果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用
技术领域
本发明属于微生物及发酵领域，特别涉及一种果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用。
背景技术
烤烟品质对烟草行业的发展有重要影响，烟叶香气不足一直是制约烟叶品质及其工业可用性的主要因素，特别是随着降焦工艺的发展，烟气中香气会进一步降低，致使卷烟品质下降，吸食者的接受度降低，因而对烟叶的香气品质提出了更高的要求。目前改善烟叶香气品质的措施主要集中在品种选育、改善栽培技术和卷烟加工中加香加料等措施。起始阶段，香料来源主要是化学合成。化学法在成本上有优势，但是合成过程中会接触对人体危害较大的物质，并且产生环境污染。因此，开发新的香料来源逐渐成为趋势。
多种微生物发酵已被证实能产生香气物质。其中酵母菌对人体的健康无害，利用酵母菌产香已经在酿酒和食品等领域广泛应用。另外，微生物遗传变异度大，产生的香气物质多种多样，给人丰富的嗅香体验。东方伊萨酵母能够合成特殊的酯类物质，产生蟠桃香；毕赤酵母高产乙酸乙酯，也用于增加果香；球拟酵母能产生浓郁的酱香。酿酒酵母和毕赤酵母混合发酵增加花香果香，尤其热带水果香气。马克斯克鲁维酵母能产生高达400mg/L的苯乙醇，苯乙醇具有典型的玫瑰香型香气的重要成分，是构建香烟香型的重要成分，并且具有增强香气的作用。香气种类丰富的酵母发酵为烟草行业提供了切实可行的另一种香料来源。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种果香型酵母、筛选方法及在香烟中的应用。本发明利用酵母菌筛选并测定关键致香成分，优化发酵产香条件，并评价发酵产物在香烟增香中的应用效果，旨在丰富烟草行业新颖香气物质的来源，开发具有良好风味的新型香烟。
技术方案：本发明第一方面提供了一种果香型酵母的筛选方法，包括以下步骤：
(1)在不同海拔烟草种植区的多个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样；
(2)称取烟草样品，剪碎后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养，将培养液进行梯度稀释，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，置于培养箱中培养，挑取生长的单菌落接种到平板；
(3)将步骤(2)在平板上培养的单菌落接种于液体培养基，振荡培养；
(4)采用嗅香的方式进行感官评价，根据香味品质筛选最佳的果香型酵母。
步骤(2)中，所述的振荡培养条件为25-28℃下振荡培养2-3d。
步骤(3)中，所述的梯度稀释倍数为104-106。
本发明第二方面提供了上述的果香型酵母的筛选方法得到的果香型酵母。
本发明第三方面提供了一种果香型酵母的发酵培养基，包括20-30g/L葡萄糖，15-35g/L玉米浆粉，所述培养基的pH为5.0-6.0。
本发明第四方面提供了一种果香型酵母在香烟中的应用。
本发明第五方面提供了所述果香型酵母在香烟中的应用方法，包括以下步骤：
(a)一级培养：将YPD平板培养的酵母接种于YPD液体培养基中，在25-28℃和160-200rpm下振荡培养24-36h；
(b)二级培养：取步骤(a)中得到的菌液接入发酵培养基中，发酵培养基为20-30g/L葡萄糖，15-35g/L玉米浆粉，所述发酵培养基的pH为5.0-6.0；
(c)将步骤(b)中得到的过滤液过滤后，均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟。
上述的应用方法，步骤(b)中，菌液的接种量为5-10％。
上述的应用方法，步骤(c)中，菌液与烟丝的体积质量比为5-20μL/g。
有益效果：(1)本发明筛选到了R59菌株酵母，具有更有特色的果香型香气；(2)本发明通过对果香型酵母发酵条件进行筛选，在最佳的培养条件下，苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度分别达到348.6μg/mL和143.7μg/mL，比原始YPD培养基分别提高30％以上和10％以上；(3)本发明将R59菌株酵母的发酵液添加至烟丝中，能显著改善香烟的香气特征，R59菌株产香发酵液过滤后均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟后进行感官综合评价，发酵样品的果香气更浓更饱满，香气的协调性也有增加，余味更干净，能够显著提高抽吸品质。
附图说明
图1为R59菌株的菌落形态，其中，A为R59菌株在平板上的菌落形态，B为R59菌株在显微镜下细胞形态图；
图2为基于R59菌株ITS DNA序列的聚类分析结果；
图3为不同的发酵条件对香气物质生产的影响，其中，a为不同的葡萄糖浓度对香气成分的影响，b为不同的氮源种类对香气成分的影响，c为不同的玉米浆浓度对香气成分的影响，d为不同的培养基pH，每个数据取三次重复并计算方差。
具体实施方式
一、材料与方法
1.1材料、试剂和仪器
2018年7月采自湖北省恩施土家族自治州利川市不同海拔烟草种植区的19个地点，上部叶、中部叶、下部叶分别取样。
1.2试剂和培养基
试验试剂：Taq酶等PCR试剂、DNA分子量Marker、DNA提取试剂盒和PCR引物均购自青岛擎科生物科技有限公司；蛋白胨(peptone)、酵母粉(Yeast extract)、葡萄糖(Glucoseconcentration)、氯化钠、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和琼脂等培养基成分购自国药集团化学试剂有限公司；玉米浆(CSP)、玉米蛋白粉(Corn protein powder)和豆饼粉(Soybeancake powder)购自青岛科瑞培养基公司；苯乙醛、醋酸异戊酯、乙酸苯乙酯、二氯甲烷和甲醇等色谱纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
培养基：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，酵母菌和真菌采用YPD固体培养基，酵母菌液体培养采用YPD液体培养基。
YPD固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂25g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
1.3烟草微生物的分离
称取烟草样品10.0g，剪碎或者后分别放于YPD培养基或牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下振荡培养2d。将培养液进行梯度稀释，稀释倍数为104到106，分别涂布于YPD平板和牛肉膏蛋白胨平板，每个平板涂布100μl，置于28℃培养箱中培养2d。挑取生长的单菌落接种到平板，于28℃培养箱中培养2d，无菌保种液冲洗菌体，悬液收集于保种管，保藏在本实验室的-80℃超低温冰箱，建立菌株资源库。
1.4产果香微生物的筛选
从菌株资源库中取单个菌株在平板上活化，接种于液体培养基，在28℃和160rpm下振荡培养36h。采用嗅香的方式进行感官评价并赋分，分数越高，香味品质越好筛选最佳的产果香微生物。差异度由小到大满分10分，香气由弱到强满分20分，留香时间由短暂到持久满分10分，刺激性由大到小满分10分。
1.5果香酵母菌的鉴定
参照Kurtzman(2000)的方法进行鉴定。将R59菌株在YPD固体斜面上于28℃培养两天，观察菌落特征并利用显微镜观察细胞形态，继续完成生理生化特性分析。PCR扩增提取菌株的基因组DNA，用通用引物从基因组中PCR扩增ITS序列。
引物：上游引物ITS5：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
下游引物ITS3：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
30个循环对PCR产物进行测序，对序列进行在线比对
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。并从NCBI数据库中下载酵母菌中代表种的标准菌株的ITS DNA序列。基于菌株的ITS DNA序列，根据NJ法构建系统发育树
1.6发酵液中香气成分的分析
将液体培养基中发酵液收集于50ml离心管中，8000×g离心5min，取上清液，加入等体积的二氯甲烷，混匀后分别萃取保留有机相，减压蒸馏使之彻底干燥后溶于适量二氯甲烷，进行气质联用(GC/MS)分析。
仪器型号：Agilent7890A/5975C色谱柱：Agilent HP-INNOWax PolyethyleneGlyco(30m×250μm×0.25μm)。初始温度为100℃，然后以15℃/min的速率升温到280℃至10min，GC-MS运行时间为19.333min。质谱条件/接口温度：280℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃：离子化方式：EI；电子能量：70eV；质量扫描范围：m/z:35-400。每一个峰引入质谱，进行分析，然后将质谱图在数据库中比对，得到近的结构，根据峰面积计算各成分的含量和浓度。
1.7苯乙醛和醋酸异戊酯含量的测定
设备：Waters 2695色谱柱：Platisil C18柱(4.6mm×250mm)检测器：紫外，210nm；流动相：甲醇：水梯度洗脱；流速：1mL/min。
将两种色谱纯标准品配制成浓度为10-150mg/L的工作溶液，过滤后进行HPLC分析，制作标准曲线，构建峰面积对应浓度的线性方程。发酵液稀释至合适浓度过滤后上样，得到苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度。
1.8发酵产香条件的优化
将已活化的菌株从YPD平板接种于YPD液体培养基中，在28℃和160rpm下振荡培养24h，至细胞浓度达到OD600nm＝15.0。取5ml菌液接入装有50.0ml不同培养基的250-ml三角瓶中，在28℃和160rpm下振荡培养36h，测定发酵液中苯乙醛和醋酸异戊酯含量。研究培养基中不同的葡萄糖浓度、氮源种类、玉米浆(CSP)浓度和pH值对产香的影响，找到最合适的发酵条件。
1.9发酵液增香效果的感官评价
将R59菌株从YPD平板接种于YPD液体培养基中，在28℃和160rpm下振荡培养24h，至细胞浓度达到OD600nm＝15.0。取5ml菌液接入装有50.0ml最佳培培养基的250-ml三角瓶中，在28℃和160rpm下振荡培养36h。发酵液收集于50ml离心管中，8000×g离心5min，过滤后以5-20μL/g的量均匀喷洒在烟丝表面，在25℃和65％的湿度下平衡6h，制成卷烟。组织评吸评委对添加果香发酵液的卷烟进行感官综合评价。
二、结果与讨论
2.1产果香微生物的筛选
将目标烟草产地生长中的烟叶剪碎放入三角瓶中振荡培养，菌液在LB平板上涂布以分离细菌，在PDA平板上进行涂布以分离真菌(包括酵母菌)，所得微生物划线纯化并保种。本着尽量选取不同菌落形态的原则，共分离得到细菌69株和真菌57株，作为增香微生物筛选的菌种库。纯化过的菌株在平板划线过程中，通过初步的嗅觉筛选，发现有5株能产生较为明显的果香。5个菌株继续在28℃和160rpm下振荡培养36h，采用嗅香的方式进行感官评价并赋分比较。如表1所示，A1、R59、A13和B24株菌产香均较强，差异度也比较明显，其中R59的产香能力最强；综合停留时间和刺激性，R59菌株得分最高。R59菌株能够产生清甜水果香气，夹杂着一种特殊的玫瑰香味，且香气持久，杂气较轻，因此，R59菌株用于后续的产香研究和应用。酵母菌发酵产生水果型香气已被广泛报道，其他来源的酵母菌也能产生典型的水果香气。谭才邓等[6]以水果为底物筛选获得1株产香克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)，乙酸异戊酯是其发酵产物的主要香味物质。朱克永[7]从猕猴桃表皮分离得到酵母菌株发酵具有优雅水果香气和猕猴桃自然果香。汉逊酵母菌属也能发酵烟末产生甜果香。
表1产果香微生物的嗅香评分结果
2.2菌株鉴定
酵母菌的菌落形态和细胞形态观察是酵母鉴定最基本的工作。R59菌株在YPD平板培养3d，观察菌落形态及细胞形态。如图1(A)所示，R59菌株的菌落呈白色到淡粉色，较湿润，菌落边缘不规则；在100倍显微镜下观察，细胞为椭圆形，直径比一般的酵母细胞大，个别细胞正进行一端出芽生殖，部分细胞连成串，见图1(B)。R59菌株的菌落形态和细胞形态与短梗霉类似。
与26S rDNA区域相比，同种ITS DNA区域在有足够保守性的同时，不同种之间的ITS DNA变异度更高(Kurtzman et al.,2000)。在NCBI上查找一些代表种的标准菌株的ITSDNA序列。PCR扩增送测序得到R59菌株的ITS DNA序列。基于菌株的ITS DNA序列，根据NJ法构建系统发育树。如图2所示，R59菌株与短梗霉菌株(Aureobasidium melanogenum)位于进化树的同一支，亲缘关系最近，ITS DNA序列之间的相似度超过了99％。综合上述结果，将R59菌株鉴定为Aureobasidium melanogenum。
2.3香气物质成分的分析
利用液质联用对R59菌株发酵液中的香气成分进行了分析，检出了11种香气成分，包括多种酯类物质。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度都超过100μg/mL，特别是苯乙醛的浓度达到261.2μg/mL。根据化学物质的香气特征，苯乙醛具有水果的甜香气，醋酸异戊酯具有香蕉、苹果样香气，而苯乙醇具有典型的玫瑰香型香气的重要成分，并且具有增强香气的作用。这三种组分可能决定R59菌株较强果香且较为持久的原因。而其他浓度较低的成分，如3-甲基丁醛、乙酸乙酯、醋酸异戊酯、苯甲酸苯乙酯、α-紫罗酮、金合欢基丙酮、柠檬醛和乙基苯因，也具有明显而不同的香气特征，这决定了发酵液香气的丰富性。而检测到的1种成分2-甲基丙醇则有刺激性气味，对形成良好的香气有不利作用。后续可以通过原生质体融合或者诱变育种技术对菌株进行改良，以期减少2-甲基丙醇的含量，提高香气品质。苯乙醇是产香酵母中较为常见的一种香气物质，并且对香气的特征起到较大的作用。而高产苯乙醛和醋酸异戊酯的酵母菌则较少报道，在多数产香酵母中这两种物质的含量较低。以本研究筛选到的R59菌株酵母为基础，能够为构建更新更有特色的果香型香气，为后续在香烟增香的应用打下基础。
表2 R59菌株发酵产香成分分析
2.4发酵产香条件的优化
液质联用分析发现，R59菌株能产生较高浓度的苯乙醛和醋酸异戊酯，这两种物质具有典型的果香香气，并且在其他产香酵母中含量较少，是决定R59菌株产香特征的关键成分。以提高苯乙醛和醋酸异戊酯的产量为目标，研究培养基中不同的葡萄糖浓度、氮源种类、玉米浆(CSP)浓度和pH值对产香的影响，用HPLC测定两种物质的浓度，找到最合适的发酵条件，结果如图3所示。如图3a所示，随着葡萄糖浓度增加30g/L，苯乙醛的浓度也升高，葡萄糖浓度继续提升，苯乙醛浓度基本保持不变；而醋酸异戊酯在葡萄糖浓度增大到20g/L之后，浓度基本保持不变，并不随着葡萄糖浓度的增大而升高。这说明苯乙醛和醋酸异戊酯的合成途径可能有差别。有机氮源玉米浆对两种物质的生产有明显的促进作用，苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度分别达到336.4μg/mL和129.3μg/mL，见图3b。玉米浆富含氨基酸和蛋白质，磷元素和维生素的含量也很丰富，据报道能够促进多种产物的发酵合成。如图3c所示，最佳的玉米浆浓度为15g/L；如图3d所示，在pH 5.0的培养基中，苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度最大，pH过高和过低均影响香气物质的合成，这种趋势和酵母菌生长的pH特性相一致。在最佳的培养条件下，苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度分别达到348.6μg/mL和143.7μg/mL，比原始YPD培养基分别提高30％以上和10％以上。
2.5在烤烟增香中的应用评价
预实验发现，添加20μL/g以下的发酵液就能显著改善香烟的香气特征。R59菌株产香发酵液过滤后以不同的量(5-20μL/g)均匀喷洒在烟丝表面，制成卷烟后进行感官综合评价。如表3所示，添加发酵液样品的分值均高于对照，表现为发酵样品的果香气更浓更饱满，香气的协调性也有增加，余味更干净，能够显著提高抽吸品质。但发酵液添加量超过10μL/g引起杂气增多，这可能和发酵液中香气物质之外的代谢产物增多有关系。综合评吸结果，R59菌株发酵液的最佳添加量为10μL/g，可以作为一种显著提高香烟品质的香料来源。并且R59菌株产香发酵成本低，生产迅速，不需要复杂的提取步骤，有较强的实际意义。而之前的研究中，发酵所产香气物质均需单独的有机试剂萃取过程，才能用于烟草增香。与之相比，本研究具有明显的工艺简便性。
表3 R59菌株发酵液处理烟丝的感官评价结果
