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高活性的β-木糖苷酶的制备和应用

2021-03-15 13:10:58

高活性的β-木糖苷酶的制备和应用

  技术领域

  本发明属于基因工程与酶工程领域,具体涉及高活性的β-木糖苷酶的制备和应用。

  背景技术

  随着社会的发展,人口增长和资源消耗使可再生资源的开发利用成为国际社会和学术界共同关注的问题,木聚糖是半纤维素的主要组成成分,广泛分布于高等植物的细胞壁中,是自然界中一种巨大的可再生生物资源,也是最容易提取、降解和利用的一类半纤维素。对木聚糖的彻底降解以实现生物转化需要一个完善的木聚糖酶系,主要包括木聚糖酶和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等,β-木糖苷酶可与木聚糖酶协同作用,将木聚糖彻底分解,是木聚糖降解的关键酶之一,包括β-木糖苷酶在内的木聚糖酶系已在多个领域具有广泛应用。在能源工业中,工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶系转化为木糖,而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料,在造纸工业的纸浆漂白中,β-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能;在医药行业中,木聚糖酶系水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用的中间转化产物,1998年Patel等人利用Moraxella.spβ-木糖苷酶水解10-去乙酰巴卡亭Ⅲ木糖苷和10-去乙酰紫衫醇木糖苷7位木糖残基,得到重要的中间产物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫衫醇,为紫衫醇的合成开辟了一条崭新的途径。

  β-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛,现已从细菌、放线菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分离得到,β-木糖苷酶是一种外切酶,主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖,水解产物为木糖,木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上,将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖,再由β-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端,将这些短链低聚木糖降解成木糖,β-木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键,释放出甙元。

  发明内容

  本发明的目的在于提供具有更高酶活的β-木糖苷酶。

  本发明的制备过程如下:

  1.从NCBI上获得β-木糖苷酶(beta-xylosidase,GenBank:XP_001210179.1),交生物公司合成,设计PCR引物F:5'-TATCGGAATTAATTCGGATCCATGACGAACGACGACCACGA-3',R:5'-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCACTTCAAGTGGATATCTCCCTTC-3',PCR反应结束后,加20μlCloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,采用NdeⅠ、BamHⅠ酶切pET20b(+)质粒,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coliJM109,挑取阳性克隆,送生物公司测序,将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达,得到含有野生型序列质粒的基因工程菌;

  2.质粒DNA的提取

  将携带有质粒pET20b(+)/PtXyl43的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中,于37℃,200r/min过夜培养后,使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒,具体操作按照说明书进行;

  3.易错PCR扩增与突变文库的构建

  以步骤二获得的质粒为模板,用NdeⅠ、BamHⅠ酶切使质粒线性化,用引物序列F:5'-TATCGGAATTAATTCGGATCCATGACGAACGACGACCACGA-3',R:5'-TGGTGGTG CTCGAGTGCGGCCGCTCACTTCAAGTGGATATCTCCCTTC-3',进行易错PCR扩增基因,易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer,dNTPs Mixture,引物各0.2μmol/L,模板DNA 200ng,Taq DNA聚合酶2.5U,5mmol/l Mn2+,0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl,7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件:95℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃2min,35个循环,72℃10min,加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,将pET20b(+)质粒用NdeⅠ、BamHⅠ酶切线性化,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coli BL21,涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子,所有转化子构成突变体文库;

  4.突变文库的高通量筛选

  将步骤三得到的转化后的菌液均匀地涂在预先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直径为9mm含有氨苄青霉素的LB平板上,涂抹的转化液用量以最终每个平板大约长出50个单菌落为宜,37℃培养15h左右,挑取突变文库单菌落,接种到含有600μl LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)的无菌2ml EP管中,37℃,200rpm恒温振荡培养至OD600=0.8,加入IPTG至终浓度为1.0mM,在25℃、200rpm条件下诱导培养16h,6000rpm离心10min,收集300μl上清液,加入20μl 50mM的pNPG,51℃水浴10min,观察颜色深浅,取颜色较深的突变子进行复筛,经初筛的突变子,在最适条件下诱导表达,超声波破碎提取粗酶液,以pNPG为底物,准确检测其酶活性,并以野生型β-木糖苷酶为对照样品比较酶活;

  5.酶活高于对照品的突变子测序,经序列比对,确定突变位点;

  6.突变体的生产,将步骤五的含有突变质粒的E.coli BL21发酵培养;

  7.突变体的纯化,经Ni-NTA亲和柱纯化;

  8.对突变体进行SDS-PAGE电泳;

  9.采用Bradford测定蛋白质浓度。

  本发明的有益效果是:

  获得了比野生型酶活性更高的突变体β-木糖苷酶。

  附图说明

  图1β-木糖苷酶SDS-PAGE电泳图

  图2野生型及突变体β-木糖苷酶三维图

  具体实施方式

  下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。

  实施例1

  本实施例涉及的材料和试剂见表1,实验仪器见表2;

  表1实验材料和试剂

  

  

  表2实验仪器设备

  LB培养基配方:胰蛋白胨10g/l,酵母粉5g/l,NaCl 10g/l,pH7.0;

  固体LB培养基:每100ml液体LB培养基加2g琼脂粉,高压灭菌;

  IPTG储存液(200mg/ml):用去离子水配制成200mg/ml异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,用0.22μm过滤器过滤除菌,分装成每管1ml,贮存于-20℃;

  氨苄青霉素储存液(200mg/ml):用去离子水配制成200mg/ml的氨苄青霉素(A mp)贮存液,用0.22μm过滤器过滤除菌,分装成每管1ml,贮存于-20℃;

  50×TAE电泳缓冲液:Tris 242g,冰乙酸57.1ml,0.5mol/l EDTA(pH8.0)100ml,用蒸馏水定容至1l;

  1.从NCBI上获得β-木糖苷酶(beta-xylosidase,GenBank:XP_001210179.1),交生物公司合成,设计PCR引物F:5'-TATCGGAATTAATTCGGATCCATGACGAACGACGACCACGA-3',5'-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCACTTCAAGTGGATATCTCCCTTC-3',PCR反应结束后,加20μlCloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,采用NdeⅠ、BamHⅠ酶切pET20b(+)质粒,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coliJM109,挑取阳性克隆,送生物公司测序,将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达,得到含有野生型序列质粒的基因工程菌;

  2.质粒DNA的提取

  将携带有质粒pET20b(+)/PtXyl43的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中,于37℃,200r/min过夜培养后,使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒,具体操作按照说明书进行;

  3.易错PCR扩增与突变文库的构建

  以步骤二获得的质粒为模板,用NdeⅠ、BamHⅠ酶切使质粒线性化,用引物序列F:5'-TATCGGAATTAATTCGGATCCATGACGAACGACGACCACGA-3',R:5'-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCACTTCAAGTGGATATCTCCCTTC-3',进行易错PCR扩增基因,易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer,dNTPs Mixture,引物各0.2μmol/L,模板DNA 200ng,Taq DNA聚合酶2.5U,5mmol/l Mn2+,0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl,7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件:95℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃2min,35个循环,72℃10min,加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,将pET20b(+)质粒用NdeⅠ、BamHⅠ酶切线性化,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coli BL21,涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子,所有转化子构成突变体文库;

  4.突变文库的高通量筛选

  将步骤三得到的转化后的菌液均匀地涂在预先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直径为9mm含有氨苄青霉素的LB平板上,涂抹的转化液用量以最终每个平板大约长出50个单菌落为宜,37℃培养15h左右,挑取突变文库单菌落,接种到含有600μl LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)的无菌2ml EP管中,37℃,200rpm恒温振荡培养至OD600=0.8,加入IPTG至终浓度为1.0mM,在25℃、200rpm条件下诱导培养16h,6000rpm离心10min,收集300μl上清液,加入20μl 50mM的pNPG,51℃水浴10min,观察颜色深浅,取颜色较深的突变子进行复筛,经初筛的突变子,在最适条件下诱导表达,超声波破碎提取粗酶液,以pNPG为底物,准确检测其酶活性,并以野生型β-木糖苷酶为对照样品比较酶活;

  5.将复筛通过的阳性克隆,送生物公司测序,测序结果见表3;

  6.突变体的生产

  将含有突变质粒的E.coli BL21活化后接入LB液体培养基中,37℃、180rpm培养10h左右制成种子液;然后在250ml三角瓶中加入50ml LB液体培养基(pH为7.0),接入5%(v/v)的种子液,37℃、180rpm药瓶培养72h;

  7.突变体的纯化

  发酵培养后的菌液在4℃,8000r/min下离心20min,收集上清液,4℃过滤除菌;将粗酶液注入平衡好的Ni-NTA亲和层析柱,上样完毕后静置2h,以便His-tag标签与填料中Ni2+充分结合;先用4ml洗涤缓冲液(50mmol/l Tris-HCl,300mmol/l NaCl,20mmol/l咪唑)洗涤过柱以洗去未结合的杂蛋白,再用洗脱缓冲液(50mmol/l Tris-HCl,300mmol/l NaCl,250mmol/l咪唑)洗脱与亲和柱结合的目标蛋白,此时收集酶液,将酶液置入透析袋内,将此透析袋浸入去离子水中,样品液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,用磁力搅拌每隔4h更换一次去离子水,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止;

  8.SDS-PAGE电泳

  SDS-PAGE电泳凝胶的制备参照试剂盒说明书,使用分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,以0.1%考马斯亮蓝R-250进行染色,见图1;

  9.蛋白质浓度测定

  具体操作方法根据Bradford法蛋白定量试剂盒说明书进行操作。

  野生型和突变型β-木糖苷酶在生产水平上没有明显差异,纯化酶的回收率约为54.6-60.5%,纯化后突变酶的纯度与分子量通过SDS-PAGE分析估计,突变酶分子量与野生型大小相当约52KD,野生型及突变体β-木糖苷酶三维见图2。

  表3突变体的测序结果

  实验一:酶活的测定方法

  β-木糖苷酶活性是由从底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)释放出对硝基苯酚(pNP)的量来确定的,测定体系总体积为800μl,反应体系为200μl,内含10μl 20mmol/l底物pNPX、185μl 100mmol/l pH 6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液、5μl稀释酶液,于65℃反应5min,然后加入600μl 1mol/l的Na2CO3溶液终止反应并显色,在405nm处测定光吸收值的增加量。一个酶活单位定义为在该反应条件下,1min内催化产生1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量。用对硝基苯酚作标准曲线,木糖苷酶对人工底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)水解后的产物为对硝基苯酚(pNP),碱性条件下它在405nm处有明显的吸收值。配制浓度为1μmol/ml的对硝基苯酚,然后用不同体积的对硝基苯酚和水混匀,使二者总体积为200μl,最后用同样的1mol/l的Na2CO3600μl终止显色,在405nm处测吸光值,pNP的量与A405成线性关系,线性回归后得到A405-pNP(μmol)标准曲线方程为:

  Y=24.315x+0.0006R2=0.9997

  x=对硝基苯酚的量(μmol)y=吸光度A405

  实验结果见表4。

  表4酶活测定结果

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