利用苯甲酸培养微藻的方法
第一、技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及一种利用苯甲酸培养微藻的方法。
第二、背景技术
微藻不仅可以作为生物燃料的原料，还可以产生多种高价值的细胞内产物，是一种高产、可持续利用的生物能源和生物质原料。并且藻细胞内的提取物质具有突出的生物活性，具有抗氧化、抗炎作用和降低心血管疾病的作用。
目前许多学者利用低温、高光、贫营养、高盐等极端非生物逆境条件诱导微藻生长，虽然这些方法有利于胞内目标组分含量的提高，但是也限制了微藻细胞的生长，进而降低了整体生物产量。由此可见，微藻生物量低是微藻生物质资源生产的瓶颈问题。
第三、发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种利用苯甲酸培养微藻的方法，本发明提供的方法能够有效提高微藻的生物量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种利用苯甲酸培养微藻的方法，包括：在微藻的生长调整期初始阶段添加苯甲酸后继续培养，所述苯甲酸的添加量为50～2000μg/L。
优选的，所述微藻包括小球藻、栅藻、衣藻和螺旋藻。
优选的，所述苯甲酸的添加量为300～600μg/L。
优选的，所述苯甲酸的添加量为500μg/L。
优选的，所述微藻的生长调整期初始阶段经培养基培养得到;所述微藻的接种量为培养液体积的5～15%。
优选的，当所述微藻在生长调整期初始阶段时，得到的培养物的OD680为0.3～0.6。
优选的，所述培养的温度为20～30℃，所述培养的光照时间为0～16h/d，所述培养的光照强度为0～6000Lux，所述培养的转速为150～250rpm。
优选的，当所述微藻采用自养模式培养时，采用添加苯甲酸的BG11培养基进行培养。
优选的，当所述微藻采用异养模式培养时，采用添加苯甲酸的含有葡萄糖的BG11培养基进行培养。
优选的，每升BG11培养基中含有1～20g葡萄糖。
本发明提供了苯甲酸在培养微藻中的方法，包括：在微藻的生长调整期初始阶段添加苯甲酸，所述苯甲酸的添加量为50～2000μg/L。本发明提供的方法能够有效提高微藻的生物量。实施例结果表明，采用本发明提供的方法，微藻的生物量增加了6.67～27%，油脂含量提高了13.65～45.6%，叶绿素a的含量提高了4.55～60%，叶绿素b的含量提高7.14～71%，尤其类胡萝卜素含量提高了31.9～153%%，蛋白质产量提高了26.2～28.6%，糖类产量提高了11.8～18.2%。
此外，本发明提供的方法有效地提高了微藻油脂转化率，改善了微藻中作为生物柴油主要成分的油脂组成成分;提高了色素、蛋白和多糖等物质的积累，从整体上提高生物柴油和高附加值产品产量。并且，本申请提供的方法具有高效、绿色、经济和便捷的显著优势。
第四、具体实施方式
本发明提供了一种利用苯甲酸培养微藻的方法，包括：在微藻的生长调整期初始阶段添加苯甲酸后继续培养，所述苯甲酸的添加量为50～2000μg/L。
本发明在微藻的生长调整期初始阶段添加苯甲酸后继续培养，所述苯甲酸的添加量为50～2000μg/L。在本发明中，所述微藻优选包括小球藻、栅藻、衣藻和螺旋藻;所述苯甲酸的添加量进一步优选为300～600μg/L;更优选为500μg/L。本发明优选采用培养基将微藻培养到生长调整期初始阶段。在本发明中，当所述微藻在生长调整期初始阶段时，得到的培养物的OD680优选为0.3～0.6，更优选为0.5;所述微藻的接种量优选为培养基体积的5～15%，更优选为10%。在本发明中，所述小球藻、栅藻、衣藻和螺旋藻的来源为均购买自中国科学院淡水藻种库。
在本发明中，当所述微藻采用自养模式培养时，优选采用BG11培养基进行培养;所述培养的温度优选为20～30℃;所述培养的光照时间优选为12～16h/天;所述培养的光照强度优选为0～6000Lux，更优选为4000Lux;所述培养的转速优选为150～250rpm，更优选为160～200rpm。在本发明中，对BG11培养基没有任何限定，采用本领域技术人员常规购买的即可。
在本发明中，当所述微藻采用异养模式培养时，采用含有葡萄糖的BG11培养基进行培养;所述含有葡萄糖的BG11培养基优选每升BG11培养基中含有1～20g葡萄糖;所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃;所述培养的转速优选为150～250rpm，更优选为160～200rpm。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种利用苯甲酸培养微藻的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
自养模式
向基础BG11培养基中接种10%小球藻进行培养，培养12天后，获得生长调整期初始阶段的小球藻;
将生长调整期初始阶段的小球藻接种于在基础BG11培养基中加入苯甲酸(BA)的培养基中，其中苯甲酸浓度为500μg/L，待混匀后，将小球藻细胞按10%的体积分数接种到上述含有BA的培养基中，初始浓度调整成OD680为0.5，待混匀后放入光反应器中，温度为20℃，转速150rpm，光照强度为4000Lux，光/暗比为16h/8h，待增殖到第12天进行采收。
实施例2
在含有葡萄糖的培养基中，接种10%小球藻进行培养，培养8天后，获得生长调整期初始阶段的小球藻，其中含有葡萄糖的培养基中每升BG11培养基中含有10g葡萄糖;
将生长调整期初始阶段的小球藻接种于在含有葡萄糖的基础BG11培养基中加入苯甲酸(BA)的培养基中，其中苯甲酸浓度为500μg/L，待混匀后，将小球藻细胞按10%的体积分数接种到上述含有BA的培养基中，初始浓度调整成OD680为0.5，待混匀后放入光反应器中，关闭光照模式，整体用锡箔纸罩住。温度为室温(20℃左右)，转速150rpm，待增殖到第8天进行采收。
实施例3
与实施例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%栅藻进行培养。
实施例4
与实施例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%栅藻进行培养。
实施例5
与实施例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%衣藻进行培养。
实施例6
与实施例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%衣藻进行培养。
实施例7
与实施例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%螺旋藻进行培养。
实施例8
与实施例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%螺旋藻进行培养。
对比例1
与实施例1的步骤相同，不同之处是对比例1不添加苯甲酸，即BA的浓度为0μg/L。待增殖到第12天进行采收。
对比例2
与实施例2的步骤相同，不同之处是对比例2不添加苯甲酸，即BA的浓度为0μg/L。待增殖到第8天进行采收。
对比例3
与对比例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%栅藻进行培养。
对比例4
与对比例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%栅藻进行培养。
对比例5
与对比例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%衣藻进行培养。
对比例6
与对比例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%衣藻进行培养。
对比例7
与对比例1的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%螺旋藻进行培养。
对比例8
与对比例2的条件参数相同，不同之处在于本实施例将接种10%螺旋藻进行培养。
应用例1
将实施例1～8和对比例1～8得到的藻液用预先干燥恒重的0.45μm混合纤维滤膜过滤10mL藻悬液，过滤后将滤膜转移到105℃电热鼓风干燥箱中干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温后用分析天平称重。通过计算过滤前后滤膜的重量可得到微藻的生物量。每个样品取三次平行样，检测结果见表1。
表1实施例1～8、对比例1～8得到的藻类的生物量
由表2记载的试验数据可知，实施例1与对比例1相比较可知，在自养条件下，采用本发明的方法能够显著增加小球藻的生物量，提高了16%;实施例2与对比例2相比较可知，在异养条件下，采用本发明的方法能够显著增加小球藻的生物量，提高了27%。实施例3与对比例3相比较可知，在自养条件下，采用本发明的方法能够显著增加栅藻的生物量，提高了26.06%;实施例4与对比例4相比较可知，在异养条件下，采用本发明的方法能够显著增加栅藻的生物量，提高了24.58%。实施例5与对比例5相比较可知，在自养条件下，采用本发明的方法能够显著增加衣藻的生物量，提高了6.67%;实施例6与对比例6相比较可知，在异养条件下，采用本发明的方法能够显著增加衣藻的生物量，提高了17.25%。实施例7与对比例7相比较可知，在自养条件下，采用本发明的方法能够显著增加螺旋藻的生物量，提高了8.24%;实施例8与对比例8相比较可知，在异养条件下，采用本发明的方法能够显著增加螺旋藻的生物量，提高了19.31%。
应用例2
将实施例1～8和对比例1～8得到的藻液于4℃下进行离心，然后去掉上清液将藻泥放入-80℃预冷冻2小时。随后取出样品放于冷冻干燥机内，待样品干燥后用玛瑙研钵研磨成藻粉。取30mg干藻粉装至玻璃试管中，加入3mL提取液(氯仿:甲醇=2:1v/v)后在黑暗条件下放置在混匀仪中震荡10小时;以1000rpm离心收集上清液后再次向藻粉中加入1.5mL提取液后在室温下超声;再次收集上清液，像其中加入甲醇和0.1%NaCl溶液，使最终氯仿：甲醇：水三者比例为1:1:0.9。将下层氯仿层转移到恒重玻璃试管中，在40℃下用氮吹仪吹至恒重，进行油脂含量检测，检测结果见表2。微藻油脂含量(%)=油脂总质量/干藻粉质量×100%。
表2实施例1～8、对比例1～8得到的藻类的油脂含量
油脂含量(mg/L)实施例146.28对比例135.6实施例259.4对比例240.8实施例345.2对比例338.8实施例455.2对比例442.8实施例533.5对比例529.5实施例643.5对比例634.5实施例742.6对比例736.5实施例845.6对比例836.5
由表2记载的实验数据可知，在小球藻生长调整期加入BA后，实施例1相较于没有添加BA的对比例1进行比较可知，实施例1中油脂含量提高了30%;实施例2相较于没有添加BA的对比例2进行比较可知，实施例2中小球藻油脂提高了含量45.6%。在栅藻生长调整期加入BA后，实施例3相较于没有添加BA的对比例3进行比较可知，实施例3中油脂含量提高了16.49%;实施例4相较于没有添加BA的对比例4进行比较可知，实施例4中栅藻油脂提高了含量28.97%。在衣藻生长调整期加入BA后，实施例5相较于没有添加BA的对比例5进行比较可知，实施例5中油脂含量提高了13.56%;实施例6相较于没有添加BA的对比例6进行比较可知，实施例6中衣藻油脂提高了含量26.09%。在螺旋藻生长调整期加入BA后，实施例7相较于没有添加BA的对比例7进行比较可知，实施例7中油脂含量提高了16.71%;实施例8相较于没有添加BA的对比例8进行比较可知，实施例8中螺旋藻油脂提高了含量24.93%。
应用例3
将实施例1～8和对比例1～8得到的藻液于4℃下进行离心，然后去掉上清液将藻泥放入-80℃预冷冻2小时。随后取出样品放于冷冻干燥机内，待样品干燥后用玛瑙研钵研磨成藻粉，得到冷冻干燥的藻粉。取2mL酯交换试剂(乙酰氯:甲醇=1:9v/v)与20mg冷冻干燥的藻粉混合，在80℃的水浴锅中反应2.5小时。酯交换反应后加入2mL(0.36mg/mL溶于正己烷中)苯甲酸甲酯作为内标;采用气相色谱仪测定油脂组分，检测结果见表3～6。
表3实施例1～2、对比例1～2得到的小球藻油脂组分含量
注：SFA：饱和脂肪酸;UFA：不饱和脂肪酸;MUFA：单不饱和脂肪酸;PUFA：多不饱和脂肪酸。
结果如表3所示，在自养模式中(实施例1和对比例1)，小球藻的调整期加入苯甲酸生长12天后不仅能够显著提高小球藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量。微藻饱和脂肪酸含量越高则生物柴油的稳定性越好，在制备生物柴油时可以降低聚合反应的危险，尤其是C16:0的含量。实施例1与对比例1相比，实施例1中饱和脂肪酸含量提高了37.2%，C16:0的含量分别增加70.5%。生物柴油的最佳组成成分为C16～C18，，苯甲酸可以有效提高C16～C18的组成百分比提高了12.7%;在异养模式中(实施例2和对比例2)，小球藻在调整期加入苯甲酸异养生长8天后不仅能够显著提高小球藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量;有些不饱和脂肪酸的含量没有检测出来，可能由于培养方式导致代谢途径发生变化，例如C18:3成分没有检测出来。实施例2与对比例2相比，饱和脂肪酸含量提高了49.9%，C16:0的含量增加103.2%。生物柴油的最佳组成成分为C16～C18，苯甲酸提高了C16～C18的组成百分比，500μg/L条件下可以提高6.2%。
表4实施例3～4、对比例3～4得到的栅藻油脂组分含量
注：SFA：饱和脂肪酸;UFA：不饱和脂肪酸;MUFA：单不饱和脂肪酸;PUFA：多不饱和脂肪酸。
结果如表4所示，在自养模式中(实施例3和对比例3)，栅藻的调整期加入苯甲酸生长12天后不仅能够显著提高栅藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量;在异养模式中(实施例4和对比例4)，栅藻在调整期加入苯甲酸异养生长8天后不仅能够显著提高栅藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量。
表5实施例5～6、对比例5～6得到的衣藻油脂组分含量
注：SFA：饱和脂肪酸;UFA：不饱和脂肪酸;MUFA：单不饱和脂肪酸;PUFA：多不饱和脂肪酸。
结果如表5所示，在自养模式中(实施例5和对比例5)，衣藻的调整期加入苯甲酸生长12天后不仅能够显著提高衣藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量;在异养模式中(实施例6和对比例6)，衣藻在调整期加入苯甲酸异养生长8天后不仅能够显著提高衣藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量。
表6实施例7～8、对比例7～8得到的螺旋藻油脂组分含量
注：SFA：饱和脂肪酸;UFA：不饱和脂肪酸;MUFA：单不饱和脂肪酸;PUFA：多不饱和脂肪酸。
结果如表6所示，在自养模式中(实施例7和对比例7)，螺旋藻的调整期加入苯甲酸生长12天后不仅能够显著提高螺旋藻中生物柴油最佳组成成分，并且能提高饱和脂肪酸的含量;在异养模式中(实施例8和对比例8)，螺旋藻在调整期加入苯甲酸异养生长8天后不仅能够显著提高螺旋藻的中生物柴油最佳组成成分，并且能提饱和脂肪酸的含量。
应用例4
将实施例1～2和对比例1～2得到的小球藻藻液取5mL藻液用离心机4℃下13500rpm离心5min，弃掉上清液，再加入5mL 90%的甲醇，超声混合2min。放入60℃水浴锅中加热10min，之后再次离心(4℃下13500rpm离心5min)，最后分别测定470nm，652nm，665nm，750nm波长处的上清液吸光度(多波长测量)，测750nm是为了去除杂质的影响，其中，叶绿素a(mg/L)=16.82A665-9.28A652，叶绿素b(mg/L)=36.92A652-16.54A665，类胡萝卜素(mg/L)=(1000A470-1.19Ca-95.15Cb)/225，检测结果见表7。
表7实施例1～2、对比例1～2得到的小球藻叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量
实施例1对比例1实施例2对比例2叶绿素a(mg/L)0.480.30.230.22叶绿素b(mg/L)0.650.380.300.28类胡萝卜素(mg/L)1.140.450.620.47
结果如表7所示，实施例1与对比例1相比较，实施例1中叶绿素a、叶绿素b的含量中分别提高了60%和71%，尤其类胡萝卜素含量提高了153%。实施例2与对比例2相比较，实施例2中叶绿素a、叶绿素b的含量中分别提高了4.55%和7.14%，尤其类胡萝卜素含量提高了31.91%。
应用例5
将实施例1～2和对比例1～2得到的小球藻藻液离心(4℃下13500rpm离心30min)，弃上清液。将剩余藻泥放入冻干机-60℃冷冻48h，获得干燥粉。用80%乙醇混合10mg干燥粉3h，将混合物离心(4℃下13500rpm离心3min)，弃上清液，加入2mL 2mol/L NaOH，混匀在100℃孵化10min，离心(4℃下13500rpm离心3min)后上清液，进行蛋白质产量检测，结果如表8所示。
表8实施例1～2、对比例1～2得到的小球藻蛋白质含量
结果如表8所示，实施例1与对比例1相比较，实施例1中蛋白质含量提高了28.6%;实施例2和对比例2相比较，实施例2中小球藻的蛋白质含量提高了26.2%。
应用例6
将实施例1～2和对比例1～2得到的小球藻藻液离心(4℃下13500rpm离心30min)，弃上清液。将剩余藻泥放入冻干机-60℃冷冻48h，获得干燥粉。用3mL 80%乙醇混合10mg干燥粉，在68℃下孵化15min，然后离心(4℃下13500rpm离心30min)，保留上清液A，藻泥中加入1.5mL 30%的高氯酸，混合15min，然后离心(4℃下13500rpm离心30min)，获得上清液B，将上清液A和B混合在一起，进行糖类产量检测，检测结果见表9。
表9实施例1～2、对比例1～2得到的小球藻糖类含量
实施例1对比例1实施例2对比例2糖类产量(%，DW)15.613.212.311
结果如表9所示，实施例1与对比例1相比较，实施例1中糖类含量提高了18.2%;实施例2和对比例2相比较，实施例2中小球藻的糖类含量提高了11.8%。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法可以能够有效微藻的生物量。实施例结果表明，采用本发明提供的方法，在自养条件下，微藻的生物量增加了6.67～26.06%，油脂含量提高了13.56～30%，叶绿素a的含量提高了60%，叶绿素b的含量提高71%，尤其类胡萝卜素含量提高了153%，蛋白质产量提高了28.6%，糖类产量提高了18.2%;在异养条件下，微藻的生物量增加了17.75～27%，油脂含量提高了24.93～45.6%，叶绿素a的含量提高了4.55%以上，叶绿素b的含量提高7.14%，尤其类胡萝卜素含量提高了31.91%，蛋白质产量提高了26.2%，糖类产量提高了11.8%。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
