一株锑氧化肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株锑氧化肠杆菌及其应用。
背景技术
锑(Sb)具有慢性毒性、致癌性、且呈全球迁移性特点，是全球性污染物和优先控制污染物。锑(Sb)及其化合物可通过食物链和水等途径进入人体，不仅影响某些酶的作用，还可导致肝和心血管系统方面的疾病，因此，世界卫生组织、欧盟和中国均对饮用水中锑含量做了严格限制(<5μg/L)，其中三价锑的毒性是五价锑的十倍，因此将Sb(Ⅲ)氧化为Sb(Ⅴ)有利于减小其环境危害和风险。国内外针对如何将Sb(Ⅲ)氧化为Sb(Ⅴ)做了一些研究，如投加化学氧化剂等处理技术。这些技术将Sb(Ⅲ)氧化为Sb(Ⅴ)，但仍有氧化效率低、成本高、操作复杂、易产生二次污染等不足。近年来，国内外学者提出了安全经济、环境友好、氧化效率高的微生物氧化技术。有关高效锑氧化微生物的筛选、鉴定是微生物除锑技术的基石之一，但这方面的研究相对来说较少。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株锑氧化肠杆菌及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一株锑氧化肠杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2020006。本发明的肠杆菌(Enterobacter DHHN0903)保藏在中国典型培养物保藏中心，名称为Enterobacter sp.AO-3，保藏单位简称为CCTCC，保藏日期为2020年1月3日。
如上所述的锑氧化肠杆菌在锑氧化中的应用。
进一步地，所述锑氧化具体为将Sb(Ⅲ)氧化为Sb(Ⅴ)。
如上所述的锑氧化肠杆菌在土壤或水体的锑污染防治中的应用。实现Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)在土壤或水体中迁移转化过程控制，降低土壤或水体中锑毒性及生态危害。利用肠杆菌菌株DHHN0903较高锑氧化程度和较快锑氧化速度将水体中Sb(Ⅲ)转化为毒性更低的Sb(Ⅴ)，达到解毒效果，从源头上对重金属Sb污染进行有效防治。
进一步地，应用方法包括使用Fe3+离子促进锑氧化肠杆菌对锑的氧化。具体为促进Sb(Ⅲ)氧化为Sb(Ⅴ)。
进一步地，所述锑氧化肠杆菌在30℃有氧条件下对待测样品进行处理。
进一步地，所述Fe3+以FeCl3的形式加入至反应体系中。
进一步地，反应体系中FeCl3的浓度为0.1mol/L。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明的肠杆菌菌株DHHN0903为革兰氏阴性菌，该细菌在锑含量高的溶液和土壤中依然能够生存，具有较好的锑耐受性，便于在锑污染环境下进行生物修复。并且经过检验，具有高效的锑氧化性，为微生物吸附除锑技术的发展奠定了重要基础。该菌株对Sb(Ⅲ)具有高效的氧化性能，对微生物氧化除锑技术的发展具有重要意义。
同时，该技术对环境友好；菌种培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用潜力。
另一方面，菌种结合Fe改性效果良好，能提高其氧化效率，具有良好的开发应用潜力。
附图说明
图1是高效锑氧化肠杆菌DHHN0903的平板菌落形态照片；
图2是本发明肠杆菌的系统进化树；
图3是本发明肠杆菌氧化性能曲线；
图4是本发明肠杆菌改性氧化性能曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一株锑氧化肠杆菌及其应用，具体内容如下各实施例所示。
实施例1高效锑氧化肠杆菌DHHN0903的分离筛选及鉴定
本发明从湖南省冷水江市的锡矿山龙王池尾砂坝附近的土壤取样进行筛选，具体通过平板划线筛选获得，筛选方法属于本领域常规菌株分离筛选实验方法。具体方法及过程描述如下：称取10g土壤样品，加入250ml的已灭菌锥形瓶中；取90ml无菌水浸泡，在温度为30℃摇床上震荡30min，静置30s；采用系列稀释涂布法分离细菌，挑选单菌落后，固体培养基上划线纯化，在30℃恒温培养箱进行细菌纯培养，获得纯化菌株。平板菌落图参见图1。生理生化特征和16S rDNA序列分析，并参照文献(Claesson MJ,O’Sullivan O,Wang Q,etal.Comparative Analysis of Pyrosequencing and a Phylogenetic Microarray forExploring Microbial Community Structures in the Human Distal Intestine.AhmedN,ed.PLoS ONE.2009；4(8):e6669；Parks DH,Tyson GW,Hugenholtz P,Beiko RG.STAMP:statistical analysis of taxonomic and functionalprofiles.Bioinformatics.2014；30(21):3123-3124.)进行鉴定，同时委托中国典型培养物保藏中心对微生物菌株16S rRNA基因序列测定与分析；并根据上述结果初步确定送检微生物菌株的分类地位，报告编号为CCTCC-JD-2019283。基因测试并构建系统进化树，见图2，结果表明，肠杆菌DHHN0903(Enterobacter DHHN0903)与Enterobacter huaxiensis具有最大的相似度，两者相似度达到99.34307％。经鉴定为肠杆菌属，Enterobacter sp.，命名为DHHN0903。
本实施例通过16S rRNA序列对本发明的肠杆菌DHHN0903进行测试分析。
16S rRNA相关鉴定方法：
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物27F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和下游引物1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，对肠杆菌DHHN0903的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，克隆并测序。
测序后获得1433bp的片段，在GenBank的登录号为MN720565，经过测序得到该菌属于肠杆菌，扩增片段的测序结果见SEQ ID No.1所示。
高效锑氧化肠杆菌DHHN0903的16S rRNA基因测序BLAST结果如下表：
表1 BLAST对比结果
肠杆菌DHHN0903的生理生化特性如下：
表2菌株生理生化特性–酶活、碳源同化
+：阳性反应；-：阴性反应；弱阳性反应
表3菌株生理生化特性—利用碳源产酸
该菌种的分离纯化培养条件、检测存活性条件是：CDM培养基(MgSO4·7H2O，2.0g；NH4Cl，1.0g；Na2SO4，1.0g；K2HPO4，0.013g；CaCl2·2H2O，0.067g；Na-lactate，5.0g；琼脂，15.0g；蒸馏水1000mL；pH 7.0)；30℃。
该菌种的检测存活性条件是：CDM培养基(MgSO4·7H2O，2.0g；NH4Cl，1.0g；Na2SO4，1.0g；K2HPO4，0.013g；CaCl2·2H2O，0.067g；Na-lactate，5.0g；琼脂，15.0g(固体培养基含琼脂，液体培养基不含)；蒸馏水1000mL；pH 7.0)；30℃。
实施例2高效锑氧化菌DHHN0903的耐锑性能测试(固体培养基)
采用平板划线在不同锑浓度的CDM固体培养基上划线，在30℃恒温培养箱中恒温培养，测定耐锑性能。高效锑氧化菌DHHN0903在含锑浓度为1-8000mg/L的固体培养基上均能正常生长，锑浓度为9000mg/L生长极其缓慢，几乎不生长。
与其他研究报道相比较，肠杆菌DHHN0903对重金属锑的抗性高于其他报道的微生物。菌株长期生存在重金属污染区，对重金属锑的强抗性可能与它的复杂的生存环境有关。
实施例3肠杆菌DHHN0903氧化性能测试
实验对肠杆菌DHHN0903的锑氧化能力进行了初步研究。使用的培养基为CDM液体培养基，加入Sb(Ⅲ)，浓度为0.5mmol/L。其中用酵母膏替换乳酸钠。酵母膏作为一种更好的碳源和氮源的综合性营养物质，能够促进菌株的生长。设置3个平行组以及1个空白对照(不接种菌)，每组配制250mL培养液，进行高温灭菌(121℃，30min)，在超净工作台上冷却至适宜温度后，接入3％的DHHN0903菌液，4组锥形瓶均放到30℃、150rpm的摇床中培养，实验持续一周。每间隔4小时测定一次吸光度，绘制生长曲线。同步每间隔8小时测定一次氧化情况，绘制氧化曲线。其中生长曲线用紫外分光光度计测定其OD690。氧化曲线测定时，先将样品在5000rpm下离心5min，取上清液，使用原子荧光光度计(AFS-9700，北京海光仪器公司)测定其中Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)的浓度，绘制浓度曲线，结果如图3所示。得到DHHN0903最大锑氧化速率为21.6μmol/L/h。氧化速率计算公式如下：
式中其中v是反应速率，S是底物的浓度。Vmax表示最大速度，Km是Michaelis-Menton常数。其中Vmax和Km由(初始速率)-1与(初始底物浓度)-1的比值确定。
实施例4 Fe3+离子促进肠杆菌DHHN0903对锑的氧化速率
对肠杆菌DHHN0903用铁盐改性，然后测试其氧化性能。使用的培养基为CDM液体培养基，加入Sb(Ⅲ)，浓度为0.5mmol/L。其中用酵母膏替换乳酸钠。在培养基中格外加入FeCl3使其浓度为0.1mol/L，混合震荡均匀。设置3个平行组以及1个空白对照(不接种菌)，每组配制250mL培养液，进行高温灭菌(121℃，30min)，在超净工作台上冷却至适宜温度后，接入3％的DHHN0903菌液，4组锥形瓶均放到30℃、150rpm的摇床中培养，实验持续一周。测定氧化情况，绘制氧化曲线，如图4。
由曲线可知，未投加Fe3+离子的条件下，DHHN0903菌液对Sb(Ⅲ)平均氧化速率为2.10μmol/L/h；投加Fe3+离子的条件下，DHHN0903菌液对Sb(Ⅲ)平均氧化速率为2.85μmol/L/h。说明Fe3+离子促进肠杆菌DHHN0903对锑的氧化速率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南科技大学
<120> 一株锑氧化肠杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> 肠杆菌(Enterobacter)
<400> 1
gactggcggc gctaccatgc aagtcgagcg gtaacacagg gagcttgctc ctgggtgacg 60
agcggcggac gggtgagtaa tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga 120
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