一种痰液宏基因组去宿主化提取试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种痰液宏基因组的去宿主化提取试剂盒。
背景技术
在空气污染日趋严重的大环境下，呼吸道疾病，如肺结核、重症肺炎、囊性纤维病、慢性阻塞性肺病等，已成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。常见呼吸道病原微生物包括肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、曲霉、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。传统病原微生物检测方法如显微镜检、分离培养、血清学和免疫学检测等，存在灵敏度/特异度低、费时、易受抗菌药物影响等缺点。随着病原微生物的变异，免疫抑制剂的大范围使用和肿瘤、器官移植患者的增多，许多疑难病例涌现，传统检测方法已不能满足当前需求，约有40-60%的病例不能明确感染病原微生物，导致误诊,漏诊,贻误冶疗时机。近年来，基于二代测序的宏基因组检测技术因其不依赖于预判、无需特异扩增，能够快速客观地检测样本中所有病原微生物的序列信息，已日益成为临床感染性疾病的新型诊断助手。
痰液是常见的呼吸道疾病病原微生物检测样本，其成分复杂，除病原微生物外，还含有大量的粘液、炎症细胞以及坏死的粘膜上皮细胞等，粘稠度大。在提取核酸前，需经预处理匀质后，才能使样本中的病原微生物DNA得到有效释放。痰液前处理方法包括：
1.NaOH碱裂解法：指在一定浓度的氢氧化钠溶液中液化痰液，耗时短，效果明显，但强碱环境易造成细胞破裂，核酸损失。
2.DTT还原法：利用巯基(-SH)断裂痰液中致粘稠的主要成分粘蛋白，对细胞作用温和，能保留细胞完整性，但常无法还原包埋于蛋白质结构内部的、溶液不可及的二硫键，因此多出现消化不完全现象，且耗时较长。
3.蛋白酶法：能用于痰液液化的蛋白酶包括蛋白酶K、胰蛋白酶及糜蛋白酶等。此法可实现完全液化，但利用酶解反应消化粘蛋白效率低，耗时较长，且对痰液中的细胞及病原微生物损伤较大。
痰液若不经去宿主基因组的处理，宏基因组测序所得数据中人源序列占比可达99.9%，造成极大的数据浪费和病原微生物检测灵敏度的降低。如何解决痰液去宿主化核酸提取问题已成为痰液宏基因组测序的关键。去宿主方法包括：
1.DNA提取前处理方法：基于人细胞膜比大部分微生物细胞膜或细胞壁更脆弱的特点。在DNA提取前，使用试剂选择性裂解人细胞，然后通过离心富集微生物再进行后续DNA提取。
2.DNA提取后处理方法：基于人基因组和微生物基因组的区别，如甲基化区域，设计探针，特异性捕获并去除人源基因组，从而将微生物基因组保留于溶液中。该方案对DNA起始量及完整度要求较高，且价格较昂贵。
目前针对痰液病原微生物宏基因组去宿主化提取的方案鲜有报道，国内仅一篇相关专利(CN108048450A)，该专利采用胰蛋白酶和SDS去除宿主DNA。上述专利中的方法，主要是先通过加入含Ca2+的磷酸盐缓冲液的环境下，进行蛋白酶的消化，再进行二次消化后，进行去宿主操作。但是该方法的操作中，会引起提取得到的微生物样本量不足等问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种痰液宏基因组的去宿主化提取方案，提高痰液液化效率，降低宿主核酸干扰，实现微生物基因组的富集，有效提升痰标本宏基因组病原检出率。
本发明的第一个方面，提供了：
一种痰液病原微生物宏基因组去宿主化提取和建库试剂盒，包括：蛋白酶、痰液液化试剂，以及去宿主化试剂；
所述的痰液液化试剂中包括以下成分：10mM Tris-HCl、50mM DTT（二硫苏糖醇）、15mMEDTA-Na2、0.1%SDC（脱氧胆酸钠），1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），0.25%SDS（十二烷基硫酸钠），20mM HEPES-KOH；
所述的去宿主化试剂中包括以下成分：包括去宿主裂解液、无菌水、渗透压调节剂、DNA消化酶、蛋白酶K。
在一个实施方式中，所述的蛋白酶选自蛋白酶K。
在一个实施方式中，所述的痰液液化试剂需要过滤除菌后使用，pH 8.0。
在一个实施方式中，所述的宿主裂解液选自皂素、Tween 20、Triton X-100或者CHAPS中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述的渗透压调节剂是NaCl。
在一个实施方式中，所述的DNA消化酶是TURBO DNase。
本发明的第二个方面，提供了：
一种痰液病原微生物宏基因组去宿主化提取方法，包括如下步骤：
第1步，将痰液与痰液液化试剂进行混合，所述痰液液化试剂中包括以下成分：10mMTris-HCl、50mM DTT（二硫苏糖醇）、15mM EDTA-Na2、0.1%SDC（脱氧胆酸钠），1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），0.25%SDS（十二烷基硫酸钠），20mM HEPES-KOH；
第2步，加入蛋白酶K至终浓度0.5-5mg/mL，混匀后孵育；当痰液变清亮时，停止反应离心取上清；
第3步，取第2步得到样本，加入皂素溶液，混匀后孵育，再加入无菌水后进行孵育，再加入NaCl，震荡均匀后离心，弃上清；
第4步，在第3步中得到的沉淀中加入缓冲溶液重悬，加入TURBO DNase，孵育，再加入蛋白酶进行孵育；
第5步，对第4步得到的样本进行DNA提取，并检测质量。
在一个实施方式中，所述的第1步中，痰液与痰液液化试剂的重量比是1：2，混合时间30s。
在一个实施方式中，所述的第2步中，孵育条件是56℃孵育20min。
在一个实施方式中，所述的第3步中，操作参数是：取100μL痰液液化后样本，加入80μL 5%皂素溶液，震荡混匀10s，室温孵育5min，加入144μL无菌水，室温孵育30s，马上加入5μL 5M NaCl，震荡混匀后，6000g离心5min，弃上清。
在一个实施方式中，所述的第4步中，操作参数是：加入100μL PBS重悬沉淀，加入2μL TURBO DNase，颠倒混匀20-30次后，37℃孵育15min；加入20μL蛋白酶K，56℃孵育30min。
本发明的第三个方面，提供了：
上述的试剂盒在用于制备痰液中微生物测序文库中的应用。
有益效果
(1)本发明痰液前处理方法结合了还原法和酶解法，对痰液进行温和液化，能充分发挥两种方法的优势，并消除弊端。通过蛋白酶消化暴露粘蛋白二硫键，使DTT可以充分还原粘蛋白二硫键以达到液化目的。脱氧胆酸钠的添加能进一步提升效率且保留细胞完整性，使匀质化后的样本可用于后续宏基因组的去宿主化提取。
(2)本发明所提供的去宿主化试剂，打破了去宿主化试剂国外垄断壁垒，大大降低了试剂盒的生产成本，并能有效去除宿主DNA，显著提升病原微生物的检出率。
二代测序结果显示，与之相比，本发明所示去宿主化提取方案能够显著提高痰液宏基因组中微生物占比及病原微生物检出数。综上所述，本痰液宏基因组的去宿主化提取试剂盒能够高效提纯痰液中病原微生物。
本发明的一个发明点在于：将痰液液化步骤与去宿主步骤分开，利用DTT联合蛋白酶K法温和液化痰液，痰液匀质后停止孵育终止液化反应。随后使用皂素特异性裂解宿主细胞；NaCl能够维持渗透压稳定，保护微生物细胞；TURBO DNase的添加能够最大程度去除宿主核酸干扰，提高去宿主效率。综上，先液化将痰液匀质化，再差异裂解去宿主，本发明所示两步分别处理能够最大程度保护微生物细胞，去除宿主干扰。
而专利CN108048450A提取方法为，在无机盐体系下利用胰蛋白酶液化痰液，再加入SDS，在继续液化的同时裂解宿主细胞膜，离心去除宿主核酸并收集微生物沉淀，由于其将后半部分的液化过程与去宿主化程序同步进行，这容易导致液化时间过长，损伤微生物细胞壁，影响微生物核酸提取效率及后续检出率。
附图说明
图1是核酸提取电泳图。
具体实施方式
以下实施例中所述的百分比无特定的说明情况下是指质量百分比。
实施例1 痰液宏基因组的去宿主化提取方法。
具体步骤如下:
1.痰液前处理
(1)取4个痰液样本，分别取200μL痰液，加入400μL痰液前处理试剂混匀30s；其中，所使用的痰液前处理试剂含10mM Tris-HCl、50mM DTT、15mM EDTA-Na2、0.1%SDC，1% Triton X-100，0.25%SDS，20mM HEPS-KOH，过滤除菌后使用，pH 8.0。SDC是离子型去污剂，用于增加蛋白溶解。
(2)加入蛋白酶K至终浓度0.5-5mg/mL，混匀后56℃孵育20min，每5min摇晃一次；
(3)当痰液变清亮时，停止反应；
(4)10000g离心5min，取上清。通过将还原法和酶解法相结合，对痰液进行温和消化，效果佳，时间短，同时也保留了微生物细胞的完整性，使匀质化后的样本可用于后续宏基因组的去宿主化提取。
2.差异裂解去宿主
(1)取100μL痰液液化后样本加入80μL 5%皂素溶液，震荡混匀10s，室温孵育5min，促进宿主细胞裂解；
宿主裂解液是一种表面活性剂，包括皂素、Tween 20、Triton X-100、CHAPS中的一种或多种。本实施例中优选为皂素，能特异性裂解人细胞且不损伤病原微生物或影响很小；皂素终浓度为5%。
(2)加入144μL无菌水，室温孵育30s，马上加入5μL 5M NaCl，震荡混匀后，6000g离心5min，弃上清；NaCl为渗透压调节剂，终浓度为0.4-0.9%，用于渗透压的回调。
(3)加入100μL PBS重悬沉淀，加入2μL TURBO DNase，颠倒混匀20-30次后，37℃孵育15min；TURBO DNase为 DNA消化酶（也可以是DNase或Benzonase），优选为TURBO DNase。TURBO DNase的催化效率是传统DNase I的350%，对DNA有更强的亲和力，能有效去除痕量的DNA污染，这对于宿主DNA的完全消化是至关重要的，另外，TURBO DNase具有更强的盐耐受性，当盐浓度高达0.25M，仍能有效降解DNA，而传统的DNase I对盐非常敏感，20mM NaCl就可以使酶的活性降低30%。所述TURBO DNase添加量为4U，反应温度为37℃，反应时间为15min。
(4)加入20μL蛋白酶K，56℃孵育30min。所述蛋白酶K浓度为20mg/mL，用于终止DNA消化酶活性，反应温度为56℃。
3.核酸提取
DNA提取采用通用型DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini kit，也可选用其他国产的DNA提取试剂盒，为了满足大批量提取需求，还可选用磁珠法自动化提取方案。
4.核酸质量检测
采用Qubit dsDNA HS kit测定提取的DNA浓度及纯度。
对照例1
传统DTT提取法
取痰液加1-2倍体积 50mM Tris-HCl（内含5mM EDTA）缓冲液混合，按每毫升混合液加入20mg/mL DTT 0.1mL，振动摇晃，室温孵育30min，80℃水浴30min，离心取上清。
对照例2
与实施例1的区别在于：在去宿主化处理的步骤中，采用的传统DNase I，而非TURBODNase。
对照例3
与实施例1的区别在于：在痰液液化预处理剂中未加入脱氧胆酸钠。
对照例4
采用专利CN108048450A中的两步液化法。
痰液标本前处理方法的对比
使用本发明配置的前处理试剂处理痰液样本，与传统DTT法、DTT+蛋白酶K联合法（与本发明相比缺少脱氧胆酸钠）对比。匀质化后采用通用型DNA提取试剂盒QIAamp DNA Minikit提取基因组DNA，采用Qubit dsDNA HS kit测定提取的DNA浓度。
表1 DNA提取量 (μg)对比。
将所得DNA建库后在Illumina NextSeq 550Dx行75bp双端测序，每个样本测序量为20M，分析下机数据中病原微生物序列占比、检出数目。通过图1可以看出，本发明的提取方法所得到的核酸具有清晰且明亮的条带，说明本方法能够有效地去除样本中干扰成分，并且对于微生物的核酸样本提取率高；而相对于对照例4中的常规提取方法来说，其得到的条带较为模糊，说明对于影响核酸提取质量的干扰成分去除率不好。
表2：病原微生物序列占比 (%)对比。
表3：病原微生物检出数目对比
由表2和表3可以看出，DTT+蛋白酶K联合法预处理组DNA得量、病原微生物序列占比及检出数目均显著高于传统DTT法。并且可以看出在去宿主的操作过程中，采用TURBO Dnase相对于传统DNase I而言，对于宿主DNA的去除效果更好，更有利于获得更多的微生物的检测序列和检出数；此外，与未添加脱氧胆酸钠组相比，脱氧胆酸钠的添加能进一步提升效果。本发明差异裂解去宿主方法能够显著降低人源基因的干扰，实现微生物基因组的富集，有效提升痰标本宏基因组病原微生物的检出。
