一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法
技术领域
本发明属于植物蛋白质的加工技术领域，具体地说是涉及一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物，约含有50％脂质和25％蛋白质。花生蛋白是一种富含精氨酸(约为总氨基酸的13％)的植物蛋白，精氨酸对于健康生殖、伤口愈合、人体排氨、提高免疫、调节血压、促进生长激素生成有重要作用。目前，国内有50％以上的花生是用于制油，用于制油的花生约95％采用热榨法，其余采用冷榨法和水酶法。虽然热榨法可制取香味浓郁的花生油，但是副产物——花生粕的蛋白变性严重，深加工利用价值不高，主要用做饲料和肥料。冷榨法可制取清香花生油，其副产物——冷榨花生粕利用价值较高。通过超微粉碎将冷榨花生粕加工成花生蛋白粉；在花生蛋白粉中添加一定量的水和大豆蛋白后，可通过挤压技术形成具有纤维状结构的花生组织蛋白。花生蛋白粉和组织蛋白可用于植物蛋白饮料、糖果、乳制品、火腿肠、素肉和宠物食品等产品中。水酶法可制取清香花生油和蛋白水解液，但是，蛋白水解液具有一定的苦味，目前还没有得到较好的利用。
植物蛋白纤维化技术主要有两种。第一种为上述的挤压技术，是目前的主流技术，所得纤维状结构蛋白产品被广泛用于素肉和人造肉产品的基料。但是该技术对于设备要求高，设备内部需要高温高压，存在一定的危险性，并且能耗高。第二种是利用酸水解植物蛋白生成纤维状结构的组装单元——多肽产物，它们之间发生相互作用组装成纤维状结构，在一定的蛋白浓度下，进一步形成凝胶，可用做食品加工时的增稠剂，也可用做生理活性成分和药物的载体；另外，由于其纤维状结构，具有作为植物基人造肉基料的潜力。但是该技术的酸水解条件较为剧烈：pH 1.6-2，80-90℃，并且需要较长的反应时间(MehdiMohammadian,AshkanMadadlou.Technological functionality and biologicalproperties of food protein nanofibrils formed by heating at acidiccondition.Trends in Food Science&Technology,2018,75,115-128)。因此，该技术一方面需要消耗大量的能量，另一方面上述剧烈条件可能会对原料产生一些潜在风险。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，本发明利用植物自身含有的内源性蛋白酶在温和的条件下对蛋白进行水解生成纤维状结构的组装单元——多肽产物，它们发生相互作用组装成纤维状结构，并进一步形成凝胶；本发明为花生蛋白提供一种新型和高附加值的加工方法，制备过程能耗低，不使用任何商业酶制剂和有机溶剂。
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)花生经低温浸泡、去红衣、打浆和过滤得到花生水提物；
(2)对花生水提物进行离心得到轻相(花生油体富集物)、中间相(花生水溶性蛋白、水溶性糖、少量油体)和重相(花生水不溶性蛋白、水不溶性碳水化合物、少量油体)；
(3)对中间相进行等电点沉淀，离心得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将花生乳清加入重相或蛋白沉淀或重相和蛋白沉淀的混合物中，制备得到蛋白浓度为4～20％的蛋白溶液体系；
(5)调节蛋白溶液体系的pH至3～5，在20～80℃下热处理反应3～24h，从而得到纤维化花生蛋白凝胶。调节蛋白溶液体系的pH，激活内源性蛋白酶，在热处理过程中，花生蛋白发生酶解，蛋白酶解产物相互作用形成纤维状结构，纤维化蛋白可进一步发生交错缠绕形成凝胶。
作为优选，步骤(1)具体为：花生在4～40℃浸泡0.5～18h后，去红衣，去红衣后的花生用水冲洗干净，加水磨浆，过滤得到花生水提物和花生渣。
作为优选，步骤(2)中离心转速为6000～10000rpm，离心时间为0.1～15min。
作为优选，步骤(3)为：将中间相的pH调至4～5，通过离心将其分成蛋白沉淀和花生乳清；其中，离心转速为1500～3000rpm，离心时间为3～15min。
作为优选，步骤(b)中去红衣花生与水的质量比为1：4～10，磨浆时间为0.5～3min；过滤后对花生渣进行重复磨浆0～3次，花生渣与水的质量比均为1：1～5。
作为优选，步骤(2)中离心采用的离心机为三相离心机。
作为优选，步骤(3)中离心采用的离心机为卧式螺旋离心机或管式离心机。
作为优选，调节pH的试剂为盐酸、磷酸、维生素C、柠檬汁、富马酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、乳酸中的一种或二种以上的任意组合。
为了抑制内源性蛋白酶的热失活和酸水解，作为优选，步骤(5)中热处理反应时间为4～12h，热处理反应包括前期反应和后期反应，所述前期反应温度为20～60℃，后期反应温度为20～60℃或70～80℃。
作为优选，前期反应pH为3～5，后期反应pH为3～4；后期反应温度为70～80℃时，后期反应时间不超过2h。整个热处理过程中，前后期反应的pH条件可以有变化。
本发明发现花生种子中含有内源性蛋白酶，可在酸性pH条件下被激活，可水解花生蛋白生成一些多肽产物——纤维状结构的组装单元，可相互作用形成纤维状结构，进一步发生交错缠绕形成凝胶。
本发明的制备方法与酸水解制备植物蛋白纤维化凝胶技术相比，反应条件更加温和，反应时间相当。本方法pH范围为3-5，可减少酸的用量。对于反应温度来说，整个反应过程可一直在20-60℃这个范围；也可分为前后两段反应，前期反应在20-60℃这个范围，后期在70-80℃这个范围(不超过2h，蛋白浓度越大，时间越短；其主要目的是为了促进前期反应生成的多肽之间的相互作用)，可大大减少热能的消耗。相反，酸水解技术则需要较为剧烈的反应条件：pH 1.6-2和80-90℃(具体可参见Mehdi Mohammadian,AshkanMadadlou.Technological functionality and biological properties of foodprotein nanofibrils formed by heating at acidic condition.Trends in FoodScience&Technology,2018,75,115-128)。这是由两种方法的基本原理所决定的，本方法是利用内源性蛋白酶，其必须在比较温和条件下才能发挥较佳的水解作用，生成足量的纤维状结构的组装单元——多肽；而酸水解制备植物蛋白纤维化凝胶技术则必须在上述剧烈的条件下进行，以生成足量的纤维状结构的组装单元——多肽。
本发明的有益效果在于：
本发明在制备纤维状植物蛋白时，利用内源性蛋白酶对花生蛋白进行水解，而不使用条件剧烈的酸水解；在脱除花生水提物中的脂质时，采用的是物理法(离心)，而不使用有机溶剂；因此，本方法可降低加工时的能源消耗，更加绿色环保；所得纤维化花生蛋白凝胶(纤维状植物蛋白凝胶)可用做食品加工时的增稠剂，也可用做生理活性成分或药物的载体；由于其纤维状结构，具有用做植物基人造肉基料的巨大潜力；本发明具有重要的环保、大健康和经济意义。
附图说明
图1是本发明实施例1中凝胶的透射电子显微镜图；
图2是本发明pH对中间相中内源性蛋白酶水解花生蛋白影响的电泳图；
图3是本发明pH对重相中内源性蛋白酶水解花生蛋白影响的电泳图；
图4是本发明天冬氨酸蛋白酶抑制剂对中间相中内源性蛋白酶水解花生蛋白影响的电泳图；
图5是本发明不同时间对凝胶粘度的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并不限于此。
实施例1
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)100g花生在室温下浸泡4h，去红衣，去红衣花生清洗，加入900g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物和花生渣；
(2)对花生水提物进行离心，在6500rpm离心10min，得到轻相、中间相和重相；中间相的蛋白含量为2.2％(w/w)，重相的蛋白含量为21.7％(w/w)；
(3)中间相用盐酸调节pH至4.5，离心(3000rpm，3min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将花生乳清和蛋白沉淀混合制取蛋白浓度为10％的蛋白溶液体系；
(5)用盐酸调节蛋白溶液体系的pH至3，激活内源性蛋白酶，在50℃下热处理反应6h，从而得到纤维化花生蛋白凝胶。在热处理过程中，花生蛋白发生酶解，蛋白酶解产物相互作用形成纤维状结构，纤维化蛋白可进一步发生交错缠绕形成凝胶。
凝胶的透射电子显微镜图如图1所示，可以看出，凝胶的微结构是直径小于10nm，长度大于1μm的纤维状结构，即多肽产物组装成了直径小于10nm，长度大于1μm的纤维状结构。
实施例2
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)100g花生在4℃下浸泡18h，去红衣，去红衣花生清洗，加入500g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物和花生渣；
(2)对花生水提物进行离心，在7500rpm离心7min，得到轻相、中间相和重相；
(3)中间相用盐酸调节pH至4.5，离心(3000rpm，3min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将花生乳清和重相混合制取蛋白浓度为5％的蛋白溶液体系；
(5)用盐酸调节蛋白溶液体系的pH至4，40℃水浴中热处理反应5h；再将pH调至3，40℃水浴中反应5h后即可形成纤维化花生蛋白凝胶。
实施例3
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)50g花生在30℃下浸泡3h，去红衣，去红衣花生清洗，加入300g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物I和花生渣I；花生渣I中加入150g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物II和花生渣II；将水提物I和水提物II合并得到；
(2)对水提物III进行离心，在8000rpm离心5min，得到轻相、中间相和重相；
(3)用维生素C将中间相pH调至5，离心(2000rpm，5min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将重相和蛋白沉淀混合，添加一定量的花生乳清使得蛋白浓度为8％，100rpm下搅拌30min，使蛋白溶液体系均匀；
(5)用苹果酸将反应体系pH调至4，在40℃水浴中热处理反应2h；利用磷酸将反应体系pH调至3，在50℃水浴中热处理反应6h后，即可得纤维化花生蛋白凝胶。
实施例4
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)200g花生在35℃下浸泡1.5h，去红衣，去红衣花生清洗，加入800g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物I和花生渣I；花生渣I中加入400g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物II和花生渣II；在花生渣II加入400g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物III和花生渣III；将水提物I、水提物II和水提物III合并得到水提物；
(2)对水提物IV进行离心，在9600rpm，1min条件下，离心得到轻相，中间相和重相；
(3)用柠檬汁将中间相pH调至4.5，离心(2000rpm，5min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将重相和一定量的花生乳清混合，使得蛋白浓度为12％，200rpm搅拌30min；
(5)利用维生素C将体系pH调至4，在50℃水浴中热处理反应3h；利用2M盐酸将体系pH调至3，在60℃水浴中热处理反应3h后即可得纤维化花生蛋白凝胶。
实施例5
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)200g花生在35℃下浸泡1.5h，去红衣，去红衣花生清洗，加入800g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物I和花生渣I；花生渣I中加入400g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物II和花生渣II；在花生渣II加入400g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物III和花生渣III；将水提物I、水提物II和水提物III合并得到水提物；
(2)对水提物IV进行离心，在9600rpm，1min条件下，离心得到轻相，中间相和重相；
(3)用柠檬汁将中间相pH调至4.5，离心(2000rpm，5min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将蛋白沉淀和一定量的花生乳清混合，使得蛋白浓度为15％，150rpm搅拌15min；
(5)用维生素C将体系pH调至4，在50℃水浴中热处理反应2h；利用2M磷酸将体系pH调至3，在70℃水浴中热处理反应2h后即可得纤维化花生蛋白凝胶。
实施例6
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)100g花生在室温下浸泡6h，去红衣，去红衣花生清洗，加入400g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物I和花生渣I；花生渣I中加入200g去离子水，磨浆20s，过滤得到花生水提物II和花生渣II；在花生渣II加入100g去离子水，磨浆20s，过滤得到花生水提物III和花生渣III；将水提物I、水提物II和水提物III合并得到水提物IV；
(2)对水提物IV进行离心，在9000rpm，3min条件下，离心得到轻相，中间相和重相；
(3)用盐酸将中间相pH调至5，离心(2000rpm，5min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将重相、蛋白沉淀和一定量的花生乳清混合，使得蛋白浓度为6％，200rpm搅拌30min；
(5)用盐酸将体系pH调至3后，在50℃水浴中热处理反应8h后，再在80℃水浴中热处理反应1h即得纤维化花生蛋白凝胶。
实施例7
一种利用内源性蛋白酶制备纤维化花生蛋白凝胶的方法，包括下述步骤：
(1)100g花生在室温下浸泡6h，去红衣，去红衣花生清洗，加入400g去离子水，磨浆2min，过滤得到花生水提物I和花生渣I；花生渣I中加入300g去离子水，磨浆30s，过滤得到花生水提物II和花生渣II；将水提物I和水提物II合并得到水提物III；
(2)对水提物III进行离心，在9000rpm，3min条件下，离心得到轻相，中间相和重相；
(3)用磷酸将中间相pH调至4，离心(2000rpm，5min)得到蛋白沉淀和花生乳清；
(4)将蛋白沉淀和一定量的花生乳清混合，使得蛋白浓度为18％，100rpm搅拌30min；
(5)用维生素C将体系pH调至4后，在35℃水浴中热处理反应4h后，用磷酸将pH调至3，在70℃水浴中热处理反应2h即得纤维化花生蛋白凝胶。
实施例8
pH对中间相和重相中内源性蛋白酶水解花生蛋白的影响
中间相和重相的制备参照实施例1，利用LC-MS/MS检测中间相和重相中的内源性蛋白酶，具体结果如表1所示。
表1中间相和重相中的花生内源性蛋白酶
注：√表示LC-MS/MS检测到了该种酶；X表示LC-MS/MS没有检测到该种酶；
aNCBI数据库登录号。
结果显示，中间相中检测到3种天冬氨酸蛋白酶，1种丝氨酸蛋白酶和1种巯基蛋白酶；重相中检测到5种天冬氨酸蛋白酶，3种丝氨酸蛋白酶和2种巯基蛋白酶。
将中间相分成10份，利用盐酸或氢氧化钠溶液将它们的pH调至2、3、4、5、6、7、8、9和10，其中1份作为对照。在50℃水浴锅中反应6h后，取样，进行Tricine-SDS-PAGE分析，pH对中间相中内源性蛋白酶水解花生蛋白的影响结果如图2所示，泳道1是对照样品，泳道2～10分别对应pH 2、3、4、5、6、7、8、9和10；结果显示，花生蛋白(66kDa、42kDa和21kDa)在pH 3时发生最明显的水解，其次是pH 2和pH 4，pH 5时也发生一定程度的水解；pH 6～10几乎不水解。其中，pH 3时，生成了分子量约为33kDa、20kDa、13.5kDa、12kDa和6kDa等多肽产物。
将重相用去离子水稀释10倍，分成10份；利用盐酸或氢氧化钠溶液将它们的pH调至2、3、4、5、6、7、8、9和10，其中1份作为对照。在50℃水浴锅中反应6h后，取样，进行Tricine-SDS-PAGE分析，pH对重相中内源性蛋白酶水解花生蛋白的影响结果如图3所示，泳道1是对照样品，泳道2～10分别对应pH 2、3、4、5、6、7、8、9和10；结果显示，花生蛋白在pH 4时发生最明显的水解，其次是pH 2和pH 3，pH 5时也发生一定程度的水解；pH 6～10几乎不水解。其中，pH 4时，明显的多肽产物约为40kDa。
本发明发现花生中含有内源性蛋白酶，可在酸性pH条件下被激活，可水解花生蛋白生成一些多肽产物——纤维状结构的组装单元，可相互作用形成纤维状结构，进一步发生交错缠绕形成凝胶。
实施例9
天冬氨酸蛋白酶抑制剂对中间相中内源性蛋白酶水解花生蛋白的影响
中间相的制备参照实施例1，在pH 3和50℃条件下，考察了天冬氨酸蛋白酶抑制剂(5mMpepstatin A)对中间相中内源性蛋白酶水解花生蛋白的影响，结果如图4所示，泳道1～3未加抑制剂，泳道1反应0h，泳道2反应3h，泳道3反应6h；泳道1*～3*添加抑制剂，泳道1*反应0h，泳道2*反应3h，泳道3*反应6h。结果显示，花生蛋白水解被显著抑制，说明天冬氨酸蛋白酶在pH 3时水解活性很强。
实施例10
天冬氨酸蛋白酶抑制剂对蛋白溶液体系的影响
蛋白浓度为10％的蛋白溶液体系的制备参照实施例1，将蛋白溶液分成2份，一份添加5mMpepstatin A，另一份不添加。在pH 3和50℃下反应6h，结果显示，添加抑制剂的体系依然是液体，而不添加抑制剂的体系形成了透明凝胶。分析二者的粘度发现，添加抑制剂的体系粘度只有非常微弱的增大，说明其未形成纤维状结构(纤维状结构将导致粘度急剧增大)；而未添加抑制剂的体系粘度急剧增大，多肽产物组装成了直径小于10nm，长度大于1μm的纤维状结构。上述结果说明，内源性蛋白酶水解花生蛋白生成多肽产物对于纤维状结构形成的重要性。
实施例11
pH对凝胶形成的影响
按照实施例1的方法制备得到花生水提物的轻相、中间相和重相；用盐酸将中间相的pH调至5，离心(1500rpm，15min)得到蛋白沉淀和花生乳清；将蛋白沉淀与一定量的花生乳清混合，制备得到蛋白浓度为5％的蛋白溶液体系，将其分成6等份；利用盐酸和氢氧化钠溶液将它们的pH分别调至2、3、3.5、4、5、6，在50℃水浴中反应10h；pH 3条件下可形成凝胶，pH 3.5条件下体系变成粘稠的液体状，pH 2、4、5和6条件下依然是液体状态，粘度变化不大。
实施例12
蛋白浓度对凝胶形成的影响
按照实施例11的方法制备得到蛋白沉淀和花生乳清，将蛋白沉淀与一定量的花生乳清混合，制备得到蛋白浓度为1％、2％、3％和4％的4种蛋白溶液体系；利用盐酸将它们的pH均调至3，在50℃水浴中反应10h；4％蛋白溶液体系可形成成块的凝胶，3％蛋白溶液体系变成粘稠的流体状，2％和1％蛋白溶液体系依然是液体状态。
实施例13
热处理反应时间对凝胶形成的影响
按照实施例11的方法制备得到蛋白沉淀和花生乳清，将蛋白沉淀与一定量的花生乳清混合，制备得到蛋白浓度为5％的蛋白溶液体系；利用盐酸将体系pH调至3后，分成4等份；在60℃水浴中分别热处理反应6h、12h、24h、48h，它们都形成了凝胶，随时间延长而凝胶强度增大、粘度增大(pH 3和60℃条件下反应6h、12h、24h和48h后形成的凝胶粘度结果如图5所示)。但是，随着时间延长，凝胶慢慢变褐，尤其是48h，导致凝胶的外观品质变差。因此，综合考虑凝胶时间宜控制在24h以内。
本发明所得凝胶，在一定蛋白浓度范围内，蛋白浓度越大，形成凝胶的强度越大，所需时间越短；反应时间越长，形成凝胶的强度也越大。可根据具体用途，选择最适的凝胶条件。
最后需要说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
