用于解卷积分区条码的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月31日提交的美国临时专利申请号62/624,400的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
偶联寡核苷酸的珠被用于微流体检测应用，诸如具有许多不同分区(例如，液滴)的高通量测序。为了独特地鉴定各分区，可以用独特的条码序列标记珠。然而，为了确保分区仅有一个珠并因此被条码所独特地标记，通常调整珠浓度以使仅有约十分之一的分区被珠所占据。这导致分区的低利用率，并且增加检测样品所需的试剂以及样品的量。增加珠浓度将导致较高的分区占用率以及更大的分区利用率。检测样品所需样品和试剂的量将减少。相反地，较高的珠浓度将导致更多数量的分区具有超过一个珠。因此，一些划分的样品将被超过一个条码标记。在一些情况中，样品在超过一个条码之间被分割，这导致各条码灵敏度的损失。
发明概述
在一些实施方式中，提供了检测分区中多个条码存在与否的方法。在一些实施方式中，该方法包括，
形成分区，所述分区包含：正向引物，其包含条码和捕获序列，所述捕获序列与以下互补：靶核酸的3′序列，或其反向互补序列，其中不同分区包含具有不同条码序列的不同正向引物，以及分区ID标签寡核苷酸，所述分区ID标签寡核苷酸包含所述捕获序列的反向互补序列和可变分区ID标签序列；
在所述分区中，使至少一个正向引物与所述分区ID标签寡核苷酸杂交以形成杂交产物；
对所述杂交产物进行扩增以形成扩增子，其中至少一些扩增子由正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸形成；和
对所述扩增子进行测序，其中如果不同的正向引物与相同可变分区ID标签序列形成扩增子，那么认为所述不同的正向引物来自同一分区，其中
所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸在递送至所述分区时与同一底物连接；或
所述分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使聚合酶在扩增期间无法延伸所述封端3′端；或
所述分区ID标签寡核苷酸包含双链可变分区ID标签序列和一个或两个单链3′端，所述单链3′端包含所述捕获序列的反向互补序列。
在一些实施方式中，正向引物、分区ID标签寡核苷酸或两者包含通用衔接子序列。
在一些实施方式中，至少一些分区包含靶核酸。在一些实施方式中，扩增还使用正向引物和靶反向引物扩增靶核酸以形成扩增产物，并且所述测序包括对所述扩增产物进行测序。
在一些实施方式中，扩增包括使用分区ID标签寡核苷酸作为模板用聚合酶延伸正向引物以形成扩增子，其包含分区ID标签寡核苷酸的反向互补序列和正向引物。
在一些实施方式中，在所述分区形成步骤中，正向引物连接珠。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸的多个拷贝彼此连接。在一些实施方式中，多个拷贝通过珠彼此连接。在一些实施方式中，在分区形成期间，所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸通过可切割接头彼此连接，并且所述方法还包括在所述扩增之前切割所述可切割接头。在一些实施方式中，相较于连接珠的分区ID标签寡核苷酸，所述珠包含至少10(例如，100、1000、10000)倍数量的正向引物。
在一些实施方式中，在扩增前从所述珠切割引物。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸是单链的。
在一些实施方式中，可变分区ID标签序列是双链的。在一些实施方式中，双链可变分区ID标签序列各条链的3′端与捕获序列的互补序列连接。
在一些实施方式中，在所述分区形成步骤期间，分区ID标签寡核苷酸与固体支持物连接。
在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使聚合酶在扩增期间无法延伸所述封端3′端。
在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸包含亲和标签。在一些实施方式中，所述亲和标签是生物素、抗体或适配体。
在一些实施方式中，所述分区是液滴。
在一些实施方式中，所述分区包含平均2-100000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。在一些实施方式中，所述分区包含平均10-1000或100-10,000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。
在一些实施方式中，在扩增前将分区的内容物合并。
在一些实施方式中，靶反向引物存在于分区中。
在一些实施方式中，在将分区的内容物合并后引入靶反向引物。
在一些实施方式中，发生扩增时杂交产物在分区内。
在一些实施方式中，提供了检测分区中多个条码存在与否的方法。在一些实施方式中，该方法包括
形成分区，所述分区包含：
正向引物，其包含条码和捕获序列，所述捕获序列与以下互补：靶核酸的3′序列，或其反向互补序列，其中不同分区包含具有不同条码序列的不同正向引物，
分区ID标签寡核苷酸，其包含5′结合序列和3′可变分区ID标签序列；
将所述靶核酸与所述正向引物和所述靶反向引物连接，所述靶反向引物具有与所述靶核酸5′序列相同的3′序列，或其反向互补序列，其中所述连接还导致一些产物中正向引物与所述分区ID标签寡核苷酸连接；和
对所述产物进行测序，其中如果不同的正向引物与相同可变分区ID标签序列形成产物，那么认为所述不同的正向引物来自同一分区，其中
所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸在递送至所述分区时与同一珠连接；或
所述分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使聚合酶在扩增期间无法延伸所述封端3′端；或
所述分区ID标签寡核苷酸包含双链可变分区ID标签序列和一个或两个单链3′端，所述单链3′端包含所述捕获序列的反向互补序列。
在一些实施方式中，至少一些分区包含靶核酸。
在一些实施方式中，所述方法还包括在所述分区中提供桥接(bridge)单链核酸，其中所述桥接单链核酸从3′到5′包含所述靶核酸的3′序列和所述分区ID标签寡核苷酸5′结合序列的反向互补序列，因此正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸的杂交使所述正向引物的3′端邻接所述分区ID标签寡核苷酸的5′端，并且其中所述正向引物的3′端与所述分区ID标签寡核苷酸的5′端连接。
在一些实施方式中，在所述分区形成步骤中，正向引物连接珠。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸的多个拷贝彼此连接。在一些实施方式中，多个拷贝通过珠彼此连接。在一些实施方式中，在所述分区形成期间，所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸通过可切割接头彼此连接，并且所述方法还包括在所述连接之前切割所述可切割接头。在一些实施方式中，相较于连接珠的分区ID标签寡核苷酸，所述珠包含至少10(例如，100、1000、10000)倍数量的正向引物。
在一些实施方式中，在连接前从所述珠切割引物。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸是单链的。
在一些实施方式中，所述可变分区ID标签序列是双链的。
在一些实施方式中，在所述分区形成步骤期间，所述分区ID标签寡核苷酸与固体支持物连接。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使所述扩增中的聚合酶无法延伸所述封端3′端。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸包含亲和标签。在一些实施方式中，所述亲和标签是生物素、抗体或适配体。
在一些实施方式中，所述分区是液滴。
在一些实施方式中，所述分区包含平均2-100,000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。在一些实施方式中，所述分区包含平均10-1000或100-10,000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。
在一些实施方式中，提供了多个分区。在一些实施方式中，所述分区包含：
一个或多个正向引物，其具有条码和捕获序列，所述捕获序列与以下互补：靶核酸的3′序列，或其反向互补序列，其中不同分区包含具有不同条码序列的不同正向引物，和
分区ID标签寡核苷酸，其包含所述捕获序列的互补序列和可变分区ID标签序列。
在一些实施方式中，至少一些分区包含靶核酸。
在一些实施方式中，分区还包含靶反向引物，所述靶反向引物具有与所述靶核酸5′序列相同的3′序列，或其反向互补序列。
在一些实施方式中，所述正向引物与珠连接。
在一些实施方式中，多个分区ID标签寡核苷酸彼此连接。在一些实施方式中，所述多个分区ID标签寡核苷酸通过珠彼此连接。在一些实施方式中，所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸通过可切割接头彼此连接，并且所述方法还包括在扩增之前切割所述可切割接头。在一些实施方式中，相较于连接珠的分区ID标签寡核苷酸，所述珠包含至少10(例如，100、1000、10000)倍数量的正向引物。
在一些实施方式中，在所述扩增前从所述珠切割引物。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸是单链的。
在一些实施方式中，所述可变分区ID标签序列是双链的。
在一些实施方式中，所述双链可变分区ID标签序列各条链的3′端与所述捕获序列的互补序列连接。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸与固体支持物连接。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使所述扩增中的聚合酶无法延伸所述封端3′端。
在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸包含亲和标签。在一些实施方式中，所述亲和标签是生物素、抗体或适配体。
在一些实施方式中，所述分区还包含靶反向引物。
在一些实施方式中，所述分区是液滴。
在一些实施方式中，所述分区包含平均2-100000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。
在一些实施方式中，所述分区包含平均10-1000或100-10,000拷贝的分区ID标签寡核苷酸/分区。
在一些实施方式中，多个分区包含至少100(例如，至少1000、10000、100000)个分区。
定义
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(ColdSpring Harbor，N.Y.)，其通过引用纳入本文)，全文中提供这些参考文献。
“分区(partition)ID标签”指特定分区中的核酸序列或序列的独特组合。可以将分区ID标签引入各分区作为较长多核苷酸序列的部分，例如，在多核苷酸的3′端上具有捕获序列或其互补序列用于后续连接正向引物。分区ID标签序列可以是所需的任何长度。作为非限制性的示例，分区ID标签的长度可以是例如4-50或更多个核苷酸并且可以是连续的或非连续的(例如，可以在通过非标签(例如，间隔子)序列分隔的两个或更多个部分中)。各分区通常将包含不同的分区ID标签，例如，其可以随机或非随机产生的。
术语“扩增反应”指用于以线性或指数方式倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这些方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)；DNA连接酶链式反应(LCR)；QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如涉及T7，T3或SP6引发的RNA聚合的扩增)，例如转录扩增系统(TAS)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，和自主维持序列复制(3SR)；单引物等温扩增(SPIA)，环介导等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)；多重置换扩增(MDA)；滚环扩增(RCA)；以及本领域技术人员已知的其他方法。参见例如，Fakruddin等，J.Pharm BioalliedSci.20135(4)：245-252。
“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常指靶核酸的“指数型”增长。然而，本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序或线性扩增所得。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤，之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。
“引物”指与靶核酸上的序列杂交，并且任选地，用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以有多种长度。在一些实施方式中，引物长度小于100或50个核苷酸，例如长度为约10至约900，约15至约80，或约30-85至约30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于扩增反应(例如，PCR)的引物的长度和序列，参见例如Innis等编，(1990)《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)。引物可以包括或完全由DNA、RNA或非天然核苷酸形成。在一些实施方式中，引物包含一个或多个经修饰的和/或非天然的核苷碱基。在一些实施方式中，引物包含标记物(例如，可检测标记物)。
核酸或其部分在一定条件下与另一个核酸“杂交”，使得非特异性杂交在限定的温度下在生理缓冲液中最小。在一些情况中，核酸或其部分与一组靶核酸之间共有的保守序列杂交。在一些情况中，如果包括与超过一个核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸在内有至少约6、8、10、12、14、16或18个连续的互补核苷酸，引物或其部分能杂交至引物结合位点。或者，如果在至少约12、14、16或18个连续的互补核苷酸中有不到1或2个互补错配，引物或其部分能杂交至引物结合位点。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度高于室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度为至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供引入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobase)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。
本文所用术语“划分”或“经划分的”指将样品分为多个部分或多个“分区(partition)”。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如，微通道或孔(即，在多孔微量滴定皿)。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如，液滴。在一些实施方式中，流体分区(例如，液滴)是不互溶的流体(例如，水和油)的混合物。在一些实施方式中，流体分区(例如，液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(例如，油)包围。
如本文所用“条码”是鉴别其所偶联分子的短核苷酸序列(例如，长度至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30或更多个核苷酸)。在一些实施方式中，使用条码来鉴定分区中的分子。相对于其它分区的条码，这样的分区特异性条码应为该分区所独特。例如，包含来自单个细胞的靶RNA的分区可以经受逆转录条件，在各分区中使用包含不同分区特异性的条码序列的引物，从而将独有“细胞条码”的拷贝纳入各分区的逆转录所得核酸。由此，来自各细胞的核酸可藉由独有的“细胞条码”与其它细胞的核酸相区分。在一些实施方式中，条码存在于与颗粒偶联的寡核苷酸上，其中“颗粒条码”为与该颗粒偶联的全部或基本全部寡核苷酸所共有(例如，在它们之间相同或基本相同)。
在一些实施方式中，在底物中提供条码。在一些实施方式中，底物包括单个条码序列。在一些实施方式中，底物包括重复克隆条码序列。如本文所用“包括重复克隆条码序列的底物”指包含多个相同的条码序列的组合物，所述相同的条码序列彼此之间物理地连接(例如，在发夹分子、线性核酸聚合物或环状核酸聚合物中被各重复序列间的可切割接头分离的串联重复条码序列)或当递送至分区时与其它组分隔离(例如，包封在递送至分区的液滴中)。在一些实施方式中，个体条码序列释放自底物或释放自分区中的重复克隆条码序列(例如，通过在可切割接头切割聚合物释放自发夹、线性核酸聚合物或环状核酸聚合物，或通过使液滴破碎释放自液滴)，并且与分区中的颗粒关联，例如，通过退火克隆条码序列至分区上的寡核苷酸或通过连接克隆条码序列至分区上的寡核苷酸。
附图说明
图1描述了使用标签标记检测分区中多个条码的方面。上图描述了靶序列的条码化，其中条码(在本文中也称之为“正向引物”)通过捕获序列与靶核酸序列相关联。例如，连接条码的捕获序列可以与靶标的捕获序列互补。所得产物包含条码、捕获序列和靶序列。下图方框描述了标签标记条码序列。在该方面中，通过条码寡核苷酸(正向引物)和标签标记寡核苷酸上捕获序列之间的相互作用，正向引物条码与分区ID标签相关联。该反应所得产物是条码通过捕获序列共价连接分区ID标签。所描绘的反应可以在同一分区中以相同或变化的工作流程并行发生。可以进一步制备这些反应的产物，用于使用相同的工作流程同时进行分析，或者通过不同的工作流程进行分离和提取。虽然附图示出了不具有PCR操纵序列的寡核苷酸，但是应当理解的是，在一些实施方式中，可以存在这类序列。可以包括PCR处理序列，例如，作为正向引物，靶反向引物和反向标签引物的部分，从而允许通用序列用于所得产物的后续扩增。
图2表述了递送至分区的分区ID标签的另一构型。在所述所有实施方式中，捕获序列连接分区ID标签序列。该图的上部分显示了标签标记序列可以是单链或双链的(例如，在分区ID标签序列处为部分双链的，而在捕获序列处是单链的)。该图的中间部分显示了标签标记序列可以被递送至连接固体支持物或连接另一分子的分区。该图的下部分显示了条码序列和标签标记序列可以作为同一分子的部分递送(稍后分离)，并且在一些实施方式中，任选地进一步连接固体支持物。
图3描述了单链分区ID标签与多个条码珠处于溶液中的方面。圆圈表示分区，其中所示寡核苷酸捕获和样品制备步骤导致条码共价结合靶标和标签分子。随后将该分区与其他分区的内容物合并(例如，通过破坏乳液)用于下游样品制备和/或分析。图3描述了单个TAG1寡核苷酸首先与BC1相互作用，然后与BC2相互作用，应当理解的是，在一些实施方式中，分区中将存在同一分区ID标签的多个拷贝，从而使分区ID标签的不同拷贝与不同的珠正向引物相互作用。
图4描述了包含多个PCR循环的单链分区ID标签示例工作流程的第一部分(允许相同分区ID标签序列与多个正向引物条码序列合并)。如图所示，分区ID标签具有3′双脱氧核苷酸，防止其被聚合酶延伸。所述工作流程显示了同一分区(如所述的液滴)中具有不同条码(BC1和BC2)的两个珠。切割连接珠的正向引物以释放条码化的正向引物。
图5是图4工作流程的延续。部分2)描述了使用分区ID标签作为模板延伸具有BC1的正向引物。部分3)描述了使用分区ID标签作为模板延伸具有BC2的正向引物。如部分4)所示，两个不同的正向条码与相同分区ID标签(表示为TAG1)相关联表明两个正向引物序列处于同一分区中。
图6描述了没有链终止子的单链溶液中分区ID标签的使用。该方面类似于图4-5，但是在一些情况中，可以延伸分区ID标签自身。然而，因为BC1和BC2正向引物具有相同的捕获区，所以将生成各自包含TAG1的BC1和BC2扩增子。
图7描述了部分双链分区ID标签与多个条码珠处于溶液中。
图8描述了双链分区ID标签示例工作流程的部分1。如所示，分区ID标签在标签序列处以及在侧接标签序列的恒定区中是双链的。分离的3′端包含单链捕获区。条码化正向引物在分区ID标签下方直接描述。所述工作流程显示了同一分区(如所述的液滴)中具有不同条码(BC1和BC2)的两个珠。切割连接珠的正向引物以释放条码化的正向引物。该工作流程不使用多个PCR步骤，所以正向和反向标签序列出现不同的条码。分区中只发生单一寡核苷酸延伸步骤，而非如PCR中那样，进行多个解链、退火和延伸循环。该工作流程中的各种标签标记分子涉及将标签序列与一个珠的条码合并，以及在延伸步骤期间将该标签序列的反向互补序列与第二珠的条码组合。这将在图9的下述描述中进一步描述。
图9是图8工作流程的延续。在该工作流程的部分2中，条码化正向引物通过分区ID标签的捕获序列杂交，而在部分3的延伸产生这样的扩增子，所述扩增子中两个不同的条码(BC1和BC2)各自与标签序列或其反向互补序列相关联。
图10描述了递送的分区ID标签附接具有多个条码珠的固体颗粒。
图11描述了这样的方面，其中分区ID标签和条码化的正向引物与同一珠连接。“单珠(SINGLE BEAD)”工作流程显示了仅有一个珠在分区中的情况。“双珠(TWO BEADS)”工作流程显示了有两个珠在分区中的情况。在任一方面中，寡核苷酸从分区中的珠中释放，然后进行复制。在后一种情况中，所得产物将包含测序读数，其中相较于初始珠，标签序列和条码是错配的，这表明两个珠位于同一分区中。
图12描述了在相同珠上建立并且还作为单个可裂解分子部分的分区ID标签和条码。在所述方面中，分区ID标签和条码化正向引物序列是通过可切割序列分隔的一个寡核苷酸的部分(其可以存在于多个拷贝中)，从而允许分区ID标签和正向引物在分区中的后续分离。该工作流程还将如本文其他部分所述继续进行。
图13显示了使用图6中所示分区ID标签方案的条码检测数据。
具体实施方式
导言
有限数量的实体可以在一定数量的分区中分布。这意味着可能会在特定分区中遇到具有0、1、2、3个等实体的分区。尤其是在较低的浓度下(例如，各分区平均<20个实体)，多少百分比分区的分布包含多少数量的实体按照泊松分布。在一些应用中，待划分的实体是珠，而分区本身是液滴。
分区条码或其混合物可以用于标记特定分区内感兴趣的分子(例如，mRNA，cDNA，DNA等)。理想地是希望每个分区仅有一个条码。因为这并不总是可行的，所以本文所述方法提供了确定各分区内存在何种分区条码或条码组合的方法。本文所述方法提供了将分区ID标签添加到分区。这些分区ID标签标记(“标签标记”)条码。因此，占据同一分区的条码将被相同分区ID或分区ID的组合所标签标记。
发明人已经发现了如何检测分区中装载有珠特异性条码引物的多个珠的存在。存在超过一个差异性条码化引物(例如，与同一分区中不同珠连接的两个差异性条码化正向引物)会干扰序列分析和定量，因为假定不同的条码来自不同的分区，而实际上条码的一些部分一起出现(例如，作为高斯分布的函数)。通过能够检测同一分区中出现何种条码，可以进行解卷积(即确定多个条码来自同一分区，并在测序分析中进行解释)，并且使用来自这类组合的数据或不考虑(例如，丢弃)来自这类分区的数据，使剩余数据与背景效果相比更“干净”。发明人已经发现，可以将分区ID标签序列引入分区中，并且可以将它们与分区中正向引物的一些部分相关联。通过对这些关联的产物进行测序，可以检测具有多个差异性条码化正向引物的这些分区，因为它们将与相同的分区ID标签(或其互补序列)相关联。本文描述了递送和关联分区ID标签和正向引物的多种方式。
图1描述了这样的实施方式，其中靶序列通过分区中存在的分区条码化引物进行条码化(图的顶部)。在同一分区中，分区ID标签寡核苷酸连接分区条码化引物的一些拷贝，以将分区ID标签寡核苷酸的分区ID标签序列与分区条码连接，从而允许检测分区中的多个条码(如果存在)。
图3描述了这样的方面，其中具有不同条码的两个正向引物在同一分区中。虽然将正向引物描述为与珠连接，但是该方面不是必须的。分区中包括的是单链分区ID标签寡核苷酸的一些拷贝(具有捕获和分区ID标签序列)以及靶核酸(具有捕获和试验(例如，待确定的序列)序列)。正向引物的一些拷贝通过捕获序列与靶核酸连接，而正向引物的其他拷贝通过捕获序列与分区ID标签寡核苷酸连接。不同的条码(BC1和BC2)与相同分区ID标签序列(TAG1)的连接表明同一分区中存在两个不同的正向引物(与BCl和BC2相关联)。
提供了这样的分区，其包含正向引物，并且在一些实施方式中还包含反向引物，用于扩增靶核酸。在许多情况中，可以方便地为分区递送连接条码化正向引物的固体支持物(例如，珠)，或围绕连接条码化正向引物的固体支持物(例如，珠)形成分区，其中目标是连接正向引物的珠和分区的1∶1分布。然而，由于高斯分布，一些分区将包含超过一个正向引物珠。用于进行划分的方法和组合物描述于例如公开的专利申请WO 2010/036,352，US2010/0173,394，US 2011/0092,373和US 2011/0092,376中，其全部内容通过引用并入本文。多个分区可以是多个乳液液滴，或多个微孔等。
在一些实施方式中，在液滴形成期间添加一种或多种试剂，或在液滴形成之后将一种或多种试剂添加到液滴中。用于将试剂递送至一个或多个分区的方法和组合物包括本领域已知的微流体方法；液滴或微胶囊合并，聚结，融合，破裂或降解(例如，如U.S.2015/0027,892；US 2014/0227,684；WO 2012/149,042；和WO 2014/028,537中所述)；液滴注入方法(例如，如WO2010/151,776中所述)；及其组合。
如本文所述，分区可以是皮米孔、纳米孔或微孔。分区可以是皮米，纳米或微米反应室，例如皮米，纳米或微米胶囊。分区可以是皮米，纳米或微米通道。分区可以是液滴，例如乳液液滴。
在一些实施方式中，所述分区是液滴。在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两个或更多个液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相以薄片中悬浮液产生的过程。在一些情况下，这种稳定性或最小聚结可保持长达4、6、8、10、12、24或48小时或更长时间(例如，在室温下，或在约0、2、4、6、8、10或12℃下)。在一些实施方式中，使油相流过水相或试剂，从而形成液滴。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或其他常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉代衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。
在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其内容物。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前去除或留在原位。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
在将液滴转化成微胶囊之后，这些微胶囊可储存于约-70℃、-20℃、0℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输分区混合物。例如，可在一个位置处收集样品，划分到含有酶、缓冲剂和/或引物或其它探针的液滴中，任选地可进行一个或多个聚合反应，然后可加热该分区以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。
在一些实施例中，将样品划分为至少500个分区，1000个分区，2000个分区，3000个分区，4000个分区，5000个分区，6000个分区，7000个分区，8000个分区，10,000个分区，15,000个分区，20,000个分区，30,000个分区，40,000个分区，50,000个分区，60,000个分区，70,000个分区，80,000个分区，90,000个分区，100,000个分区，200,000个分区，300,000个分区，400,000个分区，500,000个分区，600,000个分区，700,000个分区，800,000个分区，900,000个分区，1,000,000个分区，2,000,000个分区，3,000,000个分区，4,000,000个分区，5,000,000个分区，10,000,000个分区，20,000,000个分区，30,000,000个分区，40,000,000个分区，50,000,000个分区，60,000,000个分区，70,000,000个分区，80,000,000个分区，90,000,000个分区，100,000,000个分区，150,000,000个分区或200,000,000个分区。
在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，液滴体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中，液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25％。在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
在一些实施方式中，该方法包括将包括一种或多种靶核酸的样品划分成多个分区。在一些实施方式中，包括靶核酸的样品包括DNA、RNA或其组合或杂合体。在一些实施方式中，包含靶核酸的样品包含来自基因组的亚组的DNA或基因组DNA(例如，可能包含特定群体(如易患特定类型癌症的个体)的突变的选定基因)。在一些实施方式中，样品包含相邻性保留的基因组DNA，其已经片段化但是通过蛋白质(例如，Tn5转座酶(标签酶))与DNA片段末端的连接保留相邻性。在一些实施方式中，包含靶核酸的样品包含cDNA。在一些实施方式中，包含靶核酸的样品包含外显子DNA(即富含转录序列的全基因组DNA的亚组，其包含基因组中的外显子组)或转录组DNA(即细胞或细胞群中产生的所有mRNA或″转录本″的组)。在一些实施方式中，包括靶核酸的样品包含长片段DNA(例如，具有至少约300、400、500、600、700、800、1000或更多碱基，或者对于双链DNA而言的碱基对长度的DNA)。在一些实施方式中，包括靶核酸的样品包括RNA，例如，mRNA或lncRNA。在一些实施方式中，靶核酸是双链的。在一些实施方式中，靶核酸是单链的。在一些实施方式中，样品包括分离自组织、细胞或单细胞样品的靶核酸。
在一些实施方式中，包括靶核酸的样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、病原体(例如细菌或病毒)或任何其他生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物，外植体，和转化的细胞，干细胞，粪便，尿液等。在一些实施方式中，样品是包含细胞的样品。在一些实施方式中，样品是单细胞样品。
一些实施方式中，本文所述方法用于单细胞分析。相应地，在一些实施方式中，将来自单细胞的靶核酸划分成多个分区。在一些实施方式中，对来自包含多个细胞的生物样品的靶核酸进行提取和划分，从而使个体分区包含来自少于一个、一个或多个细胞的核酸。
如上所示，分区将包含正向引物，用于靶核酸的扩增或其他检测。在一些实施方式中，当在分区中提供时，正向引物与珠或其他固体支持物连接。由于统计分布，虽然许多分区将仅包含一个正向引物(或仅一个正向引物的多个拷贝)，其他分区将包含具有不同序列(例如，不同条码)的正向引物。在一些实施方式中，本文所述方法、分区文库和试剂盒中使用与条码标记的正向引物偶联的珠或其他固体支持物。在一些实施方式中，珠包括固体支持物表面，其具有多个偶联其上的寡核苷酸引物。在一些实施方式中，珠包括至少约10、50、100、500、1000、5000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、108、109、1010或更多个与之偶联的相同的正向引物。在一些实施方式中，正向引物是双链的。在一些实施方式中，正向引物是单链的。
在一些实施方式中，正向引物包括条码序列，其中与固体支持物表面偶联的多个正向引物中的至少大部分、基本上所有或所有包括相同条码序列。在一些实施方式中，条码是约6-约400核苷酸的序列，例如，约6-25、约10-24、约8-20、约8-18、约10-20、约10-18或约12-20个核苷酸。在一些实施方式中，条码是至少约10个核苷酸的序列。在一些实施方式中，与特定珠偶联的寡核苷酸引物包括这样的条码序列，所述条码序列在珠上的多个寡核苷酸中可以相同或基本相同，但是相较于其它珠上的多个寡核苷酸其是独特或基本独特的。
正向引物还包含捕获序列，通常位于正向引物的3′端，所述捕获序列在试验条件下与靶序列或其反向互补序列杂交。靶序列可以是100％互补或者部分(例如，至少95％、90％、80％等)互补，取决于所需结果和条件。在一些实施方式中，捕获序列是约6-约20个核苷酸的序列，例如，约6-16、约6-14、约8-20、约8-18、约10-20、约10-18或约12-20个核苷酸。在一些实施方式中，捕获序列是至少约6个或10个核苷酸的序列。例如，正向引物可以包含捕获序列，其与以下互补：靶核酸的3′序列或其反向互补序列。此外，正向引物可以包含一个或多个其他序列。例如，在一些实施方式中，正向引物各自包含独特分子标识符(UMI)序列，所以可以分别追踪各拷贝并对其进行计数。
术语“珠”指可以存在于分区中的任何固体支持物，例如，小颗粒或其他固体支持物。在一些实施方式中，珠包含聚丙烯酰胺。例如，在一些实施方式中，通过与各寡核苷酸附接的丙烯酰胺(acrydite)化学修饰，珠将条码寡核苷酸纳入凝胶基质。示例性的珠还可以是水凝胶珠。一些情况中，水凝胶是溶胶(sol)形式。一些情况中，水凝胶是凝胶(gel)形式。示例性水凝胶是琼脂糖水凝胶。其它水凝胶包括但不限于例如下列文件中所述：美国专利号4,438,258、6,534,083、8,008,476、8,329,763；美国专利申请号2002/0,009,591、2013/0,022,569、2013/0,034,592；以及国际专利申请号WO/1997/030092和WO/2001/049240。
将寡核苷酸与珠连接的方法述于例如WO 2015/200541中。在一些实施方式中，设置成连接水凝胶和条码的所述寡核苷酸共价连接至水凝胶。本领域已知用于共价连接寡核苷酸与一种或多种水凝胶基质的许多方法。仅举一例，醛衍生化琼脂糖可共价连接至合成寡核苷酸的5’-胺基团。在一些实施方式中，正向引物通过可切割接头(如下所述)连接珠或固体支持物，并且可以切割自分区中的珠或固体支持物。
在一些实施方式中，与靶核酸上第一寡核苷酸引物结合用作反向引物的第二寡核苷酸引物可以包括在分区中，或者任选地，在将分区合并成本体(bulk)反应后。例如，靶反向引物将包括在测试条件下与靶标上的反向互补序列杂交的序列，以允许例如基于聚合酶的延伸。因此，例如，如果分区中存在包含5′序列和3′序列的靶序列，那么该靶反向引物的3′端将与靶标的5′序列相同。这将允许靶反向引物的3′端与使用靶核酸作为模板的正向引物的延伸产物杂交。或者，靶反向引物可以使用靶核酸作为模板来启动延伸，在这种情况中，靶反向引物3′序列将是靶核酸5′序列的反向互补序列。例如，靶反向引物在其5′端附近或其5′端还可以具有通用序列(也称为“PCR柄”或“衔接子”序列)。
分区中还包括的是分区ID标签寡核苷酸。该寡核苷酸包含可变分区ID标签序列和连接序列(例如，在分区ID标签寡核苷酸3′端)，从而允许分区ID标签寡核苷酸与正向引物连接。在一些实施方式中，连接序列是全部或部分(例如，至少6、8、10、12、14、16或更多个核苷酸)正向引物捕获序列的反向互补序列或者还具有与正向引物捕获序列杂交的序列。可变分区ID标签序列在不同分区ID标签寡核苷酸之间将是不同的，从而允许分区ID标签寡核苷酸能够彼此区分(从而区分分区)。在一些实施方式中，可变分区ID标签序列是约6-约20个核苷酸，例如，约6-16、约6-14、约8-20、约8-18、约10-20、约10-18或约12-20个核苷酸的序列。可变分区ID标签序列可以是随机的或指定的，但是不同分区中的分区ID标签寡核苷酸之间将会有所不同。
在一些实施方式中，分区中提供了相同分区ID标签寡核苷酸的多个拷贝。例如，当分区ID标签寡核苷酸的多个拷贝彼此连或者与递送至分区的共同支持物连接时，这是可以实现的(任选地，随后在分区内彼此释放个体拷贝)。
在其他实施方式中(例如，当分区ID标签寡核苷酸彼此并不相连时)，将分区ID标签的多个拷贝导入各个分区中，但是特定分区中的拷贝不必具有同一分区ID标签序列。在这些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸具有相同的结构，但是不同的分区ID标签序列。如果随机分区ID标签序列的长度足够长，那么分区ID标签可以作为试剂以一定浓度添加，从而使数十、数百或数千不同的标签序列填充各分区，但是特定标签序列或特定分区ID标签组填充两个单独分区的可能性将接近零。在这些实施方式中，来自不同珠的正向引物与相同分区ID标签序列的后续关联(例如，高于预期随机发生的统计学水平)将表明两个珠存在于同一分区中。在独特分区ID标签组处于不同分区的情况中，可以使用统计学分析(例如直方图比较)区分来自同一或不同分区的分区ID标签。
正向引物捕获序列的反向互补序列可以是正向引物整个捕获序列的反向互补序列或者可以是部分捕获序列的反向互补序列，只要正向引物捕获序列和分区ID标签寡核苷酸中的反向互补序列可以在后续反应中特异性地杂交。在其他实施方式中，连接序列与分区中单独的桥接单链核酸序列互补，从而当捕获序列和连接序列同时与桥序列杂交时，允许使正向引物的捕获序列和连接序列彼此接近用于连接。在一些实施方式中，靶反向引物进一步包含通用(例如，“PCR柄”)或其他附加序列，以辅助下游操作或扩增子测序。例如，当使用基于Illumina的测序时，靶反向引物可以具有5’P5或P7序列(任选地，具有正向引物，所述正向引物具有两个序列中的另一个)。
分区ID标签寡核苷酸中可以包括间隔子序列以确定后续测序方位。例如，在一些实施方式中，可变分区ID标签序列和连接序列之间包括恒定序列。在一些实施方式中，可变分区ID标签序列的5′还可以包括恒定序列。恒定序列具有特定非可变序列和设定长度，从而使得它们可以在核苷酸序列中被鉴定，并且可以因此表明相邻可变分区ID标签序列的位置。恒定序列的长度可以方便地用于测序和独特的序列鉴定。在一些实施方式中，各恒定序列在10-150个核苷酸之间。
在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸的5′端包括引物结合位点，从而允许通过与引物结合位点杂交来扩增或以其他方式操纵包含分区ID标签寡核苷酸的扩增子。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸进一步包含通用序列或其他附加序列，以协助扩增子测序或下游操作。例如，当使用基于Illumina的测序时，分区ID标签寡核苷酸可以具有5’P5或P7序列(任选地，具有正向引物，所述正向引物具有两个序列中的另一个)。
特定分区中分区ID标签寡核苷酸的拷贝数不必很高。实际上，取决于实施方式，可能需要使用尽可能少的拷贝，因为仅需要少量包含分区ID标签序列的核酸的序列读数来评估多个正向引物的存在。因此，在一些实施方式中，各分区平均添加1-50000(例如，1-20、5-50、10-500、100-20000)个分区ID标签寡核苷酸拷贝。拷贝的数量足以充分确认各分区中的珠占有率，但是却不足以保留试验样品的大部分测序空间。
分区ID标签寡核苷酸可以作为游离寡核苷酸添加至分区，或与固体支持物连接(与正向引物连接的固体支持物不同或相同的固体支持物)。例如，图2描述了各个方面。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸作为游离寡核苷酸递送至分区，即不与固体支持物连接。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸可以是单链的(参见例如，图2)或者部分(参见例如，图7)或完全双链的。示例性部分双链选项包括提供在分区ID标签序列处杂交的两个分区ID标签寡核苷酸，其中一分区ID标签寡核苷酸具有以下的反向互补序列：另一分区ID标签寡核苷酸的分区ID标签序列的分区ID标签序列或其部分。图2和7-9描述了该实施方式的示例。在这些实施方式中，部分双链分子具有3′突出端，其包含捕获序列或其反向互补序列，导致捕获序列能够杂交或以其他方式与正向引物的捕获序列相互作用。例如，在试验中没有多轮捕获和延伸的情况下，这是有利的。双链形式允许每条链(标签序列的正向和反向互补序列)在同一捕获/延伸步骤中结合不同的正向引物。
在一些实施方式中，单链或双链分区ID标签寡核苷酸在递送至分区时与固体支持物连接。参见例如图10-12。例如，在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸可以与珠连接。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸与连接正向引物的固体支持物不同的固体支持物(例如，不同的珠)连接。或者，分区ID标签寡核苷酸可以递送至连接至与正向引物连接的固体支持物相同的固体支持物(例如，珠)。在这些实施方式中，可能希望在固体支持物上包括比分区ID标签寡核苷酸更多的正向引物，例如，将分区ID标签寡核苷酸的数量限定为上述针对各分区的分区ID标签寡核苷酸所需数量所示的值。在任一种情况中，可以调整各分区递送的珠的数量，从而使大量(例如，至少大部分)分区包含一个珠。
在一些实施方式中，一旦引入分区中，将分区ID标签寡核苷酸从固体支持物(例如，珠)切割，从而使游离分区ID标签寡核苷酸更能够如本文所述进行相互作用。因此，在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸通过可切割接头与固体支持物连接。在一些情况中，标签反向引物通过二硫键(例如，通过固体支持物的硫化物和共价附接于寡核苷酸的5′或3′末端，或插入核酸的硫化物之间的二硫键)连接至固体支持物(例如，珠)。这类情况中，可通过使固体支持物接触还原剂来切下所述寡核苷酸，所述还原剂例如硫醇或膦试剂，包括但不限于β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。在一些实施方式中，可切割接头是由限制性酶(例如，内切核酸酶，诸如II型内切核酸酶或IIS型内切核酸酶)切割的限制性酶位点。例如，在一些实施方式中，可切割接头包括II型限制性酶结合位点(例如，HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglI)或IIS型限制性酶结合位点(例如，FokI、AlwI、BspMI、MnII、BbvI、BccI、MboI)。在一些实施方式中，可切割接头在部分核苷酸序列中包含尿苷纳入位点。尿苷纳入位点可以被切割，例如，使用尿嘧啶糖基化酶(例如，尿苷N-糖基化酶或尿苷DNA糖基化酶)。在一些实施方式中，可切割接头包括光可切割核苷酸。光可切割核苷包括例如光可切割荧光核苷酸和光可切割生物素化核苷酸。参见例如，Li等，PNAS，2003，100：414-419；Luo等，Methods Enzymol，2014，549：115-131。
在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸和正向反向引物通过可切割接头彼此连接(例如，如上所述)，并且还连接固体支持物(例如，珠)。在该实施方式中，切割剂将正向引物和分区ID标签寡核苷酸彼此分离并将其与分区中的固体支持物分离。
在其他实施方式中，当递送至分区时，一个或多个分区ID标签寡核苷酸可以连接(任选地，通过可切割接头，如上所述)另一分子。作为非限制性示例，一个或多个分区ID标签寡核苷酸可以连接蛋白质(包括但不限于抗体)，生物素，聚乙二醇(PEG)，凝胶(包括但不限于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶)或其他分子。在一些实施方式中，附接分区ID标签寡核苷酸的分子是亲和试剂，即对其他靶分子具有亲和性的试剂。亲和试剂的非限制性示例包括例如抗体和生物素。
在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸3′端不能通过聚合酶延伸。例如，在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸的3′端是双脱氧核苷酸(例如，ddC)。封闭分区ID标签的延伸消除或减少了最初捕获其的正向引物随后优先捕获分区ID标签的可能性。
形成包含正向和反向引物以及分区ID标签寡核苷酸的分区之后，可以进行分子方法来检测分区中的靶核酸。因此，在多种实施方式中，样品核酸也在分区中。示例性分子方法可以包括用于检测核酸的任何分子方法，包括但不限于基于模板的引物延伸(例如，聚合酶链反应)或通过正向引物捕获序列检测与靶核酸的特异性杂交的方法。在一些实施方式中，该方法包括连接。在分区是完整时或在分区内容物已经合并后(因此该方法“批量(inbulk)”进行)，可以进行这些分子方法中的任何一种。在任一选项中，在分区中，允许ID标签寡核苷酸与正向引物杂交以形成杂交产物。然后可以在分区内或批量延伸或以其他方式扩增杂交产物。如上所述，除了正向引物与靶核酸的连接(和任选地，扩增)之外(如果存在)，该反应还将分区ID标签寡核苷酸的可用拷贝与分区中正向引物的一些拷贝相连接，从而在具有分区ID标签的分区中形成包含正向引物的多核苷酸，所述正向引物包括正向引物条码序列。
在一些实施方式中，延伸和/或扩增反应包括使用聚合酶，例如，DNA聚合酶。可用于本文所述方法的DNA聚合酶可以是能够复制DNA分子的任何聚合酶。在一些实施方式中，所述DNA聚合酶是热稳定聚合酶。热稳定聚合酶分离自多重嗜热细菌，如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)，激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)，沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)，嗜热芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)，嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)(Sso)，隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)(Poc)，阿比热网菌(Pyrodictium abyssi)(Pab)，和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(Mth)，以及其他物种。DNA聚合酶是本领域已知的，并且市售可得。在一些实施方式中，DNA聚合酶是Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM，或其活性突变体、变体或衍生物。在一些实施方式中，该聚合酶是Taq DNA聚合酶。在一些实施方式中，DNA聚合酶是高保真DNA聚合酶(例如，iProofTM高保真DNA聚合酶，
在一些实施方式中，正向引物与分区ID标签寡核苷酸的连接包括将正向引物与分区ID标签寡核苷酸连接。在一些实施方式中，分区包含桥接单链核酸。桥接单链核酸可以起到使正向引物和分区ID标签寡核苷酸彼此接近以彼此连接的作用。例如，桥接单链核酸，从3′到5′可以包含靶核酸的3′序列和分区ID标签寡核苷酸结合序列(例如，5′结合序列)的反向互补序列，因此正向引物和分区ID标签寡核苷酸的杂交使正向引物的3′端邻接分区ID标签寡核苷酸的5′端，并且其中正向引物的3′端与分区ID标签寡核苷酸的5′端连接。在一些实施方式中，桥接单链核酸的长度为10-100个核苷酸。在一些实施方式中，连接反应包括使用连接酶，例如，DNA连接酶。用于本文所述方法的示例性连接酶包括但不限于T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶。本领域已经描述了核酸连接方法，参见例如Li等，Anal Biochem，2006，349：242-246；以及Kuhn等，FEBS J.，2005，212：5991-6000。
分区中的分子反应后(例如，分区中正向引物和分区ID标签寡核苷酸的扩增或另外连接，和分区中靶核酸的任选扩增或其他操作)，将分区的内容物在下游应用之前释放，例如，以汇集多个分区，用于下游应用，如测序反应。可以通过许多方法中的任一种实现破坏分区，包括但不限于，电学方法和引入去稳定流体。参见，例如，Zeng等，Anal Chem 2011，83：2083-2089。例如在US 2013/0189700中也描述了破坏分区的方法，其内容通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，通过将分区(例如，液滴)与去稳定流体混合破坏分区。在一些实施方式中，去稳定流体是氯仿。在一些实施方式中，去稳定流体包含全氟化乙醇。在一些实施方式中，去稳定流体包含氟化油，诸如全氟化碳油。
在一些实施方式中，该方法还包括纯化分区释放的靶核酸(例如，与本文所述颗粒关联的靶核酸)，例如，为了将靶核酸与其它分区组分分离。在一些实施方式中，纯化步骤包括使用基于柱的纯化方法(Zymo Select-a-Size Clean&Concentrator)或固相可逆固定化(SPRI)顺磁性珠试剂。SPRI顺磁珠试剂可商购获得，例如在Agencourt AMPure XP PCR纯化系统(加尼福尼亚州贝瑞阿的贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter))中。
在一些实施方式中，通过测序或基因分型方法分析来自本文所述分区的核酸。在一些实施方式中，通过测序，例如，高通量测序，分析核酸。在一些实施方式中，对包含正向引物序列(包含正向引物条码)和分区ID条码寡核苷酸(包含标签序列)的核酸进行测序。当多个正向引物条码与相同标签序列相关联时，可以假设这些多个正向引物评估为处于同一分区内。当从分区解卷积测序信息时，用户可以使用该信息来改善测序结果。例如，用户可以从剩余分区的测序数据中排除存在超过一个正向引物的分区的数据。或者，用户只能使用来自存在多个正向引物的分区中唯一一个正向引物的信息。或者，可以将来自一个分区的所有正向引物的测序信息进行编译和处理，就好像来自单一分区。
高通量测序和基因分型的方法是本领域已知的。例如，此类测序技术包括但不限于：焦磷酸测序、连接法测序、单分子测序、合成法测序(SBS)、大量同步克隆法、大量同步单分子SBS、大量同步单分子实时法，大量同步单分子纳米孔技术等。Morozova和Marra提供对一些此类技术的综述，见Genomics，92：255(2008)，该文在此通过引用全文纳入本文。
示例性的DNA测序技术包括基于荧光的测序技术(参见如Birren等，GenomeAnalysis：Analyzing DNA，1(基因组分析：DNA分析，第1卷)，纽约冷泉港，该文在此通过引用全文纳入本文)。在一些实施方式中，使用本领域已理解的自动化测序技术。在一些实施方式中，本技术提供经划分的扩增子的同步测序(PCT申请号WO 2006/0841,32，该文在此通过引用全文纳入本文)。在一些实施方式中，DNA测序的实现是通过同步寡核苷酸延伸(参见如美国专利号5,750,341和6,306,597，两者在此通过引用全文纳入本文)。测序技术的补充示例包括：Church多克隆技术(Mitra等，2003，Analytical Biochemistry 320，55-65；Shendure等，2005Science 309，1728-1732；和美国专利号6,432,360，6,485,944，6,511,803；在此通过引用全文纳入本文)，454皮升焦磷酸测序技术(picotiter pyrosequencingtechnology，Margulies等，2005Nature 437，376-380；美国公布号2005/0130173；在此通过引用全文纳入本文)，Solexa单碱基添加技术(Bennett等，2005，Pharmacogenomics，6,373-382；美国专利号6,787,308和6,833,246；在此通过引用全文纳入本文)，Lynx大量同步极好测序技术(Brenner等，(2000).Nat.Biotechnol.18：630-634；美国专利号5,695,934，5,714,330；在此通过引用全文纳入本文)和Adessi PCR克隆技术(Adessi等(2000).NucleicAcid Res.28，E87；WO 2000/018957；在此通过引用全文纳入本文)。
通常，高通量测序都具有大量同步这一共同特征，高通量策略的目的是使成本比较早的测序方法低(参见如Voelkerding等，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等，Nature Rev.Microbiol.，7：287-296；两者在此都通过引用全文纳入本文)。此类方法可大致分成通常用和不用模板扩增两大类。需要扩增的方法包括罗氏公司以454技术平台商业化的焦磷酸测序(例如，GS 20和GS FLX)，Illumina销售的Solexa平台，和应用生物系统公司(Applied Biosystems)销售的支持态寡核苷酸连接和检测(SupportedOligonucleotide Ligation and Detection，SOLiD)平台。非扩增方法也称为单分子测序，其示例有螺旋生物科学公司(Helicos BioSciences)销售的HeliScope平台，VisiGen公司、牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies)、生命技术公司(LifeTechnologies)/离子流(Ion Torrent)和太平洋生物科学公司销售的平台。
焦磷酸测序(Voelkerding等，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等，Nature Rev.Microbial.，7：287-296；美国专利号6,210,891和6,258,568；其各自通过引用全文纳入本文)中，模板DNA被片段化、末端修复、连接衔接子、并用珠捕获单模板分子来进行原位克隆性扩增，珠上载有与衔接子互补的寡核苷酸。载有单模板类型的各珠被分入油包水微泡中，模板被克隆性扩增，所用技术被称作乳液PCR。扩增后破乳，并将珠置于皮升微孔板(picotitre plate)的各孔中，在测序反应中作为流动室。在测序酶和发光报告物如萤光酶的存在下，流动室中发生四种dNTP试剂各自的有序迭代引入。合适的dNTP被加到测序引物的3′末端时，所产生的ATP导致孔内发光脉冲，用CCD相机予以记录。能够实现大于或等于400个碱基的读数长度，且能够实现106个序列读数，得到最多达5亿碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台中(Voelkerding等，Clinical Chem.，55.641-658，2009；MacLean等，Nature Rev.Microbial.，7：287-296；美国专利号6,833,246，7,115,400和6,969,488；其各自通过引用全文纳入本文)，以较短的读数形式产生测序数据。该方法中，单链的片段化DNA末端修复产生5′-磷酸化钝端，然后由Klenow介导添加单一A碱基至这些片段的3′末端。添加A便于添加T-突端衔接子寡核苷酸，后者将被用来捕获流动室表面上模板-衔接子分子，流动室中插有寡核苷酸锚。锚被用作PCR引物，但由于模板的长度且其靠近其它邻近的锚寡核苷酸，PCR延伸导致分子“拱跨(arching over)”杂交邻近的锚寡核苷酸在流动室表面形成桥式结构。这些DNA环被变性并切割。正链随后通过可逆染料终止子来测序。通过检测纳入后荧光来确定所纳入核苷酸的序列，在下一轮dNTP添加前除去各荧光团和阻断。序列读数长度从36个核苷酸到超过50个核苷酸，总体输出为每次运行分析超过10亿个核苷酸对。
用SOLiD技术(Voelkerding等，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等，Nature Rev.Microbial.，7：287-296；美国专利号5,912,148；和6,130,073；其各自通过引用全文纳入本文)对核酸分子进行测序还包括片段化模板，连接寡核苷酸衔接子，连接珠，以及乳液PCR克隆性扩增。此后，载有模板的珠被固定化在玻璃流动室的衍生化表面，与衔接子寡核苷酸互补的引物发生退火。但该引物并不用作3′延伸，而是用来提供5′磷酸基团供连接至问询探针，这些探针含有两个探针特异性碱基及其后6个简并碱基和四种荧光标记其一。SOLiD系统中，问询探针中每个探针3′的两个碱基有16种可能的组合而在5′末端是四种荧光标记之一。荧光颜色，及由此辨识的各探针对应于指定的颜色-空间编码方案。多轮(通常7轮)探针退火、连接和荧光检测后变性，然后用相对初始引物错开一位碱基的引物进行第二轮的测序。以此方式，模板序列可通过计算得以重建，而且模板碱基问询两次，得到更高的精确度。序列读数长度平均为35个核苷酸，总体输出为每次测序运行超过40亿个碱基。
在一些实施方式中，采用纳米孔测序(参见如Astier等，J.Am.Chem.Soc.2006年2月8日；128(5)1705-10，通过引用纳入本文)。纳米孔测序的原理涉及纳米孔浸入传导液并跨纳米孔施加电压(伏特)时所发生的现象。这些条件下，可观察到由于离子传导有微弱电流通过纳米孔，而电流的量对纳米孔的大小极度敏感。随着核酸的每个碱基通过该纳米孔，就会导致通过纳米孔的电流幅度有变化，这种变化对于四种碱基的每一种是不同的，从而允许确定DNA分子的序列。
在一些实施方式中，采用螺旋生物科学公司(Helicos BioSciencesCorporation)的HeliScope(Voelkerding等，Clinical Chem.，55.641-658，2009；MacLean等，Nature Rev.Microbial，7：287-296；美国专利号7,169,560，7,282,337，7,482,120，7,501,245，6,818,395，6,911,345和7,501,245；其各自通过引用全文纳入本文)。模板DNA被片段化并在3′末端多腺苷化，最后的腺苷载有荧光素标记。变性的多腺苷化模板片段连接到流动室表面上的聚(dT)寡核苷酸上。由CCD相机记录被捕获模板的初始物理位置，然后切下并洗去标记。通过添加聚合酶并系列添加带荧光标记的dNTP试剂来实现测序。纳入事件产生对应于dNTP的荧光信号，而CCD相机在每轮dNTP添加前捕捉信号。序列读数长度在25-50个核苷酸，总体输出为每次运行分析超过10亿个核苷酸对。
离子激流技术是基于对DNA聚合所释放氢离子的检测的DNA测序方法(参见如Science 327(5970)：1190(2010)；美国专利申请号2009/0026082；2009/0127589；2010/0301398；2010/0197507；2010/0188073和2010/0137143；全部通过引用全文纳入本文用于所有目的)。微孔含有待测序的模板DNA链。微孔层下方是超敏ISFET离子传感器。所有层都包含在CMOS半导体芯片内，该芯片与电子工业中所用的类似。在dNTP被纳入生长中的互补链时释放氢离子，触发超敏离子传感器。若模板系列中存在均聚重复系列，单次循环中会纳入多个dNTP分子。这导致对应数量的氢释放，和成比例的更高电子信号。这一技术与其它测序技术的区别之处在于不适用带修饰核苷酸和光学元件。离子流测序仪的单碱基精确度为每50碱基读取约99.6％，每次运行产生约100Mb。读数长度是100个碱基对。5个重复的均聚重复序列的精确度是约98％。离子半导体测序的优势在于测序速度快且前期和运行成本低。
可适用于本文所述方法的另一示例性核酸测序方法是由Stratos Genomics公司开发并用到Xpandomer的测序方法。该测序方法通常包括提供由模板引导的合成产生的子链。该子链通常包括按对应于靶核酸全部或部分的连续核苷酸序列偶联的多个亚单元，各亚单元含有系连物(tether)、至少一个探针或核碱基残基和至少一个选择性可切割的键。选择性可切割的键是被切割来得到Xpandomer，其长度大于子链的所述多个亚单元的长度。Xpandomer通常包括系连物和报告物元件，报告物元件用以解析序列中对应于靶核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的遗传信息。Xpandomer的报告物元件随后被测得。对基于Xpandomer的方法的补充细节在文献中有记载，例如美国专利公开号2009/0035777，其通过引用全文纳入本文。
其它单分子测序方法包括利用VisiGen平台通过合成来实时测序(Voelkerding等，Clinical Chem.，55：641-58,2009；美国专利号7,329,492，美国专利申请序列号11/671,956和11/781,166；其各自通过引用全文纳入本文)，其中，固定化的带引物DNA模板用带荧光素修饰的聚合酶和荧光素受体分子来进行链延伸，在核苷酸添加时产生可测的荧光共振能量转移(FRET)。
另一由太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)开发的实时单分子测序系统(Voelkerding等，Clinical Chem.，55.641-658，2009；MacLean等，NatureRev.Microbiol.，7：287-296；美国专利号7,170,050，7,302,146，7,313,308和7,476,503；其各自通过引用全文纳入本文)利用直径50-100nm含有约20仄升(10-21L)反应体积的反应孔。利用固定化模板、改良的Φ29 DNA聚合酶和高局部浓度荧光素标记的dNTP来进行测序反应。高局部浓度和连续反应条件允许采用激光激发、光学波导和CCD相机来通过荧光信号检测实时捕捉纳入事件。
在一些实施方式中，单分子实时(SMRT)DNA测序方法采用太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)开发的零级波导(zero-mode waveguide，ZMW)或类似方法。用此技术，DNA测序在SMRT芯片上进行，这些芯片各自含有数千个零级波导(ZMW)。ZMW是孔，直径是纳米的几十分之一，制造在100nm金属膜中，该膜置于二氧化硅底物上。每个ZMW成为提供检测体积仅20仄升(10-21L)的纳米光子可视化室。以此体积，可在数千个标记的核苷酸背景中检测出单个分子的活性。ZMW通过合成进行测序，为观察DNA聚合酶提供了窗口。各ZMW室内，单个DNA聚合酶分子结合在底面从而永久保持在检测体积内。磷酸连接的(phospholinked)核苷酸每种标记有不同颜色的荧光团，这些核苷酸随后以高浓度引入反应溶液中，这些浓度提高酶速度、精确性和处理能力(processivity)。由于ZMW体积小，即使在这些高浓度下，检测体积被众核苷酸占据的时间占比很小。此外，由于转运核苷酸的扩散距离很短，对检测体积的经停很快，仅持续几微秒。结果就是背景很低。
可调试用于本发明的用于此类实时测序的方法和系统在文献中有记载，例如，美国专利号7,405,281、7，315,019、7,313,308、7,302,146和7,170,050；美国专利公布号2008/0212960、2008/0206764、2008/0199932、2008/0199874、2008/0176769、2008/0176316、2008/0176241、2008/0165346、2008/0160531、2008/0157005、2008/0153100、2008/0153095、2008/0152281、2008/0152280、2008/0145278、2008/0128627、2008/0108082、2008/0095488、2008/0080059、2008/0050747、2008/0032301、2008/0030628、2008/0009007、2007/0238679、2007/0231804、2007/0206187、2007/0196846、2007/0188750、2007/0161017、2007/0141598、2007/0134128、2007/0128133、2007/0077564、2007/0072196和2007/0036511，以及Korlach等(2008)“选择性铝钝化用于将单个DNA聚合酶分子靶向固定在零级波导纳米结构中(Selective aluminum passivation fortargeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-modewaveguide nanostructures)”PNAS 105(4)：1176-81，其全部在此通过引用全文纳入本文。
在另一方面，提供了包括多个分区(例如，至少约100；200；300；500；750；1000；2500；5000；7500；10,000；15,000；20,000；30,000，40,000，50,000，70,000，100,000，150,000，200,000，300,000，400,000，500,000，700,000，1,000,000或更多个分区)的分区文库。在一些实施方式中，至少一些分区包含(1)至少一个正向引物，如本文所述，任选地，连接珠或其他固体支持物，和(2)分区ID标签寡核苷酸，和任选地，(3)靶反向引物(一旦已经将分区批量组合，还可以将其添加，或者任选地，完全不包括)。在一些实施方式中，分区包含0、1或超过一个颗粒/分区。在一些实施方式中，分区具有平均约一个(例如，0.5-1.5个)颗粒/分区。在一些实施方式中，分区具有平均约两个(例如，1.5-2.5个)颗粒/分区。在一些实施方式中，分区具有平均约三个(例如，2.5-3.5个)颗粒/分区。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸还与固体支持物连接，所述固体支持物可以是与正向引物连接的固体支持物相同或不同的固体支持物。在一些实施方式中，分区包含扩增子，所述扩增子包含正向引物和分区ID标签寡核苷酸或其互补序列。
在一些实施方式中，分区文库中的至少一些分区(例如，分区文库的大部分、基本上所有或所有分区)还包括样品(例如，一个或多个靶核酸，或一个或多个细胞)。在一些实施方式中，包括靶核酸的样品包括DNA、RNA或其组合或杂合体。在一些实施方式中，样品是包括细胞的样品，例如是单细胞样品。在一些实施方式中，样品是如本文他处所述的样品。
在一些实施方式中，分区还包括用于如本文所述的聚合、扩增、逆转录或引物延伸的其它试剂或组分(例如，聚合酶、盐、核苷酸、缓冲液、稳定剂、引物、可检测试剂或无核酸酶的水)。
在另一方面中，提供了用于生成本文所述多个分区的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含：(a)包含固体支持物表面的多个珠，所述固体支持物表面具有偶联其上的多个正向引物，其中所述正向引物包含条码序列，并且其中偶联固体支持物表面的多个寡核苷酸引物中的至少大部分包含相同条码序列；和(b)分区ID标签寡核苷酸。在一些实施方式中，该试剂盒还包含(c)靶反向引物。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸还与固体支持物连接，所述固体支持物可以是与正向引物连接的固体支持物相同或不同的固体支持物。
在一些实施方式中，试剂盒还包括用于如本文所述的聚合、扩增、逆转录或引物延伸的一种或多种试剂(例如，聚合酶、盐、核苷酸、缓冲剂、稳定剂、引物、可检测试剂或无核酸酶的水)。
在一些实施方式中，试剂盒还包括用于进行本文所述方法的说明书。
实施例
图13中所述表格提供了来自基于图6所公开的实验的数据。将条码以约108/珠递送至珠上的分区。靶DNA是标签化的单细胞核DNA。以0、10、100或1000个独特分区ID标签/分区的水平递送分区ID标签至分区。由其相应珠切割条码，使其捕获靶分子和分区ID标签，并扩增条码/靶标和条码/分区ID标签组合的分子以进行测序。
图13中的表格表示来自具有不同分区ID标签浓度的测序样品的生物信息学数据。如所预期，随着分区ID标签浓度增加，用于条码/分区ID标签分子相对条码/靶标分子的测序读数的相对数量增加(第2列)。
使用已知方法确定经测序样品中的“好”条码，以及经生物信息学确定与至少一个分区ID标签相关联的“好”条码的％(第3列)。
如果两个条码(X和Y)共有2个或更多个共同分区ID标签，并且如果X和Y之间共有的分区ID标签的测序读数的数量是下述两个值中较小的值的≥10，那么确定它们“重叠”或可能占据同一分区：1)其中分区ID标签与X相关联的总测序读取的数量，或2)其中分区ID标签与Y相关联的总测序读取的数量。第4列显示了各样品中经确定以此方式不重叠并因此单独占据分区的条码的％。在测试的系统中，各分区开始确定哪些条码与其他条码共有分区时所需的分区ID标签的数量大于100，但可能小于1000，正如在各分区最多为100个分区ID标签下无法找到大量重叠条码所示。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
