virol.89，2359-2376(2008).
28.H.F.Maassab，M.L.Bryant，Rev.Med.Virol.9，237-244(1999).
29.H.Jin，H.Zhou，B.Lu，G.Kemble，J.Virol.78，995-998(2004).
30.M.J.Memoli et al.，MBio 7，e00417-e16(2016).
31.D.M.Carragher，D.A.Kaminski，A.Moquin，L.Hartson，T.D.Randall，J.Immunol.181，4168-4176(2008).
32.M.B.Doud，S.E.Hensley，J.D.Bloom，PLOS Pathog.13，e1006271(2017).
33.S.Mueller et al.，Nat.Biotechnol.28，723-726(2010).
34.L.Si et al.，Science 354，1170-1173(2016).
35.C.-Y.Wu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.114，280-285(2017).
36.L.Wang et al.，Cell Host Microbe 21，334-343(2017).
37.J.Steel et al，J.Virol.83，1742-1753(2009).
38.A.Pflug，D.Guilligay，S.Reich，S.Cusack，Nature 516，355-360(2014).
39.S.Reich et al.，Nature 516，361-366(2014).
40.S.J.Gamblin et al..Science 303.1838-1842(2004)
41.PB1序列在具有地址为https://www.fludb.org/brc/proteinSequence.spg？ncbiProteinId＝ABF47963&decorator＝influenza的网站找到
42.PB2序列在具有地址为https：//www.fludb.org/brc/proteinSequence.spg?ncbiProteinId＝ACF54608&decorator＝inflaenza的网站找到
43.PA序列在具有地址为https：//www.fludb.org/brc/proteinSequence.spg？ncbiProteinId＝BAA01431&decorator＝influenza的网站找到
44.M1序列在具有地址为https:/wwww.fludb.org/brc/proteinSequence.spg？ncbiProteinId＝AAA91325&decorator＝influenza的网站找到
45.M2序列在具有地址为https://www.fludb.org//brc/proteinSequence.spg？ncbiProteinId＝AAA91324&decorator＝influenza的网站找到
46.NS1序列在具有地址为https://www.fludb.org/brc/prteinSequence.spg?ncbiProteinId＝ACF54603&decorator＝influenza.的网站找到
47.Yushen Du1等人，Genome-wide identification of interferon-sensitivemutations enables influenza vaccine design，Science19Jan 2018：Vol.359，6373期，pp.290-296DOI：10.1126/Science.aan8806，包括补充信息。
48.H.Jin et al，Multiple amino acid residues confer temperaturesensitivity to human influenza virus vaccine strains(flumist)derived fromcold-adapted a/ann arbor/6/60.Virology.306，18-24(2003).
49.Vincent AL1，Ma W，Lager KM，Richt JA，Janke BH，Sandbulte MR，GaugerPC，Loving CL，Webby RJ，Garcia-Sastre A.Live attenuated influenza vaccineprovides superior protection from heterologous infection in pigs
50.美国专利第9,387,240号
51.甲型流感毒株A/WSN/1933的完整序列可以在https：//www.fludb.org/brc/fluStrainDetails.spg？strainName＝A/WSN/1933(H1N1)&decorator＝influenza.
找到。
结论
本发明的优选的实施方案的描述到此结束。出于说明和描述的目的，已经展示了本发明的一个或更多个实施方案的前述描述。不意图于穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。根据上文的教导，许多修改和变化是可能的。意图本发明的范围不受该详细描述限制，而是受其所附权利要求的限制。
