一种核酸检测用改性硅胶膜的制备方法
技术领域
本发明属于核酸提取材料制备技术领域，具体涉及一种核酸检测用改性硅胶膜的制备方法。
背景技术
核酸抽提是下游核酸检测、研究或产品开发的起点，所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果，因此核酸抽提是分子生物学最关键的方法之一。目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提出、或者总核酸。现有技术的大多数商业核酸提取试剂盒均采用固相抽提法，其主要以固相支持物为载体，包括细胞裂解、核酸吸附、漂洗和洗脱四个关键步骤。而根据使用的固相支持物的不同，主要分为离心柱法核酸提取和磁珠法核酸提取两种方法。
磁珠法核酸提取的主要原理是用带有磁荷的颗粒进行核酸的分离；这些磁颗粒一般用表面包被活性基团的氧化铁颗粒制成，磁珠表面包被有活性基团可特异性吸附核酸，后期可通过磁场中的永磁将其移除。氧化铁表面积大，结合核酸的能力较强，可作为较好的分离载体。赋予容器侧壁磁性之后，样品混合物中结合有核酸的磁珠则聚集到容器壁，直接倾倒容器可将其他杂质去除，避免了反复离心。而离心柱法核酸提取大多数是以硅胶滤膜作为固相载体的，基于二氧化硅选择性结合DNA的独特属性。其原理是带负电的DNA骨架与带正电的硅胶滤膜之间的高亲和力。钠离子起到阳离子桥的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。在高盐条件(pH≤7)下，钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。通过大量漂洗去掉所有杂物后，用缓冲液或蒸馏水在低离子强度下(pH≥7)洗脱纯化的DNA。
离心柱法在大规模的核酸检测中具有极高的使用潜力，但是它也存在着核酸提取的产量低，整个提取的用时较长的不足。
发明内容
为了改善上述背景技术中所述的离心柱法核酸提取的产量低，整个提取的用时较长的不足的问题，针对离心柱法提取核酸的固相载体，发明提供一种改性硅胶膜。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种核酸检测用改性硅胶膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将正硅酸乙酯(TEOS)溶于无水乙醇和冰醋酸混合液中超声搅拌10-20min，然后向混合溶液中缓慢滴入适量的丙三醇-去离子水溶液并室温下搅拌5-10min。随后把浓盐酸缓慢的滴入溶液中，同时50-60℃水浴搅拌30-40min，滴加完成后将水浴温度降至35-40℃并向混合溶液中先后加入适量PVA水溶液和甲基纤维素的乙醇溶液室温搅拌40-60min。然后将溶液用滤纸过滤得到二氧化硅混合溶胶。
步骤二：将二氧化硅混合溶胶分散在一定量的乙醇中超声混合10-15min，后加入适量γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌2-4h后分别用乙醇、丙酮、四氢呋喃离心洗涤1次，洗涤后将样品超声5-10min均匀分布在50ml的四氢呋喃中，然后加入适量苯偏三酸酐，50-60℃水浴搅拌3-5h；随后用去离子水离心洗涤3次获得羧基改性二氧化硅混合溶胶。
步骤三：将羧基改性二氧化硅混合溶胶溶于一定量的多巴胺溶液中搅拌5-10min后，加入适量壳聚糖溶液(CTS)室温搅拌12-18h后离心。然后把离心产物加入戊二醛溶液中，45-50℃水浴搅拌2-3h，用去离子水洗涤2次后，在氩气氛下以60-70℃干燥。
步骤四：将步骤三制备的改性二氧化硅和少量的去离子水混合后在100级洁净室中，以硅片为衬底、甩胶机成膜后，凝胶硅胶薄膜在氮气保护下以350℃热处理40-60min，冷却至室温后获得核酸检测用改性硅胶膜。
所述步骤一中正硅酸乙酯的添加量为0.05-0.1mol，正硅酸乙酯在无水乙醇和冰醋酸混合溶液中的浓度为0.6-0.85g/ml，无水乙醇和冰醋酸的体积比为2:1-1:1，正硅酸乙酯和丙三醇的物质的量之比为1:1-5:1，正硅酸乙酯和去离子水的物质的量之比为1:2-1:4，正硅酸乙酯和浓盐酸的物质的量之比为20:1-33:1。
所述步骤二中制备的二氧化硅混合溶胶的乙醇溶液的浓度是0.1g/ml，体系中二氧化硅和γ-氨丙基三乙氧基硅烷的物质的量之比为25:1-50:1，二氧化硅和苯偏三酸酐的质量比为10:1-15:1。
所述步骤三中多巴胺溶液的制备方法是：将盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液和去离子水按照5-10:3-6:1250的质量比混合后室温下搅拌制得，二氧化硅混合溶胶的多巴胺溶液的浓度是0.05g/ml；壳聚糖溶液用醋酸稀释至1wt％，它的添加量和多巴胺溶液的体积比为0.8:1-1:1；戊二醛溶液的浓度为1wt％，和多巴胺溶液的体积比1:8-1:10。
优选的，所述步骤一中PVA水溶液的质量百分比为10wt％，PVA水溶液和无水乙醇-冰醋酸混合溶液的体积比为1:2-1:4；甲基纤维素的乙醇溶液的浓度为0.5wt％，甲基纤维素溶液和无水乙醇-冰醋酸混合溶液的体积比为1:2-1:4。
优选的，所述步骤一中向混合溶液中滴入适量丙三醇-去离子水溶液的速度为1ml/min。
优选的，所述步骤四中甩胶机的转速为2500-3200r/min，成膜的时间为25-30s；硅胶膜在热处理时的升温速率保持为2℃/min。
本发明另一方面还提供由上述制备方法制备得到的改性硅胶膜，核酸吸收和蛋白吸收最高峰的比值大于1.8，核酸浓度大于28μl，提取完成小于45min。另一方面还提供上述改性硅胶膜在核酸检测上的应用。
有益效果：本发明提供的核酸检测用改性硅胶膜，有效改善现有技术中核酸提取的产量低，整个提取的用时较长的不足的问题。本发明通过甲基纤维素和二氧化硅的混合，优化了制得硅胶膜的内部结构，增大了硅胶膜和核酸检测液的接触，提高了二氧化硅对于核酸的结合率，也为后续多巴胺和CTS的接枝提供位点；后续在二氧化硅的表面使用羧基改性，并以此为基础接枝了PDA和CTS，能够进一步增强硅胶膜对于核酸的选择吸附性；而且一定程度上增强了核酸的吸附强度，进而减少离心所用时间。通过以上的改性，在PDA、CTS和甲基纤维素的共同作用下有效提高了核酸提取产量，降低了整个过程的时长。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的改性硅胶膜的100μm的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
步骤一：将8.3ml无水乙醇和8.3ml冰醋酸混合后加入10.4g的TEOS并超声搅拌10min获得混合溶液A，然后4.6g丙三醇和1.8ml去离子水混合后以1ml/min的速度滴入混合溶液A中并室温下搅拌5min。随后把2.5mmol浓盐酸缓慢的滴入溶液中，同时50℃水浴搅拌30min获得混合溶液B，然后把水浴温度降至35℃并向混合溶液B中先后滴入4.15ml的PVA水溶液和8.3ml甲基纤维素的乙醇溶液室温搅拌40min。然后将溶液用滤纸过滤得到二氧化硅混合溶胶。
步骤二：将2g二氧化硅混合溶胶分散在20ml乙醇中超声混合10min，然后加入0.15g的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌2h后分别用乙醇、丙酮、四氢呋喃离心洗涤1次，洗涤后将样品超声5min均匀分布在50ml的四氢呋喃中，然后加入0.2g苯偏三酸酐，50℃水浴搅拌5h；随后用去离子水离心洗涤3次获得羧基改性二氧化硅混合溶胶。
步骤三：将2g羧基改性二氧化硅混合溶胶溶于40ml的多巴胺溶液中搅拌10min后，加入32ml壳聚糖溶液室温搅拌12h后离心。然后把离心产物加入4ml戊二醛溶液中，45℃水浴搅拌3h，用去离子水洗涤2次后，在氩气氛下以60℃干燥。
步骤四：将步骤三制备的改性二氧化硅和少量的去离子水混合后在100级洁净室中，以硅片为衬底、在甩胶机上以3200r/min的速度成膜25s后，凝胶硅胶薄膜在氮气保护下以2℃/min的速率升温至350℃并热处理40min，冷却至室温后获得核酸检测用改性硅胶膜。
实施例2
步骤一：将15.7ml无水乙醇和7.8ml冰醋酸混合后加入20.8g的TEOS并超声搅拌20min获得混合溶液A，然后1.83g丙三醇和7.2ml去离子水混合后以1ml/min的速度滴入混合溶液A中并室温下搅拌10min。随后把3mmol浓盐酸缓慢的滴入溶液中，同时60℃水浴搅拌40min获得混合溶液B，然后把水浴温度降至40℃并向混合溶液B中先后滴入11.8ml的PVA水溶液和5.9ml甲基纤维素的乙醇溶液室温搅拌60min。然后将溶液用滤纸过滤得到二氧化硅混合溶胶。
步骤二：将3g二氧化硅混合溶胶分散在30ml乙醇中超声混合15min，然后加入0.3g的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌4h后分别用乙醇、丙酮、四氢呋喃离心洗涤1次，洗涤后将样品超声10min均匀分布在50ml的四氢呋喃中，然后加入0.2g苯偏三酸酐，60℃水浴搅拌3h；随后用去离子水离心洗涤3次获得羧基改性二氧化硅混合溶胶。
步骤三：将2.5g羧基改性二氧化硅混合溶胶溶于50ml的多巴胺溶液中搅拌5min后，加入50ml壳聚糖溶液室温搅拌18h后离心。然后把离心产物加入6.25ml戊二醛溶液中，50℃水浴搅拌2h，用去离子水洗涤2次后，在氩气氛下以70℃干燥。
步骤四：将步骤三制备的改性二氧化硅和少量的去离子水混合后在100级洁净室中，以硅片为衬底、在甩胶机上以2500r/min的速度成膜30s后，凝胶硅胶薄膜在氮气保护下以2℃/min的速率升温至350℃并热处理60min，冷却至室温后获得核酸检测用改性硅胶膜。
实施例3
步骤一：将9ml无水乙醇和15ml冰醋酸混合后加入18g的TEOS并超声搅拌12min获得混合溶液A，然后4.8g丙三醇和4.5ml去离子水混合后以1ml/min的速度滴入混合溶液A中并室温下搅拌6min。随后把3.4mmol浓盐酸缓慢的滴入溶液中，同时54℃水浴搅拌38min获得混合溶液B，然后把水浴温度降至36℃并向混合溶液B中先后滴入6.8ml的PVA水溶液和8.9ml甲基纤维素的乙醇溶液室温搅拌45min。然后将溶液用滤纸过滤得到二氧化硅混合溶胶。
步骤二：将3g二氧化硅混合溶胶分散在30ml乙醇中超声混合14min，然后加入0.26g的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌2.5h后分别用乙醇、丙酮、四氢呋喃离心洗涤1次，洗涤后将样品超声6min均匀分布在50ml的四氢呋喃中，然后加入0.28g苯偏三酸酐，58℃水浴搅拌3.5h；随后用去离子水离心洗涤3次获得羧基改性二氧化硅混合溶胶。
步骤三：将3g羧基改性二氧化硅混合溶胶溶于60ml的多巴胺溶液中搅拌5min后，加入54ml壳聚糖溶液室温搅拌16h后离心。然后把离心产物加入6.7ml戊二醛溶液中，46℃水浴搅拌2.8h，用去离子水洗涤2次后，在氩气氛下以62℃干燥。
步骤四：将步骤三制备的改性二氧化硅和少量的去离子水混合后在100级洁净室中，以硅片为衬底、在甩胶机上以2800r/min的速度成膜28s后，凝胶硅胶薄膜在氮气保护下以2℃/min的速率升温至350℃并热处理52min，冷却至室温后获得核酸检测用改性硅胶膜。
实施例4
步骤一：将14ml无水乙醇和7.4ml冰醋酸混合后加入15g的TEOS并超声搅拌15min获得混合溶液A，然后3.5g丙三醇和2.9ml去离子水混合后以1ml/min的速度滴入混合溶液A中并室温下搅拌8min。随后把2.4mmol浓盐酸缓慢的滴入溶液中，同时55℃水浴搅拌35min获得混合溶液B，然后把水浴温度降至38℃并向混合溶液B中先后滴入7.1ml的PVA水溶液和8.6ml甲基纤维素的乙醇溶液室温搅拌50min。然后将溶液用滤纸过滤得到二氧化硅混合溶胶。
步骤二：将2.5g二氧化硅混合溶胶分散在25ml乙醇中超声混合13min，然后加入0.25g的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌3h后分别用乙醇、丙酮、四氢呋喃离心洗涤1次，洗涤后将样品超声8min均匀分布在50ml的四氢呋喃中，然后加入0.19g苯偏三酸酐，55℃水浴搅拌4h；随后用去离子水离心洗涤3次获得羧基改性二氧化硅混合溶胶。
步骤三：将2.5g羧基改性二氧化硅混合溶胶溶于50ml的多巴胺溶液中搅拌8min后，加入50ml壳聚糖溶液室温搅拌15h后离心。然后把离心产物加入5.5ml戊二醛溶液中，47℃水浴搅拌2.5h，用去离子水洗涤2次后，在氩气氛下以65℃干燥。
步骤四：将步骤三制备的改性二氧化硅和少量的去离子水混合后在100级洁净室中，以硅片为衬底、在甩胶机上以3000r/min的速度成膜27s后，凝胶硅胶薄膜在氮气保护下以2℃/min的速率升温至350℃并热处理50min，冷却至室温后获得核酸检测用改性硅胶膜。
对比例1
步骤一：将20.8g的TEOS溶于18.4g无水乙醇中，然后加入1.8g去离子水和4.5g丙三醇，随后滴加0.03mol浓盐酸，并常温下搅拌反应5h形成二氧化硅溶胶。然后向溶胶中加入10mL的PVA水溶液，搅拌下水解60min后，用慢速滤纸过滤可得二氧化硅溶胶。
步骤二：与实施例1的步骤二相同。
具体分析如下：
图1是实施例1制备的核酸检测用改性硅胶膜在100μm尺寸下的扫描电子显微镜图片。本发明选用二氧化硅溶胶制备方法结合甲基纤维素掺杂制备出的二氧化硅溶胶应为网状且比表面积较大；从图中并不能明显的看出纤维素或孔洞的存在，这从侧面证明了多巴胺和壳聚糖成功的接枝在了二氧化硅的表面。因此在SEM图片中看得无缺陷的表面，表面的凸点是接枝在二氧化硅上的PDA或CTS。
为了验证本发明所述制备方法制备得到的改性硅胶膜在核算分离中的有效作用，将实施例1-4和对比例1的硅胶膜进行核酸提取的实验。具体实验结果在表1中罗列。实验使用300μl的样品量，洗脱液的用量为100μl；具体操作方法按照现有技术的标准流程进行。
表1
从表1可以看出在核酸吸收和蛋白吸收最高峰的对比上(OD260/280)，实施例1-4的比值都在1.8以上，最高为1.86；对比例1的值为1.75，这说明本发明所述制备方法制备得到的改性硅胶膜在核酸提取时在纯度上有了进步，且该纯度在1.8-2.0的范围内，属于公认的核酸的纯度高。核酸浓度主要表示核酸的提取产量，从这一项可以看到实施例1-4的最低都有28μl，最高达到了33μl，而对比例1仅为9μl，提升量在原有的三倍以上，说明发明所述制备方法制备得到的改性硅胶膜的核酸产量有利极大的进步。完成整个过程的时间上，现有技术的对比例一为56min，而实施例1-4则在45min以下，大幅度缩短了离心柱法核酸提取的时间。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
