白眉蛇毒血凝酶 1：
一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法
第一、技术领域
本发明涉及一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法。
第二、背景技术
白眉蛇毒血凝酶是从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取纯化得到的一种具有凝血活性的酶，由类凝血酶和类凝血激酶组成。本品能够通过水解纤维蛋白原而促进血液凝固，临床上主要用于治疗各种出血和出血性疾病。本品主要是通过凝胶层析从蛇毒中提取分离得到的，分离得到的活性酶是以浓缩液的形式保存的，经过后期的稀释、配液、冻干制成制剂。在实际的生产过程中发现，浓缩液中的酶很容易变性失活，为了保持活性，就将浓缩液经过冷冻保存。冷冻虽然能在很大程度上减轻酶失活，但仍然会有10%—15%的活性丢失。经过大量深入的研究发现，酶失活的原因主要包括两点：1、白眉蛇毒血凝酶主要是靠三级结构维持其活性的，但是在温度循环变化过程中其三级结构变化，其中有疏水集团暴露，疏水力作用会使疏水集团聚合，进而改变酶的结构而失活。2、层析分离过程中用到Tris-HCl缓冲液，分段收集的浓缩液中溶液就是Tris-HCl缓冲液，该缓冲系pH值随着温度变化而变化，pH值变化会引起酶失活。酶的活性降低会带来很多问题，一方面比活降低，成本上升，另一方面变性失活的蛋白质会引入新的免疫原性，诱发过敏反应。
第三、发明内容
本发明的目的是提供一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法。
本发明所提供的保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法包括下述步骤：
1)向收集好的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中加入CaCl2溶液，得到含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液;
2)将所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液降温到10℃，在10℃下保存15—25分钟后，再将温度升到室温;
3)向步骤2)得到的体系中加入甘氨酸溶液，得到含甘氨酸的体系，将所述体系在3.5—4.5℃环境中长久保存。
上述方法步骤1)中，所述白眉蛇毒血凝酶是按照专利201410821963.8公开的方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的，能够达到药用标准并可以用于治疗临床出血的蛋白类药物，包括类凝血酶和类凝血激酶。
所述加入的CaCl2溶液的浓度为2.8-3.2mol/L，具体可为3.0mol/L。
所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中，CaCl2的终浓度是0.06—0.08mol/L，具体可为0.06mol/L、0.07mol/L或0.08mol/L。
步骤2)中，所述降温的速度保持在每1分钟0.5℃以下，具体可为0.3-0.5℃/min、0.3℃/min、0.4℃/min或0.5℃/min。
步骤3)中，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为18-22%，具体可为20%。
所述含甘氨酸的体系中，甘氨酸的终浓度(质量百分比浓度)为3-4.5%，具体可为3.5%-4%、3%、3.5%、4%或4.5%。
上述方法在保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液中的应用也属于本发明的保护范围。
白眉蛇毒血凝酶浓缩液在降温的过程中，酶的三级结构会发生改变，暴露出疏水基团，这些基团能够跟Ca2+结合而使疏水基团带有同质电荷来对抗疏水力，防止聚合;同时Ca2+也是生理止血的必须物质，引入Ca2+不会影响药品的疗效，甚至会产生协同效应。实验数据表明降温过程必须缓慢降温，如果降温剧烈，则酶构象变化剧烈，酶可能失活，也可能使疏水基团暴露不够充分而达不到技术效果。钙离子的量控制也要极其严格，量少则跟疏水基团配位不充分，量多则会形成超分子结构而聚合。甘氨酸是两性物质，在不同的pH值溶液中带有不同的电荷，可以起到缓冲作用，能够对抗Tris-HCl缓冲体系因为温度变化而产生的pH值变化。
本发明提供了一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法，能够减少酶的失活，降低成本，同时提高药品的安全性。
第四、具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、Ca2+浓度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
按照专利201410821963.8公开的方法得到白眉蛇毒血凝酶浓缩液，活性为40KU/ml。分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为2.8mol/L，CaCl2的终浓度如表1所示，降温的速度为0.5℃/min，在10℃下保存15分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20%，甘氨酸的终浓度为4%)，按下表添加CaCl2溶液，保存180天后检测活性，观察不同Ca2+终浓度对活性的影响。
表1不同Ca2+终浓度对活性的影响
序号浓缩液量Ca2+终浓度(mol/L)总活性(KU)110ml(400KU)0.02370210ml(400KU)0.04380310ml(400KU)0.06390410ml(400KU)0.07400510ml(400KU)0.08395610ml(400KU)0.10310710ml(400KU)0.12190810ml(400KU)0.14—
从上述表格数据看，Ca2+浓度在0.06—0.08mol/L时，酶活性损失最小，0.07mol/L时活性没有损失。
实施例2、降温速度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
上述的白眉蛇毒血凝酶浓缩液，分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为3.0mol/L，CaCl2的终浓度为0.07mol/L，降温的速度如表2中所示，在10℃下保存20分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20%，甘氨酸的终浓度为4%)，按下表控制降温的速度，保存1小时后检测活性，观察不同降温速度对活性的影响。
表2不同降温速度对活性的影响
序号浓缩液量降温速度(℃/min)总活性(KU)110ml(400KU)0.3400210ml(400KU)0.4400310ml(400KU)0.5400410ml(400KU)0.6395510ml(400KU)0.8385610ml(400KU)1.0375710ml(400KU)2.0370810ml(400KU)3.0370
上述实验数据显示，降温速度控制在0.5℃/min以下时，活性无损失，高于这个速度，则对活性产生显著的影响。为了节省时间，将降温速度控制在0.5℃/min为最佳。
实施例3、甘氨酸浓度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
上述的白眉蛇毒血凝酶浓缩液，分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为3.0mol/L，CaCl2的终浓度为0.07mol/L，降温的速度0.5℃/min，在10℃下保存20分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20%，甘氨酸的终浓度如表3所示)，按下表添加甘氨酸溶液，保存180天后检测活性，观察不同甘氨酸终浓度对活性的影响。
表3不同甘氨酸终浓度对活性的影响
序号浓缩液量甘氨酸浓度(wt%)总活性(KU)110ml(400KU)2370210ml(400KU)2.5380310ml(400KU)3390410ml(400KU)3.5395510ml(400KU)4400610ml(400KU)4.5390710ml(400KU)5380810ml(400KU)5.5360
从上述表格数据看，甘氨酸的终浓度为3-4.5%时，酶活性损失较小，当甘氨酸的终浓度为4%时，酶活性无损失。
白眉蛇毒血凝酶 2：
一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法
第一、技术领域
本发明涉及一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法。
第二、背景技术
凝血是一个比较复杂的生理过程，大体分为三个阶段：第一阶段，凝血因子X (coagulation factor X，Fx)激活;第二阶段，凝血酶原激活;第三阶段，纤维蛋白原变 为纤维蛋白。
从蛇毒中提取止血药具有悠久的历史。目前，临床应用较为成功的有瑞士生产的 止血药Reptilase，即立止血，它是从巴西矛头腹蛇蛇毒中提取的。国内仿Reptilase的 产品有从蛇岛蝮蛇、从圆斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的凝血酶， 这些产品和立止血都是类凝血酶和少量的类凝血激酶(一种凝血因子X激活物)的混 合物，主要机理是类凝血酶可使纤维蛋白原Ⅰ单体交联成纤维蛋白，从而形成血凝块 实现止血。
此前，发明人已经成功的从白眉蝮蛇蛇毒中提取一种白眉蛇毒血凝酶，并建立了 完整的技术方案(见ZL200710099163.X)。在该专利提供的技术方案，经过第一次 DEAE-Sephadex A-50后，电泳分析显示在得到的白眉蛇毒血凝酶主成分(类凝血酶) 电泳带下方很近处有一条干扰带，为杂质成分。后面的Sephadex G-15凝胶过滤层析、 DEAE-Sephadex A-50再层析主要是为了除掉这种杂质。
第三、发明内容
本发明的目的是提供一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取效价更高的白眉蛇毒血凝酶的 方法。
本发明所提供的提取白眉蛇毒血凝酶的方法，包括下述步骤：将长白山白眉蝮蛇 蛇毒依次进行DEAE-Sephadex A-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)离子交换层析、冷 藏、碱性水解和Sephadex G-75凝胶过滤层析后收集的具有凝血活性的蛋白。
具体步骤如下：
1)将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶于pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得 到浓度为200-300g/L的白眉蝮蛇蛇毒液;
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析;所述离子交换 柱层析中，固相填充物为DEAE-SephadexA-50，洗脱液为：NaCl浓度为0-0.75mol/L 的pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液，所采用的洗脱方式为梯度洗脱;
3)收集步骤2)中的洗脱液;在280nm的波长下对所述洗脱液进行紫外分光光 度计检测，收集在280nm的波长下具有吸收峰的洗脱液，并对该洗脱液进行凝血活性 检测，合并具有凝血活性的洗脱液;
4)向所述具有凝血活性的洗脱液中加入适量的牛血清白蛋白，然后将混合液在4℃ 环境冷藏4小时，得到冷藏后的混合液;
5)碱性水解：向冷藏后的混合液中缓慢加入NaOH，使NaOH的浓度为0.05mol/L， 然后在37.5±0.5℃环境中反应15—17小时;
6)冻干：将步骤5)反应后所得溶液进行冷冻干燥，得到冻干粉;
7)将步骤6)获得的冻干粉用注射用水复溶;
8)将复溶液进行凝胶过滤层析，所述凝胶过滤层析中固相填充物为Sephadex G-75， 洗脱液为注射用水，收集洗脱液，从中收集具有凝血活性的部分，得到白眉蛇毒血凝 酶原液。
在上述血凝酶的提取方法中，步骤1)中用于溶解长白山白眉蝮蛇蛇毒的溶剂优 选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液;此外，为获得更好的实施效果，可先用离 心的方法去除白眉蝮蛇蛇毒液中的杂质，离心条件可根据实际情况进行选择，如在 3000rpm下离心10分钟。
步骤2)中的DEAE-Sephadex A-50层析柱在使用前，先用pH 7-8、0.04-0.06mol/L 的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min;层析时，待白眉蝮蛇蛇毒 液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液一致的缓冲液，然后用pH 7-8、 0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等体积的含0.75mol/L NaCl的pH 7-8、0.04-0.06mol/L 的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;所述步骤2)中的Tris-HCl 缓冲液优选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤3)中的收集方法可为：用自动馏分收集器收集，每管12-15mL;具有凝血 活性的收集部分的检测方法可为：将等体积(优选0.5mL)并预热至37℃的收集液和凝血 质控血浆混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。
步骤4)中加入的牛血清白蛋白的终浓度为1.2—1.5mg/ml。
此步骤中加入牛血清白蛋白是为了下一步碱性水解时保护目标物质(类凝血酶和 类凝血激酶)不被破坏。这是由于牛血清白蛋白具有亲水集团和疏水基团，三级结构 会随温度改变而改变，亲水基团抱团会把类凝血酶和类凝血激酶保护起来，免受破坏; 而糖基化的蛋白因亲水性改变而不能被包埋。
步骤5)中加入NaOH一定要缓慢加入，边加边轻轻搅拌，整个溶解过程不能使 水温超过40℃。
步骤8)中的Sephadex G-75层析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小时，流速 为0.8-1.0mL/min;层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水， 然后用注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具 有凝血活性的部分。
按照本发明方法制备得到的白眉蛇毒血凝酶也属于本发明的保护范围。
所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特点：(1)由类凝血酶类物质(分子量为34000D) 和类凝血激酶(分子量为69000D)两种成分组成，高效液相色谱测得类凝血酶物质的 含量为84-88%，类凝血激酶的含量为12-16%;(2)主要成分类凝血酶类物质n末端 的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
所述白眉蛇毒血凝酶可用于制备止血药和/或治疗出血性疾病药物。
本发明的另一个目的是提供一种止血和/或治疗出血性疾病的药物。
本发明所提供的药物的活性成分为上述白眉蛇毒血凝酶。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅 料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表 面活性剂、润滑剂和稳定剂等。
本发明的药物可以制成冻干粉针剂、注射液或止血绷带等多种形式。
上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的成人用量一般为1-8KU/60kg体重/天，可以一次或多次使用。
本发明提供了一种从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取效价更高的白眉蛇毒血凝酶的方 法血凝酶。发明人通过对200710099163.X的方法进行进一步研究发现，其所得到的白 眉蛇毒血凝酶主成分(类凝血酶)电泳带下方很近处的干扰带是糖基化的类凝血酶， 是糖蛋白;并且将该糖蛋白的糖基完整释放，则得到的类凝血酶还能构恢复活性。基 于该发现，本发明改进了原来的技术方案，简化了提取步骤，并通过一步碱液水解使 糖蛋白释放糖基，增加了类凝血酶的含量。本发明方法简化了白眉蛇毒血凝酶的提取 步骤，缩短了生产周期，并且能够提高产品的效价和收率，大幅度地降低生产成本(选 择的层析胶可以反复使用)。
第四、附图说明
图1为本发明和现有技术(ZL200710099163.X)方案提取过程中的关键步骤取样 的电泳分析结果。
图2为牛血清白蛋白用量筛选结果图。
图3为对比例制备的白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶和类凝血激酶含量的高效液相色 谱检测结果。
图4为实施例1制备白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶和类凝血激酶含量的高效液相色 谱检测结果。
第五、具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所使用的长白山白眉蝮蛇蛇毒冻干粉购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公 司;牛血清白蛋白购于上海一研生物科技有限公司，其规格为1g/支。
实施例1、提取白眉蛇毒血凝酶
用下述方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取血凝酶，具体过程包括以下步骤：
1)将长白山白眉蝮蛇蛇毒冻干粉(购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公司)10g溶于 40mL pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为250g/L的白眉蝮蛇蛇毒 液，再将白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下离心10分钟，弃去沉淀，保留上清液。
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，方法为：层 析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱规格100×5cm，购自广州深华生物技术有 限公司)用pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为 0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm;层析时，待蛇毒上清液完全移动到胶面以下后，在 胶面上方加pH7.5、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL pH7.5、0.05mol/L 的Tris-HCl缓冲液和等体积的含NaCl 0.75mol/L的pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl 缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为1.0mL/min。
3)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL，在280nm的波长下对洗脱液进 行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血活性的部分，方法 为：将预热至37℃的0.5mL收集液和0.5mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂公司)混合 并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。收集液量约 300mL，总活性约18000单位(KU)。
4)向收集液中加入牛血清白蛋白400mg，溶解混匀后将收集液在4℃环境冷藏4 小时。
5)碱性水解：向冷藏后的溶液中缓慢加入NaOH 600mg(使终浓度达到0.05mol/L), 缓慢加入，边加边轻轻搅拌，让热量散发出去，注意不能使温度超过40℃;然后在37℃ 环境中反应16小时;
6)冻干：将收集液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉。
7)将步骤6)获得的冻干粉用20mL注射用水复溶。
8)对步骤7)获得的复溶液进行凝胶过滤层析，方法为：层析前先将Sephadex G-75 层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用注射水平衡15-20 小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm;层析时，待上清液完全移动到胶面以 下后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脱，流速为1.0mL/min;用与步骤3) 相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，得到约100mL白眉蛇毒血凝酶原液， 总活性约15000单位。
按照活性【1单位(KU)白眉蛇毒血凝酶的确定：将预热至37℃的1mL白眉蛇毒 血凝酶溶液与1mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂生产)混合，在37℃下，能使1mL 凝血质控血浆在60-80秒内凝固，混合前的1mL溶液中所含的白眉蛇毒血凝酶的量即为 1单位(KU)。】，用蒸馏水将原液稀释成40单位(KU)/mL，得到白眉蛇毒血凝酶浓缩 液。
上述过程中，在步骤3)、步骤5)、步骤8)后分别取样，分别记为样品1、样品 2、样品3。
按照ZL200710099163.X中实施例1的实验过程制备白眉蛇毒血凝酶(设为对比例)。
具体过程包括以下步骤：
1)将长白山白眉蝮蛇蛇毒冻干粉(购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公司)10g溶于 40mL pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为250g/L的白眉蝮蛇蛇毒 液，再将白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下离心10分钟，弃去沉淀，保留上清液。
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，方法为：层 析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱规格100×5cm，购自广州深华生物技术有 限公司)用pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为1.0mL/min， 胶床高90cm;层析时，待蛇毒上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH7.5、 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL pH7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓 冲液和等量的含NaCl 0.75mol/L的pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线 梯度洗脱，流速为1.0mL/min。
3)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL，在280nm的波长下对洗脱液进 行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血活性的部分，方法 为：将预热至37℃的0.5mL收集液和0.5mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂公司)混合 并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。收集液量约 300mL，总活性约18000单位(KU)。
4)层析除盐：对步骤3)获得的具有凝血活性的收集液进行凝胶过滤层析，方法 为：层析前先将Sephadex G-15层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物 技术有限公司)用注射用水平衡15-20小时，流速为1.0mL/min，胶床高80cm;层析 时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注 射水洗脱，流速为1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的 部分，结果获得收集液约180mL，总活性约15000KU。
5)再层析：调节步骤4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5.2，然后对 其进行离子交换柱层析，方法为：层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱的规 格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl 缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高90cm;层析时，待收集液完 全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH5.2、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后 用1000mL pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含NaCl 0.25mol/L的pH5.2、 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为1.0mL/min;用与步骤3) 相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，结果获得收集液约150mL，总活性约 14000KU。
6)冻干;将收集液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉。
7)将步骤6)获得的冻干粉用20mL注射用水复溶。
8)对步骤7)获得的复溶液进行凝胶过滤层析，方法为：层析前先将Sephadex G-75 层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用注射水平衡15-20 小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高90cm;层析时，待上清液完全移动到胶面以下 后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脱，流速为1.0mL/min;用与步骤3) 相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，得到约100mL白眉蛇毒血凝酶原液， 总活性约12000单位。
严格按照上述方法进行操作，在步骤3)、步骤5)、步骤8)后分别取样，分别记 为样品4、样品5、样品6。
将上述样品1—样品6按照常规方法做SDS—聚丙烯酰胺电泳分析，所得电泳结果 如图1所示。
从电泳图可以看出，在第一次DEAE-Sephadex A-50层析过后，34000D的主成分 上方有一条杂带(见样品1和样品4)，本发明经过碱液水解则将此杂带除掉了(见样 品2)，而专利200710099163.X提供的方案中经过第二次DEAE-Sephadex A-50层析后 也能够将该杂带除掉(见样品5)。样品2在65000D处出现多出的一条带是添加的牛血 清白蛋白。
实施例2牛血清白蛋白用量筛选
按照实施例1中的方案重复试验，固定其他条件，改变牛血清白蛋白的用量，以 确定最佳用量，结果如图2所示。
试验结果表明，牛血白蛋白用量过高或者过低，都会影响蛇毒血凝酶的收率，最 佳浓度为1.2—1.5mg/ml。
实施例3、白眉蛇毒血凝酶的活性测定
一、凝血质控血浆凝固时间测定
将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液(40单位(KU)/mL)用蒸馏水稀释成 不同的浓度(白眉蛇毒血凝酶含量分别为5、2、1、0.8、0.6和0.4KU/mL)，然后分别 取37℃下预热的各浓度的稀释液0.2mL，分别与在37℃条件下预热凝血质控血浆(美 国太平洋试剂生产)混合，在37℃条件下记录血浆凝固时间。结果如表1所示，再以 白眉蛇毒血凝酶含量(KU/mL)的倒数为横坐标，以凝血质控血浆凝固时间为纵坐标绘 制标准曲线，计算回归方程，Y=62.894X+0.532，R2=0.995。上述检测结果表明，白 眉蛇毒血凝酶能使凝血质控血浆凝固，并且在0.4-5KU/mL之间，血凝酶浓度的倒数和 人血浆凝固时间有很好的线性关系。
表1 不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的凝血质控血浆凝固时间
二、类凝血酶样活性测定
类凝血酶样活性主要体现在可作用于纤维蛋白原单体，使其交联成纤维蛋白，形 成凝块，而DFP(二异丙基氟磷酸)可以抑制类凝血酶样活性。用下述方法检测本发 明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血酶样活性，具体方法为：将实施例1获得的白眉蝮 蛇蛇毒血凝酶浓缩液用2×10-3mol/L的DFP溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和 2KU/mL，作用5小时后，不同浓度的稀释液各取1mL，37℃水浴预热5min，然后向其 中加入37℃水浴预热的0.1%的牛纤维蛋白原溶液1mL，记录凝固时间。同时以用蒸 馏水代替DFP溶液作为对照。实验结果如表2所示，在DFP存在的条件下，本发明的 白眉蛇毒血凝酶无法使牛纤维蛋白原溶液凝固，而蒸馏水对照组的牛纤维蛋白原出现 凝固现象，证明本发明的白眉蛇毒血凝酶具有类凝血酶样活性，可特异作用于纤维蛋 白原。
表2 不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的纤维蛋白原凝固时间
三、类凝血激酶样活性测定
类凝血激酶样活性主要体现在通过激活凝血X因子启动凝血反应，而EDTA可以抑 制该类凝血激酶样活性。用下述方法检测本发明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶 样活性，具体方法为：将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液用5×10-3mol/L的EDTA 溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和2KU/mL，作用5小时后，不同浓度的稀释液各 取1mL，37℃水浴预热5min作为供试品，然后向每一供试品中分别加入37℃水浴预热 的凝血质控血浆和缺X因子血浆(均为美国太平洋试剂生产)，记录凝固时间。同时， 分别用2×10-3mol/L的DFP溶液和蒸馏水代替EDTA溶液作为对照。实验结果如表3 所示，在DFP存在的条件下，本发明的白眉蛇毒血凝酶不能使缺X因子血浆凝固，却 能使正常的血浆凝固，且其类凝血激酶的凝血活性可受到EDTA的抑制。
表3 不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液的类凝血激酶样活性测定结果
实施例4、白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶类物质和类凝血激酶物质含量测定
将实施例1和对比例获得的两种白眉蛇毒血凝酶浓缩液作为供试品，用日本岛津 高效液相色谱仪及TKS-G2000swxI凝胶色谱柱(购自翡纳米(天津)科技发展有限公 司)检测其中的类凝血酶类物质和类凝血激酶物质的含量，以乙腈：三氟乙酸：水(40： 0.1：60，v/v/v)为流动相，两样品用同一台设备检测，进样量为10μl，流速为0.8mL/min， 检测波长为280nm。所得的高效液相色谱扫描图如图3和图4所示，图3为对比例 (ZL200710099163.X)所得浓缩液的液相色谱图，图4为实施例1所得浓缩液的液相 色谱图，如图所示，第一峰(第一峰是指保留时间16.37处的峰，前面的为流动相干 扰峰)为类凝血激酶类物质(分子量69000D)，第二峰为类凝血酶样物质(分子量为 34000D，保留时间73.85min)。图3中两峰的峰面积比为18.2:81.8;图3两峰的峰 面积比为14.1：86.9。
实施例5、白眉蛇毒血凝酶的N-末端氨基酸序列测定
用切割分子量60000D的超滤柱对本发明实施例1所得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液 100mL进行超滤，收集超滤液冻干，即得本产品的主要成分：分子量为34000D的类凝 血酶样组分;取类凝血酶样组分10μg作为供试品，采用ABI Procise 491型测序仪进 行N-末端氨基酸序列测定，按照PVDF程序上样。测序结果表明本发明白眉蛇毒血凝 酶N-末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
白眉蛇毒血凝酶 3：
白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用
第一、技术领域
本发明涉及酶及其提取方法与应用，特别是涉及一种来源于白眉蝮蛇蛇毒的血凝酶及其提取方法与其在制备止血药和/或治疗出血性疾病的药物中的应用。
第二、背景技术
凝血是一个比较复杂的生理过程，大体分为三个阶段：第一阶段，凝血因子X(coagulation factor X，Fx)激活;第二阶段，凝血酶原激活;第三阶段，纤维蛋白原变为纤维蛋白。
从蛇毒中提取止血药具有悠久的历史。目前，临床应用较为成功的有瑞士生产的止血药Repti1ase，即立止血，它是从巴西矛头腹蛇蛇毒中提取的。国内仿Reptilase的产品有从蛇岛蝮蛇、从圆斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的凝血酶，这些产品和立止血都是类凝血酶和少量的类凝血激酶(一种凝血因子X激活物)的混合物，主要机理是类凝血酶可使纤维蛋白原I单体交联成纤维蛋白，从而形成血凝块实现止血。
第三、发明内容
本发明的目的是提供一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取的凝血效果较好的血凝酶。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种白眉蛇毒血凝酶，是将长白山白眉蝮蛇蛇毒依次进行DEAE-Sephadex A-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)离子交换层析、Sephadex G-15凝胶过滤层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后收集的具有凝血活性的蛋白。
所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特点：(1)由类凝血酶类物质(分子量为34000D)和类凝血激酶(分子量为69000D)两种成分组成，高效液相色谱测得类凝血酶物质的含量为76-82%，类凝血激酶的含量为18-24%;(2)主要成分类凝血酶类物质N末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述血凝酶的提取方法。
本发明所提供的上述血凝酶的提取方法，包括以下步骤：
1)将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶于pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为200-300g/L的白眉蝮蛇蛇毒液;
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，固相填充物为DEAE-SephadexA-50，洗脱液为含0-0.75mol/L NaCl的pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱;
3)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集各吸收峰中具有凝血活性的部分;
4)层析除盐：将具有凝血活性的收集液进行凝胶过滤层析，固相填充物为Sephadex G-15，洗脱液为注射用水，再收集洗脱液中具有凝血活性的部分;
5)再层析：调节步骤4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5.0-5.4，然后对其进行离子交换柱层析，固相填充物为DEAE-Sephadex A-50，洗脱液为含0-0.25mol/L NaCl的pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱;
6)冻干;
7)将步骤6)获得的冻干粉用注射用水复溶;
8)将复溶液进行凝胶过滤层析，固相填充物为Sephadex G-75，洗脱液为注射用水，收集洗脱液，从中收集具有凝血活性的部分，得到白眉蛇毒血凝酶原液。
在上述血凝酶的提取方法中，步骤1)中用于溶解长白山白眉蝮蛇蛇毒的溶剂优选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液;此外，为获得更好的实施效果，可先用离心的方法去除白眉蝮蛇蛇毒液中的杂质，离心条件可根据实际情况进行选择，如在3000rpm下离心10分钟。
步骤2)中的DEAE-Sephadex A-50层析柱在使用前，先用pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min;层析时，待白眉蝮蛇蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液一致的缓冲液，然后用pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0.75mol/L NaCl的pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;所述步骤2)中的Tris-HCl缓冲液优选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤3)中的收集方法可为：用自动馏分收集器收集，每管12-15mL;具有凝血活性的收集部分的检测方法可为：将等体积(优选0.5mL)并预热至37℃的收集液和凝血质控血浆混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。
步骤4)中的Sephadex G-15层析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min;层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水，然后用注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分。
步骤5)中先调节具有凝血活性的收集液的pH值至5.0-5.4;所述DEAE-SephadexA-50层析柱在使用前，先用pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min;层析时，待收集液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液一致的缓冲液，然后用pH5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0.25mol/L NaCl的pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;所述步骤5)中的Tris-HCl缓冲液优选为pH 5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤8)中的Sephadex G-75层析柱在使用前，先用注射水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min;层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水，然后用注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分。
所述白眉蛇毒血凝酶在制备止血药和/或治疗出血性疾病药物中的应用也是本发明要保护的。
本发明的另一个目的是提供一种止血和/或治疗出血性疾病的药物。
本发明所提供的药物的活性成分为上述白眉蛇毒血凝酶。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。
本发明的药物可以制成干粉针剂、注射液或止血绷带等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的成人用量一般为1-8KU/60kg体重/天，可以一次或多次使用。
本发明提供了一种从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取到的血凝酶。所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特点：(1)由类凝血酶类物质(分子量为34000D)和类凝血激酶(分子量为69000D)两种成分组成，高效液相色谱测得类凝血酶物质的含量为76-82%，类凝血激酶的含量为18-24%;(2)主要成分类凝血酶类物质N末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示;3)该酶的提取方法以常规的层析技术为主，通过变换层析条件和调节技术参数实现精确分离的目的，且可以在常温下进行操作，并具有条件简单容易放大，成本低(选择的层析胶可以反复使用)，收率高和产品纯度高(可以达到色谱纯)的优点。基于上述特点，可以本发明的血凝酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物，本发明将在生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
第四、附图说明
图1为本发明白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶和类凝血激酶含量的高效液相色谱检测结果
第五、具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、提取白眉蛇毒血凝酶
用下述方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取血凝酶，具体过程包括以下步骤：
1)将长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys(pallas))蛇毒冻干粉(购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公司)10g溶于40mL pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得到浓度为250g/L的白眉蝮蛇蛇毒液，再将白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下离心10分钟，弃去沉淀，保留上清液。
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析，方法为：层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱规格100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm;层析时，待蛇毒上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH7.5、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL pH7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含NaCl 0.75mol/L的pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min。
3)用自动馏分收集器收集洗脱液，每管12-15mL，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测，得到波长280nm吸收图谱，收集具有凝血活性的部分，方法为：将预热至37℃的0.5mL收集液和0.5mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂公司)混合并在37℃下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。收集液量约300mL，总活性约18000单位(KU)。
4)层析除盐：对步骤3)获得的具有凝血活性的收集液进行凝胶过滤层析，方法为：层析前先将Sephadex G-15层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用注射用水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥80cm;层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，结果获得收集液约180mL，总活性约15000KU。
5)再层析：调节步骤4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5.2，然后对其进行离子交换柱层析，方法为：层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm;层析时，待收集液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加pH5.2、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL，然后用1000mL pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含NaCl 0.25mol/L的pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，结果获得收集液约150mL，总活性约14000KU。
6)冻干;将收集液放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干粉。
7)将步骤6)获得的冻干粉用20mL注射用水复溶。
8)对步骤7)获得的复溶液进行凝胶过滤层析，方法为：层析前先将Sephadex G-75层析柱(柱的规格为100×5cm，购自广州深华生物技术有限公司)用注射水平衡15-20小时，流速为0.8-1.0mL/min，胶床高≥90cm;层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加注射水50mL，然后用2000mL注射水洗脱，流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分，得到约100mL白眉蛇毒血凝酶原液，总活性约12000单位。
按照活性【1单位(KU)白眉蛇毒血凝酶的确定：将预热至37℃的1mL白眉蛇毒血凝酶溶液与1mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂生产)混合，在37℃下，能使1mL凝血质控血浆在60-80秒内凝固，混合前的1mL溶液中所含的白眉蛇毒血凝酶的量即为1单位(KU)。】，用蒸馏水将原液稀释成40单位(KU)/mL，得到白眉蛇毒血凝酶浓缩液。
实施例2、白眉蛇毒血凝酶的活性测定
一、凝血质控血浆凝固时间测定
将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液(40单位(KU)/mL)用蒸馏水稀释成不同的浓度(白眉蛇毒血凝酶含量分别为5、2、1、0.8、0.6和0.4KU/mL)，然后分别取37℃下预热的各浓度的稀释液0.2mL，分别与在37℃条件下预热凝血质控血浆(美国太平洋试剂生产)混合，在37℃条件下记录血浆凝固时间。结果如表1所示，再以白眉蛇毒血凝酶含量(KU/mL)的倒数为横坐标，以凝血质控血浆凝固时间为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，Y=63.365X-0.0264，R2=0.9949。上述检测结果表明，白眉蛇毒血凝酶能使凝血质控血浆凝固，并且在0.4-5KU/mL之间，血凝酶浓度的倒数和人血浆凝固时间有很好的线性关系。
表1不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的凝血质控血浆凝固时间
白眉蛇毒血凝酶含量(KU/mL) 5 2 1 0.8 0.6 0.4
凝固时间(s) 14 36 58 78 103 162
二、类凝血酶样活性测定
类凝血酶样活性主要体现在可作用于纤维蛋白原单体，使其交联成纤维蛋白，形成凝块，而DFP(二异丙基氟磷酸)可以抑制类凝血酶样活性。用下述方法检测本发明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血酶样活性，具体方法为：将实施例1获得的白眉蝮蛇蛇毒血凝酶浓缩液用2×10-3mol/L的DFP溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和2KU/mL，作用5小时后，不同浓度的稀释液各取1mL，37℃水浴预热5min，然后向其中加入37℃水浴预热的0.1%的牛纤维蛋白原溶液1mL，记录凝固时间。同时以用蒸馏水代替DFP溶液作为对照。实验结果如表2所示，在DFP存在的条件下，本发明的白眉蛇毒血凝酶无法使牛纤维蛋白原溶液凝固，而蒸馏水对照组的牛纤维蛋白原出现凝固现象，证明本发明的白眉蛇毒血凝酶具有类凝血酶样活性，可特异作用于纤维蛋白原。
表2不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的纤维蛋白原凝固时间
分组 浓度(KU/mL) DFP 蒸馏水 0.5 1 2 0.5 1 2 凝固时间(s) - - - 175 84 43
三、类凝血激酶样活性测定
类凝血激酶样活性主要体现在通过激活凝血X因子启动凝血反应，而EDTA可以抑制该类凝血激酶样活性。用下述方法检测本发明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶样活性，具体方法为：将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液用5×10-3mol/L的EDTA溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和2KU/mL，作用5小时后，不同浓度的稀释液各取1mL，37℃水浴预热5min作为供试品，然后向每一供试品中分别加入37℃水浴预热的凝血质控血浆和缺X因子血浆(均为美国太平洋试剂生产)，记录凝固时间。同时，分别用2×10-3mol/L的DFP溶液和蒸馏水代替EDTA溶液作为对照。实验结果如表3所示，在DFP存在的条件下，本发明的白眉蛇毒血凝酶不能使缺X因子血浆凝固，却能使正常的血浆凝，且该活性可受到EDTA的抑制。
表3不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液的类凝血激酶样活性测定结果
分组 浓度(KU/mL) EDTA 蒸馏水 DFP 0.5 1 2 0.5 1 2 0.5 1 2 质控血浆凝固时间(s) 274 131 73 121 62 34 331 168 92
缺X因子血浆凝固时间(s) 279 135 76 251 129 66---
实施例3、白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶类物质和类凝血激酶物质含量测定
将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液作为供试品，用日本岛津高效液相色谱仪及TKS-G2000swxI凝胶色谱柱(购自翡纳米(天津)科技发展有限公司)检测其中的类凝血酶类物质和类凝血激酶物质的含量，以乙腈∶三氟乙酸∶水(40∶0.1∶60)为流动相，进样量为10μl，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm。所得的高效液相色谱扫描图如图1所示，第一峰为类凝血激酶类物质(分子量69000D)，第二峰为类凝血酶样物质(分子量为34000D)，两者的峰面积比为18.1∶81.9。
实施例4、白眉蛇毒血凝酶的N-末端氨基酸序列测定
用切割分子量60000D的超滤柱对本发明所得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液100mL进行超滤，收集超滤液冻干，即得本产品的主要成分：分子量为34000D的类凝血酶样组分;取类凝血酶样组分10μg作为供试品，采用ABI Procise 491型测序仪进行N-末端氨基酸序列测定，按照PVDF程序上样。测序结果表明本发明白眉蛇毒血凝酶N-末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
白眉蛇毒血凝酶 4：
一种蛇毒血凝酶Ⅰ级酶制品及其生产方法
本申请是2003年05月13日申请的，申请号是03131420.1，发明名称为“一种蛇毒血凝酶及其生产方法与应用”的分案申请。
第一、技术领域
本发明涉及一种血凝酶及其生产方法与应用，特别是涉及一种蛇毒血凝酶I级酶制品及其生产方法与应用。
第二、背景技术
血凝酶以纤维蛋白I为作用底物，迅速转入血管受伤部成为纤维蛋白凝块，阻止血液自受伤部位流出。凝血过程大致分为三个阶段，即凝血因子X的激活;血凝酶原的激活;纤维蛋白原变成纤维蛋白。能使纤维蛋白原变成纤维蛋白的作用称为类血凝酶样作用;能通过激活凝血因子X及血凝酶原而发挥作用的，称为类凝血激酶样作用。蛇毒中含有丰富的蛋白酶，其中一类丝氨酸蛋白酶与蛇伤造成的血液凝固失调等毒理作用密切相关，属于血凝酶类。很多血凝酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)已经从各种蛇毒中提纯，并已先后用于制备临床用药。
1767年，Fontana首次叙述了蛇毒的凝血作用，此后二百多年来，有关蛇毒应用于血液系统的研究不断取得成绩。
1967年从马来亚红口蝮(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分离的血凝酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)具有脱纤维蛋白的作用，可用于临床，已命名为Ancrod或Arvin，是一种单链的糖肽，含碳水化合物25-36%，由17个氨基酸组成，等电点6.5，分子量35400D±1400D(Ewart，M.R.，Biochem J.1970，118，603;Collins，J.P.etal.Eur.J Biochem，26，510)。人体静脉或皮下注射Ancrod，血浆纤维蛋白原水平会依据剂量而减少，因此这种酶制剂Ancrod可用于防治血管栓塞性疾病，又由于它的作用靶位是纤维蛋白原的Aa链，还可用于研究纤维蛋白原到纤维蛋白的转换。
Ouyang(Ouyang，C.，(1957)J.Formosan Med.Assoc，56，435)将从尖吻蝮(Akistrodon acutus)蛇毒中分离的血凝酶样酶称为Acutin，分子量24000，等电点酸性，它作用于纤维蛋白原的a链，分解出纤维蛋白肽A。它还进一步降解已形成的纤维蛋白的a链。Acutin引起纤维蛋白原凝结，形成对血浆溶解高度敏感的结块。Komori等(1988)从尖吻蝮蛇毒中分离出4种具有不同化学和免疫学特性的血凝酶样酶，都能从血纤维蛋白原中分解出纤维蛋白肽A，但其中仅有一种酶像血凝酶一样，能激活凝血因子XII。
昆明动物研究所将从尖吻蝮蛇蛇毒分离出的Acutin称为“去纤酶”应用于临床治疗脑血栓、心脏血栓、眼底静脉血栓及脉管炎，疗效显著。
蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中所含的血凝酶样酶，像铜头蝮的A.contortrix毒一样，能选择性地从纤维蛋白原分解出纤维蛋白肽B，是一种单链的糖蛋白，分子量43000D(Ouyang，C.，etal.，(1983)Toxicon，21，797)。该酶的酶活能可被DFP(二异丙基磷酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制，具精氨酸酯酶特性，它分解苯甲酰精氨酸乙酯比胰蛋白酶快2.5倍，分解TAME(对甲苯磺酰精氨酸甲酯)则比胰蛋白酶慢50倍。蝮蛇蛇毒中分离的酶凝结纤维蛋白原很慢，释放血纤肽的动力学分析表明：血纤肽Bβ链分裂出来较快，而释放导致凝块形成的血纤肽则较慢，它不像铜头蝮那样由温度取决酶活力大小。我国用于提取抗凝酶的毒蛇已有尖吻蝮、蝮蛇(蛇岛、浙江)。
从南美洲铜头蝮(Agkistrodon contortrix)蛇毒中分离的酶称为“Venzyme”，能从血纤维蛋白原中迅速地分解出血纤肽B，而较慢地释放血纤肽A。Venzyme分子量为64000D，不稳定，在pH 3时空气中暴露2小时，酶活力丧失;pH 10下放置2小时，活性损失60%，pH 7时60℃加热30分钟，活力丧失95%(Shimizu，A.，et.al.，(1987)Toxicon，21，679)。由于Venzyme作用于纤维蛋白原的Bβ链，这种独特性可用于研究那些作用于Aa-链的血凝酶(如红口蝮、矛头蝮和响尾蛇的“Anrod”、“batroxobin”、“Crotalase”)形成和血凝酶交叉组合的理化特性。
从蝮蛇日本亚种(Agkistrodon haly brevicaudus)蛇毒中分离的血凝酶(纤凝精氨酸蛋白酶)是分子量为39000D的糖肽，由323个氨基酸残基构成，分子中谷氨酸和天冬氨酸含量较高。
从东部菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)蛇毒中分离的血凝酶样酶称为响尾蛇酶Crotalase，分子量为32700D，碳水化合物含岩藻糖、甘露糖、半乳糖和葡萄胺，占响尾蛇酶Crotalase干重的5.4%。Crotalase在中性或微碱的磷酸缓冲液中较为稳定，但如在pH5以下的酸性条件，酯酶活性能很快失活(Markland，F.S.，etal.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6460)。Crotalase仅从纤维蛋白原分子中分解出血纤肽A，如延长培养将导致纤维蛋白链的降解。Crotalase也用于脱纤维蛋白原疗法。
世界卫生组织将从矛头蝮(Bother atrox)蛇毒中分离纯化的血凝酶样酶命名为：“Batroxobin”，它有很多重要的用途，如用于止血称作“Retilase”(蛇酶)或用于脱纤维蛋白原疗法称作Defibrase”(脱纤酶)，用做诊断的工具称作“Reptilase-Reagent”(蛇酶试剂)。自矛头蝮(B.atrox)蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为43000D;自Bother.moojeni蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为36000D，由6条二硫链相接，含碳水化合物27%;由已糖、葡糖胺、唾液酸构成的“Batroxobin”是单链的糖肽，等电点6-7。在20℃、pH2.5-9的范围内，在水溶液中仍能保持稳定几小时;在甘油溶液中100℃加热1小时，活性仍无明显损失，表明能从矛头蝮B.atrox或B.moojeni蛇毒中大批量生产Batroxobin(Hofmann，H.，etal.，(1987)Biochemistry，26，780)。止血药Batroxobin是一种局部止血剂，用于流血部位的纤凝作用不为血浆血凝酶抑制剂或任何抗凝介质所抑制。
从B.atrox或是B.moojeni中来的Batroxobin(矛头蝮纤凝酶)像血凝酶样酶ancrid一样，分解纤维蛋白原Aa链上16精氨酸-17甘氨酸酯链，引起血纤肽A释放形成纤维蛋白单体。
国外学者研究表明，Reptilase由两种有效成分组成，具有类血凝酶和类凝血激酶样作用。在正常血管内，Reptilase只发挥类血凝酶样作用，不发挥类凝血激酶样作用，而在血管破损时，Reptilase同时发挥类血凝酶样作用和类凝血激酶样作用。蛇酶Retilase(Pentaphar公司的注册商标CH4002巴塞尔)为含血凝酶homecoagulaes的止血药，血液凝固系统来自B.atrox的毒液。Batroxobin又叫蛇酶，作为引起纤维蛋白I单体形成的媒介，小剂量注射在较长时间可使血液更易凝结。
目前较知名的同类品种为立止血(Reptilase、Hemocoagulase)，它是由瑞士素高大药厂制造的一种用于治疗和预防有出血症状疾病的酶性止血剂，是从巴西洞蝮蛇的毒液中提纯制得的无菌冻干制剂。中国每年进口数百万支“立止血”，价格达3-4亿人民币以上。
白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(pallas)]产于中国的长白山，资源丰富，开发价值很高。
第三、发明内容
本发明的目的是提供一种具有显著止血效果的蛇毒血凝酶I级酶制品及其生产方法。
一种蛇毒血凝酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取;该血凝酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为：54000D，34000D及15000D。
所述血凝酶具有类血凝酶样活性及类凝血激酶样活性。它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳的三条带，按照分子量从大到小各带所占比例分别为7-12%，76-86%及7-12%(重量)。该血凝酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60-120秒;所述血凝酶对于标准人血浆的初凝时间为40-80秒。
一种生产蛇毒血凝酶的方法，包括如下步骤：
(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒血凝酶I级酶制品;
(2)将所得的蛇毒血凝酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。
所述用酚饱和溶液洗脱进行2次为益;所述溶解I级酶制品所用的溶剂是0.05mol/L Tris-HCl缓冲液;I级酶制品所用的离子交换剂为DEAE-Sephadex A-50;离子交换柱层析后用Tris-HCl缓冲液NaCl直线梯度洗脱。
为了得到更加纯化的蛇毒血凝酶，可以对上述获得的精制蛇毒酶液再进行如下加工：将所述精制蛇毒酶液冻干，得到精制蛇毒酶液的冻干品;将精制蛇毒酶液的冻干品经脱盐得到蛇毒血凝酶II级酶制品溶液。
精制蛇毒酶液冻干品脱盐所用层析柱为G-75柱;所述全部提取过程在10±2℃的GMP环境中进行。
本发明的第二个目的是提供一种有效的凝血药物及其生产方法。
一种凝血药，它的活性成分是蛇毒血凝酶，该血凝酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取;它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为：54000D，34000D及15000D。
一种生产凝血药的方法，是将白眉蛇毒血凝酶II级酶制品溶液及其佐剂进行过滤、分装、冷冻、干燥灌封得到的;所述佐剂为甘露醇、水解明胶及注射用水，各种成分的重量(体积)份数比为：
25%甘露醇125(体积)
水解明胶0.5(重量)
注射用水350(体积)
血凝酶II级酶制品溶液25(体积)。
实验结果表明，本发明的凝血药在0.7U/mg体重的剂量下即有显著的止血作用。研究表明，白眉蛇毒血凝酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，呈正量效关系，且作用强于立止血。
本发明的血凝酶从中国特产的长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化，原料资源丰富，可以为大规模工业化生产提供可靠的保障，实现凝血药物的国产化。
本发明的凝血药物毒性极弱，经毒理试验给小白鼠注射本发明血凝酶的剂量为250Ku/Kg.B.W，相当于临床成人用量的2500倍，表明该药的LD50大于250Ku/Kg.B.W，临床使用安全，具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
第四、具体实施方式
实施例1、本发明白眉蛇毒血凝酶及血凝酶药物制剂的生产
取白眉蛇毒晶体20g溶于1000ml 0.9%NaCl注射液中，3000转/分离心10分钟，弃去沉淀。调整上清液pH至6.5，然后用0.9%NaCl注射液定容至1000ml。向此溶液中加入饱和硫酸铵溶液670毫升，混合物在室温条件下放置1小时，然后3000转/分离心10分钟，弃沉淀。向上清中加入饱和硫酸铵溶液552毫升，室温放置1小时，混合物3000转/分离心10分钟，弃上清沉淀溶解在1000ml蒸馏水中，调节pH至5.0。向此溶液中加入90%苯酚7.7毫升，混合物在室温条件下放置15小时，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀。沉淀用酚饱和溶液洗两次，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀，得到蛇毒血凝酶I级酶制品。
沉淀移入含乙酸的95%乙醇中，然后在玻璃负压过滤器中过滤，过滤物用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，上DEAE-Sephadex A-50的层析柱，用0.05mol/LTris-HCl缓冲液NaCl洗脱，流速为0.8-1.0ml/min，然后，用含有NaCl的0.05mol/LTris-HCl进行直线梯度洗脱，得到精制蛇毒酶液180毫升。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性100Ku/mg，将收集的精制酶液用冻干机冻干，得冻干粉58mg，取冻干品用水溶解，上G-75柱用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，得到蛇毒血凝酶II级酶制品溶液250毫升。
上述全部提取过程均在10±2℃的GMP环境中进行。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性150Ku/mg，经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定呈三条带，分子量分别为：54000，34000，及15000，各带所占比例分别为7-12%，76-86%及7-12%(重量)。得到的血凝酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60秒;所述血凝酶对于标准人血浆的初凝时间为40秒。
经配方[甘露醇125ml(25%)、水解明胶0.5g、注射用水350ml、血凝酶25ml]超滤、分装、冻干、灌封得注射用白眉蛇毒血凝酶成品1000支，1Ku/支。
实施例2、本发明白眉蛇毒血凝酶类血凝酶样活性测定
本发明白眉蛇毒血凝酶具有类血凝酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入EDTA抑制其类凝血激酶样作用，来观察白眉蛇毒血凝酶对人纤维蛋白原的类血凝酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒血凝酶样品1ml(每支样品用1ml 5×10-3mol/L EDTA溶解)，分成4组，I、II、III分别为白眉蛇毒血凝酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白组(加生理盐水1ml)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入0.1%人纤维蛋白原1ml，观察并记录人纤维蛋白原凝固时间。结果如表1所示，
表1、人纤维蛋白原凝固时间测定结果
分组 管数(支) 样品剂量(Ku/ml) 人纤维蛋白原凝固时间(s) I II III IV 15 15 15 15 2 1 0.5 1ml生理盐水 50±6 80±9 a.b 140±16 -
a：P<0.01(同I组比较) b：P<0.01(同III组比较)
从表1可以看出，在EDTA存在的情况下，本发明的白眉蛇毒血凝酶能使人纤维蛋白原凝固，表现为类血凝酶样作用，同时，白眉蛇毒血凝酶使人纤维蛋白原凝固，呈正量效关系。
实施例3、本发明白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶样活性测定
本发明白眉蛇毒血凝酶具有类血凝酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入DFP(二异丙基氟磷酸)抑制其类血凝酶样作用，来观察白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒血凝酶样品1ml(每支样品用2×10-3mol/L DFP溶液溶解)，分成4组，I、II、III组分别为白眉蛇毒血凝酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白对照组(加生理盐水)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入缺凝血因子X的标准血浆(6)1ml或标准人血浆(7)1ml，观察并记录血浆凝固时间。结果如表2、表3所示：
表2、加入缺X因子血浆后的凝固情况
分组 试管数(支) 样品剂量(Ku/ml) 加入缺X因子血浆后凝固情况 I II III IV 10 10 10 10 2 1 0.5 1ml生理盐水 - - - -
表3、加入标准人血浆后的凝固情况及凝固时间结果
分组 试管数(支) 样品剂量(Ku/ml) 加入标准人血浆后凝固时间(s)
I II III IV 10 10 10 10 2 1 0.5 1ml生理盐水 150±16 260±30 a.b.c. 370±41 -
a：P<0.01(同I组比较) b：P<0.01(同III组比)
从表中的结果可以看出，在DFP存在的条件下，白眉蛇毒血凝酶不能使缺X因子的标准血浆凝固，但能使标准人血浆凝固，表现为类凝血激酶样作用，呈正量效关系，证明白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶样作用是通过激活X因子而发挥作用的。
实施例4、本发明白眉蛇毒血凝酶对家兔全血的促凝作用与立止血比较
蛇毒血凝酶具有类血凝酶样作用及类凝血激酶样作用。家兔给药后，通过观察出血时间及凝血时间，来观察白眉蛇毒血凝酶的促凝作用。
实验动物：日本大耳白家兔，体重2-3公斤，雌雄各半。
取家兔50只，分成5组，每组10只，I、II、III组分别为白眉蛇毒血凝酶高、中、低剂量组，剂量分别为4Ku/Kg.BW、2Ku/Kg.BW、1Ku/Kg.BW，IV组为空白对照组，注射2ml/Kg.BW生理盐水，V组为立止血组，剂量为2Ku/Kg.BW。各组静脉注射15分钟后，测定家兔出血时间和凝血时间(出血时间测定采用DuKe氏法—实用医学检验学P116;凝血时间测定采用玻片法—实用医学检验学P129)。结果如表4所示：
表4 家兔出血时间及凝血时间测定结果
分组 例数(只) 给药剂量(Ku/Kg.BW) 出血时间(s) 凝血时间(s) I II III IV V 10 10 10 10 10 4 2 1 2ml 2 23±4d 38±5abc 51±5d 74±8 42±4 75±8d 100±11abc 125±12d 180±20 108±10
a：P<0.01(同I组比较) b：P<0.01(同III组比较) c：P<0.01(同IV组比较)
从表4的数据可以看出，实验组家兔出血时间及凝血时间明显短于对照组，并呈明显剂量依赖关系。表明，本发明的白眉蛇毒血凝酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，且作用强于立止血。
