一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟及其制备方法
技术领域
本发明属于无烟气烟草制品技术领域，具体涉及一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟及其制备方法。
背景技术
无烟气烟草（Smokeless Tobacco, 简称ST）制品是指不经燃烧，直接通过口腔或鼻腔吸食的烟草制品，与传统卷烟相比其有害成分少，危害性较小；同时它不产生二手烟气，能在一定程度上缓解公共场所禁烟和吸烟的矛盾，并在一定程度上满足烟民的生理需要。胶基型嚼烟，又称为新型嚼烟、胶基型无烟气烟草、烟草口香糖、胶基烟，是一种烟草和/或烟草提取物为效用组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送尼古丁的新型烟草制品。消费者在使用该类产品时，经过口腔咀嚼，包埋于胶基中的尼古丁等成分经唾液溶解后通过口腔黏膜被人体吸收。
由于这类烟草制品不像传统卷烟那样经过燃烧后由呼吸道消费烟气，而是通过口腔由消化道消费烟碱。口腔是人体最早接触食物并开始消化的器官。口腔上皮中，大多数部位并没有角化层（和皮肤相比），也没有粘液形成的粘液层（和胃肠道相比），因此口腔上皮细胞直接暴露于外界环境中，当食品药品中的部分物质对上皮细胞产生死亡时，口腔不适随之发生。研究表明口腔细胞死亡的原因之一是口腔唾液的渗透压收外界影响发生了改变。人在静息态唾液的渗透压约为50 mOsmol/L，而在摄取并咀嚼食物后，由于食物的降解以及小分子（包括盐离子、葡萄糖和氨基酸等）的释放，口腔内的渗透压会迅速升高至600-900 mOsmol/L，大约相当于人体液正常渗透压的2-3倍（正常渗透压为285-295 mOsmol/L）。消费者问卷调查表明，部分胶基型嚼烟会引起口腔不适，包括造成唇部不适，唾液量增多，口腔有刺激感等，从而影响消费者在使用产品时的口腔感受。而在使用胶基烟后，口腔内的渗透压甚至可以上升到高于2000mOsmole/L，说明渗透压的增高在其引起口腔不适中的重要作用。
麦冬，百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，根较粗，中间或近末端常膨大成椭圆形或纺锤形的小块根，茎很短，叶基生成丛，禾叶状，苞片披针形，先端渐尖，种子球形。麦冬的小块根是中药，有生津解渴、润肺止咳之效。《神农本草经》将麦冬列为养阴润肺的上品，言其“久服轻身，不老不饥”。《本草分经》称麦冬“甘、微苦，微寒。润肺清心、泻热生津、化痰止呕、治嗽行水”。现代药理研究也表明，麦冬主要含沿阶草苷、甾体皂苷、生物碱、谷甾醇、葡萄糖、氨基酸、维生素等，具有抗疲劳、清除自由基以及降血糖的作用。另外，麦冬有镇静、催眠、抗心肌缺血、抗心律失常、抗肿瘤等作用，尤其对增进老年人健康具有多方面功效。此外，麦冬还有促进胰岛细胞功能恢复、增加肝糖原、降低血糖的作用，是糖友处方中的常用品。麦冬可代茶饮。部分糖尿病患者气阴两虚，因此饮用麦冬水时，可搭配一点党参，更能起到补气的作用。但是麦冬在抵御渗透压应激引起的细胞死亡中尚无应用，也无基础研究报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟及其制备方法，该制备方法简单可靠，制得的产品能够大大改善现有的胶基型嚼烟由于产生高渗环境导致口腔上皮细胞死亡的情况，可以显著降低吸食胶基型嚼烟引起的口腔健康风险。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取麦冬粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物；
步骤（2），按照重量份数计，将10~30份胶基进行烘烤，在40~60℃，烘烤8~12h，向其中加入20~60份甜味剂、1~5份酸碱调节剂、1~5份香味剂、0.1~5份食用色素、1~5份保润剂和粉碎至>200目的烟草粉末1~10份，并加入5~50mg/g胶基的麦冬提取物；在58-62℃下混合至均匀，之后经挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
进一步，优选的是，步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，麦冬与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为10000~15000g、40分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为18~24小时。
进一步，优选的是，胶基为橡胶、酯类、石蜡、硬化油中的一种或多种的组合物；所述甜味剂为单糖、二糖、三糖、多糖、多元醇、增甜剂中的一种或多种的组合物。
进一步，优选的是，所述橡胶为明胶、苯乙烯-丁二烯橡胶、丁基橡胶或聚异丁烯橡胶；所述酯类为松香甘油酯、松香或聚醋酸乙烯酯；所述石蜡为微晶石蜡或固体食用石蜡。
进一步，优选的是，所述多元醇为甘露醇或麦芽糖醇；所述增甜剂为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、糖精或环己氨基磺酸盐。
进一步，优选的是，酸碱调节剂为碳酸氢钠和碳酸钠中的一种或两种的组合物；所述香味剂选自柠檬、薄荷、咖啡、草莓、蓝莓、菠萝、桃子、苹果、橘子、西瓜、红枣、乌梅、滇橄榄提取物中的一种或多种的组合物。
进一步，优选的是，所述食用色素为红曲、叶绿素、姜黄素、胡萝卜素、苋菜、糖色中的一种或多种的组合物；所述保润剂为丙二醇和丙三醇中的一种或两种的组合物。
本发明同时提供上述含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法制得的含有麦冬提取物的胶基型嚼烟。
本发明还提供上述麦冬提取物在制备防治由于渗透压应激引起的口腔上皮细胞死亡的药物、保健品、烟草制品中的应用。
本发明对于挤出、滚筒延压、裁切、老化的具体参数没有限制，按照现有的生产工艺即可。
优选，挤出是将混合均匀的物料冷却20至30 min，成型温度控制在20℃，相对湿度控制在40-55%。
滚筒延压控制压片厚度为2.3 ± 0.1 mm；
裁切控制裁切长度为520 ± 0.1 mm，宽度为15 ± 0.1 mm。
老化控制老化温度要求为20±2℃，相对湿度控制在40-55%，时间为24 h。
本发明首先采用胶基型嚼烟中常用的NaCl和葡萄糖（Glucose），加入无血清培养基中，测定渗透压的改变，再用不同渗透压的培养基刺激永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME，在实验中，同时设置麦冬提取物组（在高渗培养基中加入不同浓度的麦冬提取物）、空白组（培养基和MTS溶液，无细胞）、对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。刺激一段时间后用MTS试剂盒检测存活细胞。结果表明：人在品食胶基烟的时候，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高；口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡；在高渗溶液中加入麦冬提取物可以改善因为其引起的细胞死亡。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明发现人在长期吸食胶基型嚼烟时，口腔上皮细胞微环境的渗透压升高，口腔细胞暴露在高渗环境中会导致细胞死亡，在高渗溶液中加入麦冬提取物可以改善因为其引起的细胞死亡，能显著降低吸食胶基型嚼烟引起的口腔风险；通过本发明方法制得的含有麦冬提取物的胶基型嚼烟，能够大大改善现有的胶基型嚼烟由于产生高渗环境导致口腔上皮细胞死亡的情况，可以显著降低吸食胶基型嚼烟引起的口腔健康风险；
本发明为麦冬提取物直接在胶基烟使用高渗引起的口腔上皮细胞死亡保护中提供了基础。胶基烟提取物和上皮细胞孵育8小时导致50%口腔上皮细胞死亡，但是加入了1-10mg/ml的麦冬提取物可以将细胞死亡的比例降低至10%以下。
附图说明
图1为静息态口腔唾液渗透压测定结果和使用胶基烟（Nicotinell）后口腔渗透压的结果。
图2为高浓度葡萄糖和高浓度氯化钠所致高渗透压对细胞死亡作用检测结果；其中，（A）通过在培养基中加入氯化钠的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；（B）通过在培养基中加入葡萄糖的方法调高渗透压培养基，用不同渗透压的培养基处理口腔上皮细胞12小时后，用MTS测定细胞活力后计算细胞存活比例；**：t检验P<0.01
图3为添加麦冬提取物后对高渗引起的细胞死亡的干预结果；其中，A为使用高氯化钠导致的高渗培养基得到的结果，B为使用高葡萄糖导致的高渗培养基中的到的检测结果。**：t检验P<0.01
图4为添加麦冬提取物后的胶基烟对口腔上皮细胞死亡的干预结果。**：t检验P<0.01。
图5为在胶基型嚼烟中添加不同比例的麦冬提取物对其提取物影响口腔上皮细胞存活率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
以下实施例中未有特别说明，百分比均为重量百分比，比例均为质量比。
实施例1
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取麦冬粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物；
步骤（2），按照重量份数计，将10份胶基进行烘烤，在40℃，烘烤8h，向其中加入20份甜味剂、1份酸碱调节剂、1份香味剂、0.1份食用色素、1~5份保润剂和粉碎至>200目的烟草粉末1份，并加入50mg/g胶基的麦冬提取物；在58℃下混合至均匀，之后经挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
实施例2
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取麦冬粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物；
步骤（2），按照重量份数计，将10份胶基进行烘烤，在40℃，烘烤8h，向其中加入20份甜味剂、1份酸碱调节剂、1份香味剂、0.1份食用色素、1份保润剂和粉碎至>200目的烟草粉末1份，并加入5mg/g胶基的麦冬提取物；在58℃下混合至均匀，之后经挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，麦冬与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为10000~15000g、40分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为18小时。
胶基为聚异丁烯橡胶、聚醋酸乙烯酯和微晶石蜡的组合物（质量比为1：1：1）；
所述甜味剂为甘露醇和蔗糖的组合物（质量比为1：1）；
酸碱调节剂为碳酸氢钠；
所述香味剂选自柠檬、薄荷、滇橄榄提取物的组合物（质量比为1：1：1）；
所述食用色素为红曲、叶绿素和姜黄素的组合物（质量比为1：1：1）；
所述保润剂为丙二醇和丙三醇的组合物（质量比为1：1）。
实施例3
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取麦冬粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物；
步骤（2），按照重量份数计，将30份胶基进行烘烤，在60℃，烘烤12h，向其中加入60份甜味剂、5份酸碱调节剂、5份香味剂、5份食用色素、5份保润剂和粉碎至>200目的烟草粉末10份，并加入50mg/g胶基的麦冬提取物；在62℃下混合至均匀，之后经挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，麦冬与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为10000~15000g、40分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为24小时。
胶基为橡苯乙烯-丁二烯橡胶；
所述甜味剂为安赛蜜；
酸碱调节剂为碳酸氢钠；
所述香味剂选自草莓提取物；
所述食用色素为胡萝卜素；
所述保润剂为丙二醇。
实施例4
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取麦冬粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，震荡提取多次，合并提取液，4℃下离心，取上清液，上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物；
步骤（2），按照重量份数计，将20份胶基进行烘烤，在50℃，烘烤40h，向其中加入50份甜味剂、4份酸碱调节剂、2份香味剂、3份食用色素、1~5份保润剂和粉碎至>200目的烟草粉末8份，并加入20mg/g胶基的麦冬提取物；在60℃下混合至均匀，之后经挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
步骤（1）中，提取次数为3次，每次超纯水震荡提取1小时，麦冬与每次超纯水的用量比为：100g：1000ml：500ml：300ml；离心参数为10000~15000g、40分钟；冻干温度为-30℃，冻干时间为23小时。
胶基为松香甘油酯；
所述甜味剂为戊糖和阿斯巴甜的组合物（质量比为1：1）；
酸碱调节剂为碳酸钠；
所述香味剂为乌梅提取物中；
所述食用色素为姜黄素；
所述保润剂为丙三醇。
应用实例
一种含有麦冬提取物的胶基型嚼烟的制备方法，包括如下步骤：
a、麦冬提取物的制备
（1）称取麦冬100g，粉碎后，用超纯水研磨至肉眼无可见的大于直径2mm的颗粒后，分别用1000ml、500ml、300ml的超纯水震荡提取各1次，每次提取时间为1小时。
（2）合并提取液，16000 g高速冷冻离心（4℃，16000g，30分钟），留取上清液，弃沉淀。
（3）上清液冻干后保存备用，得到麦冬提取物，冻干条件为：-30℃，18小时。
b、取丁基橡胶30％、麦芽糖醇54％、丙二醇1％、甘油1%、咖啡香味剂1%、滇橄榄提取物香味剂2%、可可香料1%、叶绿素4%、碳酸钠1%、烟草超微粉末5%；取麦冬提取物10mg/g胶基；
c、先对胶基进行烘烤（50℃、10h），将物料混匀后，在60℃下搅拌60分钟后，成型挤出、滚筒延压、裁切、老化，分装即为成品。
d、人在摄食胶基型胶基烟1分钟后唾液渗透测定
（1）随机招募了身体健康的10名志愿者，志愿者基本情况如下：年龄：22-24岁；性别：男性6名，女性4名；
（2）每位志愿者在静息状态收集其唾液，16000rpm离心5min，上清用于渗透压测定。
（3）在静息态采集唾液间隔1小时后，志愿者按照说明使用胶基烟（市场常见品牌（实际上是Nicotinell）。
（4）在使用后第1分钟收集志愿者口腔内全部唾液（期间不可吞咽或者吐出唾液）。
（5）对唾液渗透压进行测定，评估无烟气烟草使用对唾液渗透压的影响。测定结果如图1所示，志愿者在静息态的唾液渗透压平均值为45.7 mOsmol/L。而在使用胶基烟后则为970.9mOsmol/L，增加了多于20倍，也是血液和其它组织液渗透压的三倍以上。
这些结果说明，在使用胶基烟时，口腔将暴露在高渗的微环境中。
以上结果见附图1。
e、高渗透压对细胞死亡作用检测
（1）细胞培养与传代：永生化的人口腔上皮细胞hTERT-OME购自Abmgood公司，并培养于含有1%胎牛血清（体积分数）（Hyclone产品）的MCDB151培养基（Sigma-Aldrich产品）的25cm2培养瓶中。细胞生长至80%融合状态后，弃培养液，用PBS洗涤一次，加入0.5-1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化液（Sigma-Aldrich产品），37℃消化1-5分钟。细胞变圆后，弃去消化液。加入含10%胎牛血清的MCDB151培养基，吹打重悬细胞，600g离心5分钟，弃上清，细胞重悬于15 ml前述含1%胎牛血清的MCDB151培养基中，按照1:3的比例传代。每2-3天换液一次，半量换液，换液的时候是换成新的含有1%胎牛血清的MCDB151培养基。
（2）利用MCDB151无血清培养基配置高渗溶液，分别使用添加氯化钠、葡萄糖的方法调整培养基中的渗透压，对细胞进行不同渗透压的培养基培养刺激，所选用的渗透压如图2所示。无血清培养基的渗透压为290 mOsmol/L，该渗透压也为生理渗透压。
（3）将处在对数生长期的hTERT-OME接种于96孔板中，每孔细胞数量为8000个，培养基体积为100 μl，采用无血清MCDB151培养基。细胞贴壁培养24小时后，更换细胞培养基为上述（2）中配制的等渗或者高渗培养基进行培养。用不同渗透压（290、435、1160 mOsmol/L）处理细胞12小时。
（4）在细胞培养终点，使用Promega的MTS试剂盒检测存活细胞，在每个细胞培养孔中加入10 μl MTS溶液，37℃孵育2小时。测定490 nm各孔的吸光值。在实验中，同时设置空白组（培养基和MTS溶液，无细胞），对照组（未经过高渗处理正常培养的细胞），每组设置三个复孔。
（5）实验结果如图2所示：在培养基中添加额外的氯化钠或葡萄糖后，细胞出现渗透压依赖的细胞死亡，4倍于生理渗透压（1160 mOsmol/L）导致大于50%的细胞死亡。
（6）按照上述同样的方法，在4倍于生理渗透压（1160 mOsmol/L）高渗培养基中额外添加1-10 mg/ml麦冬提取物（在更换为高渗培养基时同时添加），检测细胞存活率，结果如图3所示，说明麦冬提取物可以保护因高氯化钠及高葡萄糖所致高渗透压引起的细胞死亡。
f、添加麦冬提取物后对胶基烟提取物引起的细胞死亡的干预
1.用MCDB151培养基制备胶基烟提取物：取胶基烟（Nicotinell）1片，加入2 mlMCDB151培养基（预热至37℃），置于研钵中，用研磨杵挤压4次（间隔15秒挤压一次）。1min后，弃烟袋及其剩余内容物，取萃取液16000 rpm离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤备用，如不立即使用，冻存于-80℃。
2.胶基烟提取物渗透压测定：对上述1中的提取物进行渗透压测定（美国/wescor），测得渗透压为：1219±17 mOsmoL/kg。
3.按照上述e中中相同的方法检测细胞死亡，细胞刺激的培养基包括：（1）对照组：无血清MCDB151培养基；（2）麦冬提取物对照组：MCDB151培养基中添加5 mg/ml麦冬提取物；（3）胶基烟提取物刺激组：用MCDB151提取的胶基烟提取物；（4）麦冬提取物保护组：用MCDB151提取的胶基烟提取物中添加5 mg/ml麦冬提取物。培养12小时后，用MTS法检测细胞存活率。
4.实验结果如图4所示，在MCDB151培养基中添加5 mg/ml麦冬提取物对细胞存活没有影响，胶基烟提取物在刺激口腔上皮细胞12小时后，导致约50%细胞死亡，但是在胶基烟提取物中添加5 mg/ml麦冬提取物可以有效保护胶基烟提取物引起的细胞死亡。
g、在胶基烟中添加麦冬提取物对其提取物诱导口腔上皮细胞死亡的影响。
根据上述a-c中的方法制作胶基烟，在制作过程中，在胶基烟中添加0-50 mg/g麦冬提取物。根据f中的方法对胶基烟进行提取，测定其渗透压，发现在添加麦冬提取物对胶基烟提取物的渗透压没有明显影响，其渗透压均为1108±25 mOsmoL/kg。
根据上述f中的方法测定胶基烟提取物对口腔上皮细胞的存活影响，结果如图5所示，发现制作中添加麦冬的胶基烟提取液引起口腔上皮细胞死亡的比例下降。
结论：添加了麦冬提取物的胶基型嚼烟能明显降低口腔健康风险。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
