水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因RF3及其应用
第一、技术领域
本发明属于植物育种领域，涉及一种水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因RF3及其应用。
第二、背景技术
杂种优势(heterosis，hybrid vigor)是指遗传组成不同的两个纯系或自交系亲本进行杂交产生的杂种一代，其在生活力、适应性、生殖力、生长势、抗逆性，以及产量、品质等某些方面或整体水平上表现出优于两个亲本的现象。水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。杂交水稻的育种和大规模采用，对世界粮食供应有着重要的贡献。目前，商业杂交水稻生产包括细胞质雄性不育(CMS)系为基础的三系杂交水稻和光周期/温敏性细胞核雄性不育(PTGMS)系为基础的两系杂交水稻。水稻细胞质雄性不育类型分为多种类型，其中主要有：1，包台型(CMS-BT)，其雄性不育细胞质来源于印度稻，属于配子体不育类型。2，野败型，(CMS-WA)其雄性不育细胞质来源于普通野生稻，属于孢子体不育类型;3，红莲型(CMS-HL)，其雄性不育细胞质也来源于普通野生稻，属于配子体不育类型。 CMS系、保持系和恢复系，是三系杂交水稻系统所必需的。不育系的不育细胞质基因组为线粒体基因组，具有特异的CMS基因。恢复系具有正常的细脂质或不育的细跑质，其特点是核基因组中携带有功能(显性)的细胞质雄性不育恢复基因(fertility restorer，简称为恢复基因或Rf基因)，花粉正常可育，可自交结实。保持系具有正常的细跑质，但其核基因组不携带有正常功能的恢复基因(即携带无功能的隐性恢复基因rf)，其花粉正常可育，可自交结实。
目前水稻恢复系育种方法主要是：(1)用现有品种(系)与不育系测交，选出有恢复育性能力的品种作为恢复系使用;(2)以恢复系为恢复基因供体亲本，与不携带正常功能恢复基因的优良亲本杂交和多代回交选育而成。由于水稻的恢复基因主要存在于少数籼稻品种，大部分的水稻品种不携带有功能的恢复基因，尤其是粳稻品种基本上不携带有功能的野败恢复基因，目前水稻恢复系的育种主要采用多代回交选育。CMS-WA是我国三系杂交水稻主要利用的细胞质雄性不育系统。因此克隆水稻三系野败型恢复基因具有重大的应用价值。
第三、发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf3及其应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种DNA分子，所述DNA分子为如下(a)或(b)或(c)中的任意一种：(a)如SEQ IDNO： 2所示;(b)如SEQ ID NO：3所示;(c)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有细胞质雄性不育活性功能的蛋白质的核苷酸序列。
一种蛋白质，其为如下(d)或(e)或(f)中的任意一种：(d)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列;(e)由SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列;(f)由(d)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有细胞质雄性不育活性的由(d)衍生的氨基酸序列重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
一种重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的蛋白质、所述的DNA分子或所述的重组载体。
一种植物，其包含所述的宿主细胞。优选的是，所述的植物中，所述植物为水稻。
所述的植物收获的种子。
制备后代细胞质雄性不育植物的方法，包括如下步骤：将所述的重组载体或所述的细胞重组入育性正常的植物中，以产生后代细胞质不育植物。
恢复细胞质雄性不育植物的后代的育性的方法，包括如下步骤：将细胞质雄性不育亲本植物与雌性亲本植物杂交，以恢复细胞质雄性不育植物的后代的育性。
检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，包括如下步骤：通过PCR检测植物的多核苷酸样品，并加入至少一对扩增引物，该扩增引物能够指示植物中的细胞质雄性不育恢复性状的存在，所述至少一对扩增引入包含如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物对。
SNP位点，所述SNP位点来源于Rf3基因编码区，SNP位点的碱基序列包含：如SEQ IDNO:4 或5所示的碱基序列。
所述的蛋白质、所述的DNA分子、所述的重组载体、所述的细胞、所述的植物、所述的种子、所述的SNP位点在细胞质雄性不育的植物育性的恢复、杂交种的制备、优质三系恢复系的选育、培育及科学研究中的用途。
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用。本发明提供了从水稻分离克隆的野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf3的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。该基因属于PPR基因家族的成员，它通过负调控线粒体基因组中的不育基因WA352而恢复育性。将 Rf3转化导入原来不含有正常恢复基因的水稻品种去，可培育新的恢复系。将转基因恢复系与野败型不育系杂交可产生育性正常的杂交种应用于生产。
本发明至少包括以下有益效果：本发明解决了现有水稻雄性不育恢复系育种研究的不足的问题，提供从水稻恢复系分离克隆得到的水稻细胞质雄性不育恢复等位基因，拓宽恢复系的水稻种质资源利用。本发明还提供了Rf3所编码的蛋白质RF3.RF3也是属于PPR蛋白家族成员，具有恢复野败型杂交稻雄性育性的功能，有重大的学术和应用价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
第四、附图说明
图1为412份三系核心亲本与水稻野败不育恢复基因关联的SNP位点图;
图2为本发明其中一个实施例中qRT-PCR实验检测LOC_Os01g58630基因基因在水稻不育系和恢复系种的表达水平，图中440即指LOC_Os01g58630基因;
图3为RF3基因的物理位置说明图;
图4为RF3的蛋白结构说明图;
图5为表达载体pCAMBIA1300的载体图谱;
图6为转基因检测结果电泳图;
图7为本发明其中一个实施例中不育系野生型与转基因植株碘染结果图，其中，图A为水稻品种不育系炳1A的碘染结果图，图B为转基因株系1的碘染结果图，图C为转基因株系2的碘染结果图，图D为转基因株系3的碘染结果图;
图8为本发明其中一个实施例中的RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果图，注释：1:B1AY，炳1A叶片;Lane 2:B1AP，炳1A穗;Lane 3:RJL互补转基因RJ叶片;Lane 4:RJP，互补转基因RJ穗;Lane 5: RHL，互补转基因RH叶片;Lane 6:RHP，互补转基因RH穗;Lane 7:RJP2，互补转基因RJ2穗;
图9为本发明其中一个实施例中PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果图，Lane M：DL5000 Marker(5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp);Lane 1：对照的DNA片段;Lane 2： dUTP标记的DNA探针。
图10为本发明其中一个实施例中曝光35min的RNA检测图，注释：1:B1AY，炳1A叶片;Lane 2:B1AP，炳1A穗;Lane 3:RJL互补转基因RJ叶片;Lane 4:RJP，互补转基因RJ穗;Lane 5:RHL，互补转基因RH叶片;Lane 6:RHP，互补转基因RH穗;Lane 7:RJP2，互补转基因RJ2穗。
图11为本发明其中一个实施例中RF3的第一个拷贝的比对结果图;
图12为本发明其中一个实施例中RF3的第二个拷贝的比对结果图;
图13A和13B为本发明其中一个实施例中的SNP1位点的测序峰图;
图14A和14B为本发明其中一个实施例中的SNP2位点的测序峰图。
第五、具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
水程细胞质雄性不育是水稻野败型细胞质雄性不育，或虽然命名为其它类重的雄性不育，如印度水田谷型、冈型、K型、D型、矮败型等，但其线粒体基因组实际上携带相同的水稻野败型细胞质雄性不育基因WA352或其同源基因。
对不同类型的水稻细胞质雄性不育，己克隆相应的恢复基因。如包台型恢复基因Rfla和Rflb (Komori et al.,2004;Wang et al.,2006);红莲型恢复基因Rf5和Rf6(Hu etal.,2012;Huang et al,2015);野败型恢复基因RF4(Tang et al.，2014)。实际上Rf5与包台型Rfla是相同的基因(Hu et al.,2012)。这些恢复基因都是编码具有PPR(pentatricopeptide repeat)结构域的蛋白。PPR基因是植物中一类超基因家族。但是野败型雄性不育的另一主要恢复基因Rf3还没有克隆和报道。
本发明要解决的技术问题是针对现有水稻雄性不育恢复系育种研究的不足，提供从水稻恢复系分离克隆得到的水稻细胞质雄性不育恢复等位基因，拓宽恢复系的水稻种质资源利用。
本发明提供了上述水稻细胞质雄性不育恢复等位基因在水稻杂交育种的应用，主要内容：将所述的基因或含有基因的植物表达载体转化水稻，培育能表达和/或增强表达所述基因的转基因恢复系：用转基因恢复系与相应的水稻细胞质雄性不育系(野败型)杂交，产生育性正常的杂交种子。
一种DNA分子，所述DNA分子为如下(a)或(b)或(c)中的任意一种：(a)如SEQ IDNO： 2所示;(b)如SEQ ID NO：3所示;(c)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有细胞质雄性不育活性功能的蛋白质的核苷酸序列。
一种蛋白质，其为如下(d)或(e)或(f)中的任意一种：(d)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列;(e)由SEQ ID NO：2或3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列;(f)由(d)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有细胞质雄性不育活性的由(d)衍生的氨基酸序列重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。一种重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
一种重组载体，所述重组载体含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的蛋白质、所述的DNA分子或所述的重组载体。
一种植物，其包含所述的宿主细胞。在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的植物中，所述植物为水稻。
所述的植物收获的种子。
制备后代细胞质雄性不育植物的方法，包括如下步骤：将所述的重组载体或所述的细胞重组入育性正常的植物中，以产生后代细胞质不育植物。
恢复细胞质雄性不育植物的后代的育性的方法，包括如下步骤：将细胞质雄性不育亲本植物与雌性亲本植物杂交，以恢复细胞质雄性不育植物的后代的育性。
检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，包括如下步骤：通过PCR检测植物的多核苷酸样品，并加入至少一对扩增引物，该扩增引物能够指示植物中的细胞质雄性不育恢复形状的存在，所述至少一对扩增引入包含如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物对。
SNP位点，所述SNP位点来源于Rf3基因编码区，SNP位点的碱基序列包含：如SEQ IDNO:4 或5所示的碱基序列。
所述的蛋白质、所述的DNA分子、所述的重组载体、所述的细胞、所述的植物、所述的种子或所述的SNP位点在细胞质雄性不育的植物育性的恢复、杂交种的制备、优质三系恢复系的选育、培育及科学研究中的用途。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
水稻三系核心种质自然群体GWAS分析
1、申请人利用收集的412份三系核心亲本，通过全基因组测序、SNP位点挖掘、GWAS分析，获得了与水稻野败不育恢复基因关联的SNP位点，分别位于水稻第1、2、4、7、10、11、12号染色体上，如图1所示。
根据申请人数据分析获得的结果，也从侧面说明，野败不育恢复基因恢复机理的复杂性。湖南农业大学陈立云课题组的研究结果显示，三系杂交种F2群体的育性分离呈现类数量性状分布，表明恢复基因不是简单的1对，或者2对等位基因，而是多对基因协同调控，并存在一定剂量效应。根据Bazrkar 等人的定位结果，Rf3被定位于水稻第1染色体上，与RFLP标记RG532,RG140,RG458等连锁(Zhang et al.,1997);并位于SSR标记RM443和RM315之间，遗传距离分别是4.4cM和20.7cM(Bazrkar et al., 2008)。申请人的定位的一个显著关联的SNP位点也位于第1染色体上，并且区间重叠，因此申请人推测恢复基因Rf3就存在在附近区域。另外根据申请人的结果，在第10号染色体上也存在一个显著关联位点，这个位点附近就存在野败恢复基因Rf4，也说明了申请人的结果的可靠性。以蜀恢498为参考基因组，1号染色体上的显著SNP位点的物理位置为35446449，位于非编码区。
2、候选区间的生信分析和候选基因的验证
为了筛选候选基因，申请人对定位区间200K区间内的候选基因进行生物信息学分析，发现在 35341785-35342785(物理区间)内存在一个PPR基因(LOC_Os01g58630)。根据目前已经报道的水稻细胞质恢复基因多为PPR基因，申请人首先验证区间内唯一一个PPR基因与野败不育恢复的关系。申请人通过qRT-PCR实验检测该PPR基因在不育系和恢复系种的表达水平，引物序列如下：
440qRT-F(SEQ ID NO：6)：TCTTCCGCACAATGACATTTAC;
440qRT-R(SEQ ID NO：7)：ATAGCAATCAATCAAAGCCGTG
实验结果显示LOC_Os01g58630基因在不育系中和恢复系中表达水平差异显著(图2所示)。因此申请人认为LOC_Os01g58630基因就是Rf3的候选基因。
由此，本发明提供了分离克隆得到的水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf3。Rf3基因位于1 号染色体上(LOC_Os01g58630，如SEQ ID NO：2或3所示)，能够降低WA352蛋白的表达水平，因而产生育性恢复。本发明还提供了Rf3所编码的蛋白质RF3(如SEQ ID NO：1所示)，RF3也是属于PPR蛋白家族成员，具有恢复野败型杂交稻雄性育性的功能，有重大的学术和应用价值。Rf3基因位于1号染色体上，有一个内含子，编码产物为440个氨基酸，属于典型的PPR家族蛋白。
Rf3基因的转化与功能检测;
为了进一步验证Rf3基因的功能，申请人以水稻恢复系华占基因组DNA为模板，利用引物：
RF3FL-F(SEQ ID NO：8)：5’-GGTACCGGTAATCTGCCAATCTATCGTGTC-3’(Kpn1)
RF3FL-R(SEQ ID NO：9)：5’-GTCGACACCAACTAGCGTATGATCCTTCC-3’(Sal1)
扩增Rf3全长互补序列，含自身启动子和终止子序列，如SEQ ID NO：2所示。
扩增程序：94℃预变性5min;PCR扩增：然后以94℃变性，40s;58℃退火，40s;72℃延伸，4min30s;共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。电泳检测PCR结果。
SEQ ID NO：2如下所示：
将其构建至表达载体pCAMBIA1300，表达载体pCAMBIA1300的图谱如图5所示。
通过农杆菌介导转化水稻野败不育系炳1A，获得转基因互补植株：
农杆菌感受态制备和转化方法：
取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/mL利福平/氯霉素平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2mL菌液转接于100mL LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养至OD600=0.5。转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。加入10mL预冷的0.02M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。加入4mL预冷的含15%甘油的0.02M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃备用。
取1μg左右的质粒DNA加入到200mL EHA105感受态细胞中，混匀后，冰上放置10分钟。然后液氮中放置1min，再在37℃水浴5min。加入800mL LB液体培养基，28℃，200rpm摇培3hr。室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800μL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。将细菌涂在含 50μg/mL卡那霉素/利福平/氯霉素的LB平板上。28℃培养48-72hr后形成单菌落。
水稻遗传转化方法：
各种水稻组织培养基配方
诱导培养基NB：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L， BA0.1 mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。
继代培养基J3：MS大量盐分，10倍B5微量盐分，J3铁盐FeSO4·7H2O 41.8mg/L，Na2EDTA 55.9mg/L， DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D2.5 mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0。
共培养基NBM：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH5.6。
筛选培养基J3S：继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L。
预分化培养基Y：N6大量，CuSO43 mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L。
分化培养基D：N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐(FeSO4·7H2O)55.9mg/L，Na2EDTA 74.5mg/L， DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA2mg/L，IAA0.2 mg/L，NAA 0.2 mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400 mg/L。
生根培养基R：MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH6.0。
水稻愈伤组织的诱导和遗传转化
分别挑选野生型健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75%的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1%HgCl消毒12min，用无菌水冲洗 5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。
划LB平板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF 50 mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50mL液体的共培养基(NBM+As 0.1mM)中，调OD600=0.5;从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白;将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。无菌水冲洗5 次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天;3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。如图2所示。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S;结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿;将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃， 14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基;当分化出的绿苗高约5～8cm 时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。
对转基因植株进行分子鉴定和表型分析，花粉镜检实验结果显示，转基因水稻植株花粉碘化钾可染，与野生型植株表现典败相比，差异显著。
转基因水稻分子鉴定
水稻DNA提取
取水稻幼嫩叶片，剪碎，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中;加入800μl的 CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB缓冲液在65℃水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min，离心15min;小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿(各400μl)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min;小心吸取上清液，加入0.7倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min;弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次;室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50 μl去离子水(含RNase)中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。
PCR鉴定转基因植株(使用潮霉素基因的扩增引物)
以再生苗水稻叶片DNA为模板，利用PCR技术鉴定阳性植株，根据表达载体上潮霉素基因序列设计特异性引物：
hpt-F(上游引物，SEQ ID NO：10)：5′-ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3′;
hpt-R(下游引物，SEQ ID NO：11)：5′-CTGCTCCATACAAGCCAACC-3′。
转基因检测结果：潮霉素引物检测(产物428bp)，检测结果如图6所示。
水稻花粉镜检：取稻穗上、中、下各一朵颖花的花药放在载玻片上，加1～2滴1%碘-碘化钾溶液，然后用镊子将花药夹碎，使花粉粒充分释放，盖上盖玻片，用镊子轻压下，静置2-3min。将其于10 倍显微镜下观察。随机观测一个视野，每个视野花粉量多于200粒。
不育系野生型与转基因植株碘染结果如图7所示。
扩增得到RF3的基因编码序列(SEQ ID NO：3)。
>RF3(SEQ ID NO：3如下所示：)
ATGTCCCATCTCCAGCACCTCGCCGCCGGCGAACTCGTCACCGCACTCCGCGGAGCCTCC
TGCCCTTCATCAGCCCTCCGTCTCTACTCCCTCATCCGCATCCACGCCCGCCCCTCCGAT
CCCGCCCTTTTCGCCTGGCGCCCCGCCGTCCTCGCGCTCAAGCCCCTCTCGGCAGCCGCC
TCCCTCCCTCTCCTCTCCCACTTCCACGCCCACCTCATCAGGTCCAACCTCCTCGCCTAC
CCTCACGTCGCCTCCTCCCTCCTACGCGGTTACTCACTCCTCTCACCCGAACACGCCCAC
CACCTGTTCGATCAAATACCACCCTCCACCTGCAACCTGGTCGTCGTCAACGTCATGCTC
GGGTCCCTCTGCCGATCCTCCGATCTAGCTTCCGCGCGAGCCTTCTTTGATGGCATCCCT
GACAAGGACGTGGTTTCTTGGTCAACCATGCTTGCCTGTTATTTCTCCCACAGTCGCGTA
GCCGAAGGCCTTGCTTTCTTCCGCACAATGACATTTACCACTCAGCTTGCTGCAGATTAT
GTGATGCTCGTCACCGTTCTCACGGGTTGTGCATCAGCTGGCTTGCTGCCAGTGTCCTGC
AGGGCCATTCATGGATATATTGTCCGGCGCGGAATCACCTTCACCATGCACCTTGGCACG
GCTTTGATTGATTGCTATGCCAAGGCTGGCCGCCTTGATTATGCATCCCGTGTGTTTTGC
CGAGTCCCTTTGAGGAATGTGATGCACTGGACCGCAATGATTTGTGGGTCGGCAGCGCAT
CTTGGCAGCGAAAAGGCCATCCAGCTGTTTGAGGAGATGTGTCGGAGTGGAGTGCAACCA
AATGAGATGACATTCACAGCTGTTCTCAGTGCATGCGGGCAAGCTGGACTGGTGGATCAA
GGGAGGAGGTTCTTTAAACTTATGGTTGACACATATGGCTTTGAGCCGACTATACATCAC
TATGGCTGCATTGTTGATCTCTATGCAAAGGCTGGGAAACTGGAGGATGCTTATGAGGTT
ATCAAGACCATGAGAATGGAGCCAAATATCATCATTTGGACTTCATTGTTAGCAGCATGC
AAGAAGTTCAAAAATTTTTACATTGCAGTGGAGGGAATAGAGAAAGTCTTGTCAATGGAG
ATATCAGAAGAAAATGGTGGATTATATGCACTGATTTCTGACCTTTATGCTATGGGTGGA
CAGTGGGAAGATGTGCTAAGGGTTAGGAGTTTGATGGAGGAACGTAATGTGTGGAAGATC
AGAGGGTCAAGCTCCATCAAGGTGGGCGAACCCCAGGACTTTACTTTTCCTGCAGTCAGT TGA
RF3蛋白质氨基酸序列
>RF3 Protein(SEQ ID NO：1如下所示：)
MSHLQHLAAGELVTALRGASCPSSALRLYSLIRIHARPSDPALFAWRPAVLALKPLSAAA
SLPLLSHFHAHLIRSNLLAYPHVASSLLRGYSLLSPEHAHHLFDQIPPSTCNLVVVNVML
GSLCRSSDLASARAFFDGIPDKDVVSWSTMLACYFSHSRVAEGLAFFRTMTFTTQLAADY
VMLVTVLTGCASAGLLPVSCRAIHGYIVRRGITFTMHLGTALIDCYAKAGRLDYASRVFC
RVPLRNVMHWTAMICGSAAHLGSEKAIQLFEEMCRSGVQPNEMTFTAVLSACGQAGLVDQ
GRRFFKLMVDTYGFEPTIHHYGCIVDLYAKAGKLEDAYEVIKTMRMEPNIIIWTSLLAAC
KKFKNFYIAVEGIEKVLSMEISEENGGLYALISDLYAMGGQWEDVLRVRSLMEERNVWKI
RGSSSIKVGEPQDFTFPAVS*
RF3功能分析
在野败型不育系中，WA352在花粉母细胞时期的花药绒毡层中优先累积，由此抑制了COX11在过氧化物代谢中发挥功能，触发了绒毡层细胞过早程序性死亡，及随后的花粉败育(Luo et al.2013)。为了研究RF3的育性恢复机制，申请人利用Northern杂交技术，检测RF3互补载体转化三系不育系炳 1A中WA352转录本的表达变化情况。
Northern Blot印迹杂交是进行RNA特定序列定位的方法。其原理为在变性条件下将待检的RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，将胶上的RNA在原位转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定 RNA分子的含量。
1材料、试剂与仪器
1.1主要材料与试剂
1.2主要仪器
2实验步骤
2.1 RNA提取及检测
1)组织匀浆：向样品中加入1ml TRIzol试剂(组织块体积不要超过TRIzol体积的10%)，用移液器反复吹打。
2)将上述匀浆液室温放置5min，待核酸和蛋白充分解离。每1ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震摇15s，然后室温静置2～3min。
3)4℃10,000g，离心10min。
4)小心吸取上层水相(无色)加入到新试管中，同时计算所吸取的水相体积。
5)加入所吸取水相等体积预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻摇匀。
6)室温静置10min，待RNA充分沉淀。
7)4℃10,000g离心10min。
8)将上清弃除(注意别丢弃沉淀)，每管加入1ml 75%乙醇润洗，盖紧管盖，轻轻晃动离心管，以去除残留的异丙醇和盐份。4℃7,500g离心5min。
9)将上清弃除，打开管盖，将RNA沉淀干燥(室温挥发或真空干燥)。注意RNA沉淀不可完全干燥，否则难以溶解。
10)将RNA沉淀溶解于适量的无RNase水中。
RNA电泳结果如图8所示。
2.2探针制备
1)采用PCR制备探针
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
2)琼脂糖凝胶电泳如图9所示，采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收对照DNA片段，测序正确后待用。
2.3电泳1%甲醛变性凝胶电泳，25V恒压低温电泳过夜。上样量15μg，体积50μl。
2.4转膜
1)将胶置于平皿、用蒸馏水冲洗一次后，加入数倍体积20X SSC室温振荡2×15min，去除多余甲醛;
2)向上毛细管法进行转膜20h，取下膜作好标记，在2X SSC中漂洗数分钟，80℃烘烤2h固定。
2.5杂交
1)预杂交：取10.0ml DIG Easy Hyb，加入杂交管中，50℃杂交炉中预杂交2h;
2)探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10min，立即放冰水浴冷却5min;
3)杂交：排尽预杂交液，在10ml DIG Easy Hyb加入新变性好的探针，混匀。50℃杂交仪中杂交过夜。
2.6杂交洗膜、信号检测
1)杂交后室温下，100ml 2X SSC/0.1%SDS洗膜2×5min;
2)68℃，100ml 0.1X SSC/0.1%SDS洗涤2×15min;
3)将膜置于100ml Washing buffer中平衡2～5min;
4)将膜在100ml Blocking solution中封闭1h(在摇床上轻轻摇动);
5)将膜在20ml Antibody solution中抗体反应30min(在摇床上轻轻摇动);
6)去除抗体溶液，用100ml Washing buffer洗膜2×15min;
7)在膜的正面(核酸面)滴加1ml的CSPD，隔绝空气15～25℃反应5min，去除多余的液体，37℃孵育10min;
8)在暗房用X-ray film曝光，显影，定影，洗片，曝光记录结果。
3实验结果如图10所示。
结果分析：从Northern结果来看，在不育系和互补转基因植株中，WA352的信号并没有显著差异，可以说明RF3的育性恢复并不是影响了WA352的转录调控，而是在翻译水平上阻碍WA352蛋白的生成，进而达到育性恢复的效果。
RF3基因SNP位点分析
基因序列分析
1、申请人发现，水稻日本晴基因组只有一个RF3基因拷贝，而三系恢复系蜀恢498基因组存在两个完整的RF3的基因拷贝，并且两个拷贝与日本晴的等位基因相比都有一个单碱基差异，而蜀恢498 基因组两个基因拷贝之间相比则存在两个碱基的差异。如图11和图12所示。
2、利用引物对RF3基因编码区进行扩增测序，发现编码区的确有两个SNP位点，并且通过对60 份育种材料的多态性分析，发现野败型不育系与保持系多数只有一个RF3基因拷贝，且SNP1位点为 CCACCTGCAA，SNP2位点为TGCAGATTAT，而恢复系则有两个基因拷贝，且SNP1位点为CCAC(C/A)TGCAA(SEQ ID NO：4)，SNP2位点为TGCA(G/A)ATTAT(SEQ ID NO：5)，测序峰图在两个SNP位点均显示双峰图(见图示)。
PPR440Y-F(SEQ ID NO：14)：5’-AATGTCCCATCTCCAGCAC-3’
PPR440Y-R(SEQ ID NO：15)：5’-ACTGACTGCAGGAAAAGTA-3’
SNP1，SNP1位点的测序峰图如13A和13B所示。
SNP2，SNP2位点的测序峰图如14A和14B所示。
利用两个SNP位点的检测可以高效辅助优质三系恢复系的选育
利用常规杂交手段实现多优质基因聚合，在杂交后代群体中，利用一代测序手段对单株进行两个SNP位点的检测，如果测序结果中目标位点没有出现双峰，则表示RF3为单拷贝;如果出现双峰，则说明RF3基因为双拷贝，可以作为强恢复系候选单株进一步选择。两个SNP位点位于基因编码内部，与基因紧密连琐，因此，可以高效辅助优质恢复系的选育。
强优质三系恢复系的培育
水稻9311是优质的两系恢复系，但是不能恢复野败不育，以9311为受体材料，通过转基因方法，把RF3基因表达盒整合到其基因组中，增加9311中RF3基因的拷贝数和表达水平，通过自交获得转基因位点纯合的转基因植株，利用纯合转基因植株为父本与野败不育系杂交，F1育性正常，杂种优势明显。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因RF3及其应用
<130> 2019
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
Met Ser His Leu Gln His Leu Ala Ala Gly Glu Leu Val Thr Ala Leu
1 5 1015
Arg Gly Ala Ser Cys Pro Ser Ser Ala Leu Arg Leu Tyr Ser Leu Ile
202530
Arg Ile His Ala Arg Pro Ser Asp Pro Ala Leu Phe Ala Trp Arg Pro
354045
Ala Val Leu Ala Leu Lys Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ser Leu Pro Leu
505560
Leu Ser His Phe His Ala His Leu Ile Arg Ser Asn Leu Leu Ala Tyr
65707580
Pro His Val Ala Ser Ser Leu Leu Arg Gly Tyr Ser Leu Leu Ser Pro
859095
Glu His Ala His His Leu Phe Asp Gln Ile Pro Pro Ser Thr Cys Asn
100 105 110
Leu Val Val Val Asn Val Met Leu Gly Ser Leu Cys Arg Ser Ser Asp
115 120 125
Leu Ala Ser Ala Arg Ala Phe Phe Asp Gly Ile Pro Asp Lys Asp Val
130 135 140
Val Ser Trp Ser Thr Met Leu Ala Cys Tyr Phe Ser His Ser Arg Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Leu Ala Phe Phe Arg Thr Met Thr Phe Thr Thr Gln Leu
165 170 175
Ala Ala Asp Tyr Val Met Leu Val Thr Val Leu Thr Gly Cys Ala Ser
180 185 190
Ala Gly Leu Leu Pro Val Ser Cys Arg Ala Ile His Gly Tyr Ile Val
195 200 205
Arg Arg Gly Ile Thr Phe Thr Met His Leu Gly Thr Ala Leu Ile Asp
210 215 220
Cys Tyr Ala Lys Ala Gly Arg Leu Asp Tyr Ala Ser Arg Val Phe Cys
225 230 235 240
Arg Val Pro Leu Arg Asn Val Met His Trp Thr Ala Met Ile Cys Gly
245 250 255
Ser Ala Ala His Leu Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Phe Glu Glu
260 265 270
Met Cys Arg Ser Gly Val Gln Pro Asn Glu Met Thr Phe Thr Ala Val
275 280 285
Leu Ser Ala Cys Gly Gln Ala Gly Leu Val Asp Gln Gly Arg Arg Phe
290 295 300
Phe Lys Leu Met Val Asp Thr Tyr Gly Phe Glu Pro Thr Ile His His
305 310 315 320
Tyr Gly Cys Ile Val Asp Leu Tyr Ala Lys Ala Gly Lys Leu Glu Asp
325 330 335
Ala Tyr Glu Val Ile Lys Thr Met Arg Met Glu Pro Asn Ile Ile Ile
340 345 350
Trp Thr Ser Leu Leu Ala Ala Cys Lys Lys Phe Lys Asn Phe Tyr Ile
355 360 365
Ala Val Glu Gly Ile Glu Lys Val Leu Ser Met Glu Ile Ser Glu Glu
370 375 380
Asn Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Ile Ser Asp Leu Tyr Ala Met Gly Gly
385 390 395 400
Gln Trp Glu Asp Val Leu Arg Val Arg Ser Leu Met Glu Glu Arg Asn
405 410 415
Val Trp Lys Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ile Lys Val Gly Glu Pro Gln
420 425 430
Asp Phe Thr Phe Pro Ala Val Ser
435 440
<210> 2
<211> 4521
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
ggtaatctgc caatctatcg tgtcttttaa tacacaggaa ggccgggccg gacccagctt 60
ggttgaccgc gggtacttcg gcatgaagca tctggaaatg gagggtttcc ttttactttt 120
tttttctaaa gggcatgttt agtttccaaa atattttttc taaaaacatc acatcggatt 180
tttggacaca tgcataaagc attaaatata gatttttaaa aatactaatt acatagttag 240
ggaggaaatc gcgagacgaa tcttttgatt ctaattagtg catgattagc aataagtgct 300
atagtaaccc acgtgtgcta atgacagatt aattaggctc aaaagattcg tctcgaggtt 360
tccagtcgag ttataaaatt agtttttttt attcgtgtcc gaaaacccct tccgacatcc 420
ggtcaaacgt ctaatgtgac attcaaaaat tttcttttcg cgaactaaac aggcctaagt 480
atagtagtat ctaaacaagc caaatagtta aaattcagaa aatggatagc tattcccgtg 540
ataatcaacg gaatttggtg gaaacagacg gggagtgttt tggccctccg taatctttgt 600
taacttgttg tctttgcaca gtacattggt agagttacag agaccaaagc tattcagcag 660
atgacaaagc caggtgaggt gacgaaacac cgagcgggca ttctcgtagc ttgctgaccg 720
gagagccaag tgatcacaaa gcttcatggt tactaatgta cattcagttt cttctcatgt 780
tgcaaacatg tcttcgtatg tggaagtgag cgcaaaggaa gtagacacat gccaatcatt 840
tgtgtgtcct cacagcagcc accgatacgt attcgttaag caggcccttg tattgtgcct 900
ccgcctgctg aattttaagg cgtagttgat gttcctgacc agtacaacaa ataatttcat 960
cagatttgtc aattgttgtg tggtttagcc aagatgcact ggtcagcact aatgtgtttg 1020
aactcattgc aatgtcaaat ataaccttga gcaaaagatc catctacgct ggctcaaatt 1080
ccaagcacct gcaaatggag agaaaaaaaa caatgaaatc ctgagacttt taggccaaga 1140
ttattatctg gcaaaagtaa ttaaatttta tgctctttgg acttactctt gattcttgaa 1200
ggagcatttt atgctctagc ttcaagtaat taaattcatt caactctcgt tctcccatat 1260
attggcacac ctatatccaa agtcatcagc tttcaataca catatagact atgatgttag 1320
ataaaaaaag tattatctga gagtcaattg ggccaattat agaattaata gaaaataaat 1380
tatttagagt ccaactcaat aaaagggccc ttgttggatt tgattccagt ttccttttgt 1440
gggctccatg aatggaataa gttcatttca gatcccttaa cttgacaacg agttcgattt 1500
tcgtccttga accaaaaacc gaatacaaca agtccctcaa ctatcaaaac ttgtgtaata 1560
tatatcccat ggcagtatac caggtagttt tgtccgacgt gacaatctaa gtcagtgtgg 1620
accccatatg tcaagcaccc tcacccgttc ttccctctct ctctctcttt ctctctacat 1680
atgagaccca tgctgactaa gattgtcacg tcggacaaaa ccatccggta tactgccgtg 1740
agacctatat tgcaccgatt tcgatagttg agaaatccgt tgtatctggt ttttcttttc 1800
aaggatgaaa atgcaagtcg ctgtcaataa gggacttaaa atagacttac tccaaaaaga 1860
attcatctaa aaatactggt ccgtcaagca actggatggg cctgtagtga ttccggttgc 1920
ttgacagctc gaccggcaag cagcccaacc tgttcgagcc gccgcagata cccgaccgaa 1980
gaaccaaccg gtcgcctccc ctcacctgcc cagctgccct tgccccgccc aaattccaaa 2040
ccgagctcac cagcgccggc gccggcgccg gcaccgcggc acgccgtgcc cttgctcccc 2100
aatgtcccat ctccagcacc tcgccgccgg cgaactcgtc accgcactcc gcggagcctc 2160
ctgcccttca tcagccctcc gtctctactc cctcatccgc atccacgccc gcccctccga 2220
tcccgccctt ttcgcctggc gccccgccgt cctcgcgctc aagcccctct cggcagccgc 2280
ctccctccct ctcctctccc acttccacgc ccacctcatc aggtccaacc tcctcgccta 2340
ccctcacgtc gcctcctccc tcctacgcgg ttactcactc ctctcacccg aacacgccca 2400
ccacctgttc gatcaaatac caccctccac ctgcaacctg gtcgtcgtca acgtcatgct 2460
cgggtccctc tgccgatcct ccgatctagc ttccgcgcga gccttctttg atggcatccc 2520
tgacaaggac gtggtttctt ggtcaaccat gcttgcctgt tatttctccc acagtcgcgt 2580
agccgaaggc cttgctttct tccgcacaat gacatttacc actcagcttg ctgcagatta 2640
tgtgatgctc gtcaccgttc tcacgggttg tgcatcagct ggcttgctgc cagtgtcctg 2700
cagggccatt catggatata ttgtccggcg cggaatcacc ttcaccatgc accttggcac 2760
ggctttgatt gattgctatg ccaaggctgg ccgccttgat tatgcatccc gtgtgttttg 2820
ccgagtccct ttgaggaatg tgatgcactg gaccgcaatg atttgtgggt cggcagcgca 2880
tcttggcagc gaaaaggcca tccagctgtt tgaggagatg tgtcggagtg gagtgcaacc 2940
aaatgagatg acattcacag ctgttctcag tgcatgcggg caagctggac tggtggatca 3000
agggaggagg ttctttaaac ttatggttga cacatatggc tttgagccga ctatacatca 3060
ctatggctgc attgttgatc tctatgcaaa ggctgggaaa ctggaggatg cttatgaggt 3120
tatcaagacc atgagaatgg agccaaatat catcatttgg acttcattgt tagcagcatg 3180
caagaagttc aaaaattttt acattgcagt ggagggaata gagaaagtct tgtcaatgga 3240
gatatcagaa gaaaatggtg gattatatgc actgatttct gacctttatg ctatgggtgg 3300
acagtgggaa gatgtgctaa gggttaggag tttgatggag gaacgtaatg tgtggaagat 3360
cagagggtca agctccatca aggtgggcga accccaggac tttacttttc ctgcagtcag 3420
ttgatttttc atatggtttc cacaacctgg aagttttggg acagaatgga aggacacagc 3480
ctcttttgat tggcttcact gctgaagtat tcagaggata actttacatg ctacttggtg 3540
aaatctgttt gggggcatca gtggaatgaa tacaagtttt tacccgatct tttttcactg 3600
ctgcgttgag tatttgagat aatcgatgat atttggatat ggttgatcag gatgataaac 3660
tggcatatta gaagatcatc tgtttgatgc atggagatta ctcaggtgca tatgaatata 3720
tgatcaattg atgcttcaaa caaactaatg agtatgagtt gctcgatatc cttgtcttct 3780
ggctagttta ctatgtgtct aggtagttgt gccatcacaa ttatctgatt ttgtactggt 3840
ttttcctctt gtttatatgg atcacagggg ataacaaagg atatctctga gtaatggttt 3900
tcatgacttc ttcctagctg atttggcttt ccagacacaa ccgaagacag ctcaacaatt 3960
gagtttcagc tccttacttt cattaaaact ctacagttga tcaattatcc agtctgtttt 4020
gtcgctaaca gtttacaagt cctgcatctt caataaattc tgcaagcttg tatccaggtg 4080
acatttttcg tagattgcag tttttacatg ttatacggca aaaaaaaata ttcctgttgt 4140
gctcattgga aattctttta ggatcaatgt cctggagttg ctgtacattg ctatatcact 4200
tgtatttgag tggataaact gttggctaat gtaaaaaaaa aagccttctg tgaaaacaaa 4260
ttgatggaaa tcatgaaact gttctgtgtt gcaatgcttg cagtatatcc ccccgttagt 4320
gcaaaatcat tgccaagata aagataataa taatatttga gcaatagtat tgtcactggc 4380
aaactttttc atagtacact tgtgaggtgg gccataagca actgatacaa tagtcattag 4440
catattccat tcaaaaatag tcattagcct atcaaagtac attacctagt tagaaaaagg 4500
aaggatcata cgctagttgg t 4521
<210> 3
<211> 1323
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
atgtcccatc tccagcacct cgccgccggc gaactcgtca ccgcactccg cggagcctcc 60
tgcccttcat cagccctccg tctctactcc ctcatccgca tccacgcccg cccctccgat 120
cccgcccttt tcgcctggcg ccccgccgtc ctcgcgctca agcccctctc ggcagccgcc 180
tccctccctc tcctctccca cttccacgcc cacctcatca ggtccaacct cctcgcctac 240
cctcacgtcg cctcctccct cctacgcggt tactcactcc tctcacccga acacgcccac 300
cacctgttcg atcaaatacc accctccacc tgcaacctgg tcgtcgtcaa cgtcatgctc 360
gggtccctct gccgatcctc cgatctagct tccgcgcgag ccttctttga tggcatccct 420
gacaaggacg tggtttcttg gtcaaccatg cttgcctgtt atttctccca cagtcgcgta 480
gccgaaggcc ttgctttctt ccgcacaatg acatttacca ctcagcttgc tgcagattat 540
gtgatgctcg tcaccgttct cacgggttgt gcatcagctg gcttgctgcc agtgtcctgc 600
agggccattc atggatatat tgtccggcgc ggaatcacct tcaccatgca ccttggcacg 660
gctttgattg attgctatgc caaggctggc cgccttgatt atgcatcccg tgtgttttgc 720
cgagtccctt tgaggaatgt gatgcactgg accgcaatga tttgtgggtc ggcagcgcat 780
cttggcagcg aaaaggccat ccagctgttt gaggagatgt gtcggagtgg agtgcaacca 840
aatgagatga cattcacagc tgttctcagt gcatgcgggc aagctggact ggtggatcaa 900
gggaggaggt tctttaaact tatggttgac acatatggct ttgagccgac tatacatcac 960
tatggctgca ttgttgatct ctatgcaaag gctgggaaac tggaggatgc ttatgaggtt 1020
atcaagacca tgagaatgga gccaaatatc atcatttgga cttcattgtt agcagcatgc 1080
aagaagttca aaaattttta cattgcagtg gagggaatag agaaagtctt gtcaatggag 1140
atatcagaag aaaatggtgg attatatgca ctgatttctg acctttatgc tatgggtgga 1200
cagtgggaag atgtgctaag ggttaggagt ttgatggagg aacgtaatgt gtggaagatc 1260
agagggtcaa gctccatcaa ggtgggcgaa ccccaggact ttacttttcc tgcagtcagt 1320
tga 1323
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<211> 11
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
ccac[C/A]tgcaa 10
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<211> 11
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 5
tgca[G/A]attat 10
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcttccgcac aatgacattt ac22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atagcaatca atcaaagccg tg22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 15
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<213> 人工序列
<400> 15
actgactgca ggaaaagta19
