来源于摩根氏菌属细菌的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及来源于摩根氏菌属细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及通过使用来源于摩根氏菌属细菌的纳米囊泡来诊断诸如胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和淋巴瘤之类的恶性疾病，诸如心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛和中风之类的心血管疾病，糖尿病和帕金森氏病的方法，以及包括所述囊泡的用于预防或治疗所述疾病或炎性疾病的组合物。
背景技术
自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物群落之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性病已经改变疾病模式，成为决定生活质量和人类寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性疾病，癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、代谢性疾病、炎性疾病和神经精神疾病已成为国家公共卫生的重要问题，成为决定人类寿命和生活质量的主要疾病。
炎症是一种针对细胞或组织的损伤或感染的局部或全身保护机制，通常是由因为构成免疫系统的体液介质直接对该损伤或感染做出反应或者刺激局部或全身效应器系统而发生的一系列生物反应所引起。主要的炎性疾病的例子包括消化系统疾病，例如胃炎和炎性肠炎；口腔疾病，例如牙周炎；呼吸道疾病，例如哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)和鼻炎；关节炎，例如退行性关节炎和类风湿性关节炎；以及代谢性疾病，例如肥胖，糖尿病和肝硬化。此外，各种研究报告说持续的炎症可能导致癌症。
众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息地中的细菌，古细菌和真核生物。
我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、低分子化合物、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。
局部分泌的细菌来源的囊泡不仅通过粘膜上皮细胞或皮肤角质细胞吸收以诱导局部炎症反应，而且被吸收到我们体内以分布到各个器官，并调节吸收囊泡的器官中的免疫和炎症反应。例如，来源于致病性革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的囊泡在被血管吸收后，会通过血管内皮细胞的炎症反应而促进全身性炎症反应和血液凝固，并且还被吸收到肌肉细胞中，在该细胞中胰岛素发挥作用导致胰岛素抵抗和糖尿病。相比之下，来源于有益细菌的囊泡可通过调节由病原性囊泡引起的免疫功能和代谢功能障碍来调节疾病(ChoiYW等人，Gut microbe-derived extracellular vesicles induce insulin resistance,thereby impairing glucose metabolism in skeletal muscle.Scientific Reports,2015.)。
对诸如细菌来源的囊泡之类的因子的免疫应答是Th17免疫应答，其特征在于分泌IL-17细胞因子，当其暴露于细菌来源的囊泡时IL-6就会分泌，从而诱导Th17免疫应答。由Th17免疫反应引起的炎症的特征在于嗜中性粒细胞的浸润和TNF-α，TNF-α从炎性细胞(例如巨噬细胞)分泌并在炎症发生过程中起重要作用。
摩根氏菌属细菌是厌氧革兰氏阴性棒状细菌，被认为是人类和动物肠道中共存的细菌。在这些细菌中，摩氏摩根菌(Morganella morganii)被认为是引起手术后感染，尿路感染等的致病菌。但是，迄今尚未报道过摩根氏菌属细菌从细胞中分泌囊泡的事实，特别是没有报道将囊泡用于诊断和治疗癌症、心血管疾病、代谢性疾病、炎性疾病和神经精神疾病的情况。
因此，在本发明中，通过证实了与正常人相比，在患有癌症、心血管疾病、代谢疾病、炎性疾病和神经精神疾病的患者的临床样品中的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少，可以诊断出疾病。此外，通过从摩氏摩根菌中分离囊泡并分析其特性的结果，证实了所述囊泡可用作预防或治疗恶性疾病、心血管疾病、代谢疾病、炎性疾病、和神经精神疾病的组合物。
发明内容
【技术问题】
通过解决上述传统问题的深入研究的结果，本发明人证实，通过宏基因组学分析，在患有诸如胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌，前列腺癌和淋巴瘤之类的恶性疾病，诸如心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛和中风之类的心血管疾病，糖尿病和帕金森氏病的患者的临床样品中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的含量与正常人相比显著降低。另外，证实了当从属于摩根氏菌属的摩氏摩根菌中分离出囊泡并且用该囊泡处理巨噬细胞时，由病原性囊泡引起的TNF-α的分泌被显著抑制，从而基于此发现完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种用于提供用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的信息的方法。
此外，本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病或炎性疾病的组合物，其包括作为活性成分的来源于摩根氏菌属的囊泡。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种用于提供用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常人和受试者的样品的囊泡中提取DNA；
(b)通过使用基于提取的DNA的16S rDNA中存在的基因序列构建的引物对进行PCR来获得每种PCR产物；和
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡含量低于正常人的情况为胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病。
另外，本发明提供了用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常人和受试者的样品的囊泡中提取DNA；
(b)通过使用基于提取的DNA的16S rDNA中存在的基因序列构建的引物对进行PCR来获得每种PCR产物；和
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡含量低于正常人的情况为胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病。
作为本发明的另一个示例性实施方式，步骤(a)中的样品可以是血液、尿液或粪便。
作为本发明的另一个示例性实施方式，步骤(b)中的引物对可以是SEQ ID No.1和2的引物。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡。
另外，本发明提供了用于预防或减轻选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的食品组合物，其包括作为活性成分的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡。
此外，本发明提供了用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的方法，该方法包括以下步骤：将包含作为活性成分的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的药物组合物施用于受试者。
此外，本发明提供了衍生自摩根氏菌属细菌的囊泡用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的用途。
作为本发明的示例性实施方式，炎性疾病可以是选自由以下疾病组成的群组的一或多种疾病：特应性皮炎，痤疮，牛皮癣，鼻窦炎，鼻炎，结膜炎，哮喘，皮炎，炎性胶原血管病，肾小球肾炎，脑炎，炎性肠炎，慢性阻塞性肺疾病，败血症，败血性休克，肺纤维化，未分化的脊椎关节炎，未分化的关节病，关节炎，炎性骨溶解，由病毒性或细菌性炎症引起的慢性炎症性疾病，结肠炎，溃疡性结肠炎，炎性肠病，关节炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，骨关节炎，硬皮症，骨质疏松症，动脉粥样硬化症，心肌炎，心内膜炎，心包炎，囊性纤维化，桥本氏甲状腺炎，格雷夫斯病(Grave’s disease)，麻风病，梅毒，莱姆病(Lyme disease)，莱姆疏螺旋体病(borreliosis)，神经性莱姆疏螺旋体病(neuro-borreliosis)，肺结核，结节病，狼疮(lupus)，冻疮样狼疮(chilblain lupus)，结核性狼疮(tuberculosis lupus)，狼疮性肾炎(lupus nephritis)，系统性红斑狼疮，黄斑变性，葡萄膜炎，肠易激综合征，克罗恩病(Crohn's disease)，干燥综合征(Sjogren syndrome)，纤维肌痛，慢性疲劳综合征，慢性疲劳免疫功能障碍综合征，肌痛性脑脊髓炎(myalgic encephalomyelitis)，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏病和多发性硬化症。
作为本发明的另一个示例性实施方式，炎性疾病可以是由IL-6或TNF-α介导的疾病。
作为本发明的又一示例性实施方式，囊泡可具有10至200nm的平均直径。
作为本发明的另一个示例性实施方式，囊泡可以从摩根氏菌属细菌中天然或人工地分泌。
作为本发明的另一个示例性实施方式，来源于摩根氏菌属细菌的囊泡可以从摩氏摩根菌中分泌。
【有益效果】
本发明人证实肠细菌没有被吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡通过上皮细胞被吸收到体内，全身地分布，并通过肾脏、肝脏和肺从体内排泄，以及证实了通过宏基因组学分析来源于患者的血液、尿液、粪便等中存在的细菌的囊泡，来源于患有胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病和帕金森氏病的患者的血液、尿液或粪便中存在的摩根氏菌属细菌的囊泡与在正常人中的相比显著减少。
此外，观察到，当通过体外培养摩氏摩根菌(摩根氏菌属的一个物种(species))分离囊泡并体外施用至炎性细胞时，显著抑制病原性囊泡分泌炎症介质并且抑制癌症动物模型中癌症的发生，因此预期根据本发明的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡可有效地适用于用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病和帕金森氏病的方法，以及适用于用于预防或治疗所述疾病或炎性疾病的组合物，例如抗所述疾病或炎性疾病的食品或药物。
附图说明
图1A是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(EV)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(EV)的分布模式的一系列照片，并且图1B是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。
图2A至图2C是在对来源于胃癌患者和正常人的粪便(2A)、血液(2B)和尿液(2C)中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图3是在对来源于结直肠癌患者和正常人的尿液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图4是在对来源于胰腺癌患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属的囊泡的分布的结果。
图5是在对来源于胆管癌患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图6是在对来源于乳腺癌患者和正常人的尿液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图7A和7B是在对来源于卵巢癌患者和正常人的血液(7A)和尿液(7B)中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图8A和8B是在对来源于膀胱癌患者和正常人的血液(8A)和尿液(8B)中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图9是在对来源于前列腺癌患者和正常人的尿液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图10是在对来源于淋巴瘤患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图11是在对来源于心肌梗塞患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图12是在对来源于患有扩张型心肌病的患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图13是在对来源于患有心房颤动的患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图14是在对来源于患有变异型心绞痛的患者和正常人的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图15是在对来源于中风患者和正常人的血液中存在的细菌来源的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图16A和16B是在对来源于糖尿病患者和正常人的血液(16A)和尿液(16B)中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析之后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图17是在对来源于帕金森氏病患者和正常人的尿液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组学分析后，比较来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布的结果。
图18是通过用来源于摩氏摩根菌的囊泡处理巨噬细胞来评估来源于摩氏摩根菌的囊泡的凋亡效应的结果，以评估来源于摩氏摩根菌的囊泡的凋亡效应。
图19A和19B是通过在处理作为病原性囊泡的大肠杆菌囊泡之前，对来源于摩氏摩根菌的囊泡预处理来评估大肠杆菌囊泡(E.coli EV)对炎症介质IL-6(19A)和TNF-α(19B)分泌的影响的结果，以评估来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用。
图20是通过在处理作为病原性囊泡的大肠杆菌囊泡(E.coli EV)之前，对来源于从不同的人分离的摩氏摩根菌(MMR101，MMR201)的囊泡进行预处理来评估对大肠杆菌囊泡分泌TNF-α的影响的结果，以比较来源于不同菌株的囊泡对来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用的影响(NC：阴性对照；PC：阳性对照；L.plantarum：植物乳杆菌)。
图21是通过在处理作为病原性囊泡的大肠杆菌囊泡(E.coli EV)之前通过对来源于用加热或酸处理过的摩氏摩根菌(MMR101，MMR201)的囊泡进行预处理来评估大肠杆菌囊泡对TNF-α分泌的影响的结果，以评估加热或酸处理对来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用的影响(NC：阴性对照；PC：阳性对照；L.plantarum：植物乳杆菌)。
图22是将来源于摩氏摩根菌的囊泡施用于小鼠的方案，以评估来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗癌功效。
图23是通过腹膜内(IP)或口服(PO)施用摩氏摩根菌囊泡来评估癌细胞对肿瘤发生的影响的结果，以评估来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗癌功效。
具体实施方式
本发明涉及来源于摩根氏菌属细菌的囊泡及其用途。
本发明人证实了，通过宏基因组学分析，在来自患有胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病和帕金森氏病的患者的样品中，来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的含量与正常人相比显著降低，从而基于此完成本发明。
因此，本发明提供了用于提供用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常人和受试者的样品的囊泡中提取DNA；
(b)通过使用基于提取的DNA的16S rDNA中存在的基因序列构建的引物对进行PCR来获得每种PCR产物；和
(c)通过定量分析所述PCR产物，确定其中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡含量低于正常人的情况为胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病。
如本文所用，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病以及帕金森氏病是否发生，疾病的程度等。
如本文所用，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。
来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(OMV)不仅具有内毒素(脂多糖)，而且具有毒性蛋白和细菌DNA和RNA，以及来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸之外还具有肽聚糖和脂磷壁酸，它们是细菌的细胞壁成分。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由摩根氏菌属细菌天然分泌的或人工产生的，呈球形，平均直径为10至200nm。
可通过使用选自由离心、超高速离心、高压处理、挤压、超声处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械分解、化学处理、过滤器过滤、凝胶过滤色谱法、自由流动电泳和毛细管电泳组成的群组的一种或多种方法从包括摩根氏菌属细菌的培养溶液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和浓缩所获得的囊泡的方法。
如本文所用，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是一个从形成一个完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是一种技术的目标，该技术通过一种快速序列分析方法，通过分析所有DNA和RNA来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢，而与物种无关。
在本发明中，步骤(a)中的样品可以是血液、尿液或粪便，但不限于此。
在本发明中，步骤(b)中的引物对可以是SEQ ID No.1和2的引物。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或减轻选自由胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病、帕金森氏病和炎性疾病组成的群组的一种或多种疾病的食品组合物，其包括作为活性成分的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡。
在本发明中，炎性疾病可以是选自由以下疾病组成的群组的一种或多种疾病：特应性皮炎，痤疮，牛皮癣，鼻窦炎，鼻炎，结膜炎，哮喘，皮炎，炎性胶原血管病，肾小球肾炎，脑炎，炎性肠炎，慢性阻塞性肺疾病，败血症，败血性休克，肺纤维化，未分化的脊椎关节炎，未分化的关节病，关节炎，炎性骨溶解，由病毒性或细菌性炎症引起的慢性炎症性疾病，结肠炎，溃疡性结肠炎，炎性肠病，关节炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，骨关节炎，硬皮症，骨质疏松症，动脉粥样硬化症，心肌炎，心内膜炎，心包炎，囊性纤维化，桥本氏甲状腺炎，格雷夫斯病(Grave’s disease)，麻风病，梅毒，莱姆病(Lyme disease)，莱姆疏螺旋体病(borreliosis)，神经性莱姆疏螺旋体病(neuro-borreliosis)，肺结核，结节病，狼疮(lupus)，冻疮样狼疮(chilblain lupus)，结核性狼疮(tuberculosis lupus)，狼疮性肾炎(lupus nephritis)，系统性红斑狼疮，黄斑变性，葡萄膜炎，肠易激综合征，克罗恩病(Crohn's disease)，干燥综合征(Sjogren syndrome)，纤维肌痛，慢性疲劳综合征，慢性疲劳免疫功能障碍综合征，肌痛性脑脊髓炎(myalgic encephalomyelitis)，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏病和多发性硬化症，但不限于此。
在本发明中，炎性疾病可以是由白介素6(IL-6)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的疾病，但不限于此。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的食品组合物或药物组合物来抑制癌症、炎性疾病、心血管疾病、代谢性疾病或神经精神疾病或延迟其发作的所有作用。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的食品组合物或药物组合物来减轻或有益地改变癌症、炎性疾病、心血管疾病、代谢疾病或神经精神疾病的症状或延迟其发作的所有作用。
如本文所用，术语“缓解”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有动作。
在本发明的示例性实施方式中，证实了通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡以评估细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，细菌不通过肠粘膜吸收，而囊泡在5分钟内被吸收，全身分布并通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。
在本发明的另一个示例性实施方式中，通过使用从正常人的血液、尿液或粪便中分离的囊泡进行细菌宏基因组学分析，所述正常人的年龄和性别与患有胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的患者匹配。结果证实，与正常人的样品相比，在患有胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病或帕金森氏病的患者的样品中，来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见实施例3至15)。
在本发明的另一个示例性实施方式中，在用不同浓度(0.1、1、10μg/ml)的来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡处理作为小鼠巨噬细胞的Raw 264.7细胞后，评估细胞凋亡的程度，以评估来源于摩氏摩根菌的囊泡(M.morganii EV)在炎性细胞中的凋亡作用，已证实在用来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡处理期间未观察到凋亡(参见实施例17)。
在本发明的又一个示例性实施方式中，作为基于实施例中的结果进一步研究以分析来源于属于摩根氏菌属的摩氏摩根菌物种的囊泡的特性的结果，培养了摩氏摩根菌菌株并评价从该菌株分泌的囊泡是否表现出抗炎作用，以及作为通过在用来源于摩氏摩根菌的囊泡处理巨噬细胞之后用来源于大肠杆菌的囊泡(其是致病因素)处理所述巨噬细胞来评估炎症介质的分泌的结果，证实了来源于摩氏摩根菌的囊泡有效地抑制了来源于大肠杆菌的囊泡分泌IL-6和TNF-α(参见实施例18)。
在本发明的又一个示例性实施方式中，作为通过在用来源于大肠杆菌的囊泡依次处理巨噬细胞之前施用经热处理或酸处理的囊泡来评估热处理或酸处理对TNF-α分泌的影响以评价热处理或酸处理对来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用的影响的结果，证实了来源于摩氏摩根菌的囊泡抑制TNF-α分泌的作用没有改变(参见实施例19)。
在本发明的另一个实施方式中，培养摩氏摩根菌菌株，并评估从该菌株分泌的囊泡是否表现出抗癌治疗作用。为此目的，通过皮下注射癌细胞系产生癌症模型，并作为在从用癌细胞系处理前4天开始口服或腹膜内施用来源于摩氏摩根菌的囊泡后20天测量癌组织的大小的结果，证实与对照组相比，当腹膜内和口服施用囊泡时，癌组织的大小减小，特别是当口服施用囊泡时，癌组织的大小明显减小(参见实施例20)。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’sliterature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。
本发明的药物组合物可以根据目标方法口服施用或可胃肠外施用(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内施用)，并且施用剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式以及给药途径和周期而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括以下的因素确定：患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物，以及其他医学领域众所周知的因素。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且通常是每1千克体重施用0.001至150mg该组合物，优选每1千克体重施用0.01至100mg该组合物，可以每天或隔天给药，或者每天给药一次至三次。然而，由于有效量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少，因此给药剂量并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。
然而，为出于健康和卫生目的或为了健康控制目的而长期摄入，该量可以小于上述范围。
除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，像典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例
实施例1.肠道细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠道细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行实验。将50μg剂量的小鼠胃中的带有荧光标记的每种肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡施用至胃肠道，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1A所示，细菌不通过肠粘膜被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后30分钟在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时(参见图1A)。
为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药12小时后收集血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1B所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪和肌肉中，但是细菌没有被吸收(参见图1B)。
实施例2.临床样品中来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
首先将临床样品(例如血液、尿液或粪便)放入10ml试管中，通过离心(3,500xg，10分钟，4℃)使悬浮物沉降，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到Centriprep管(离心过滤器50kD)中，并在1,500xg和4℃下离心15分钟，弃去小于50kD的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90Ti型转子在150,000xg和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(PBS)中。
通过将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将DNA在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用Nanodrop定量DNA的量。此后，为了确认提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。
[表格1]
使用16S rDNA引物对通过上述方法提取的DNA进行扩增，然后进行测序(IlluminaMiSeq测序仪)，结果以标准流程图格式(SFF)文件输出，将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和使用GS FLX软件(v2.9)的核苷酸质量评分文件，然后确认读段的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(Phred分数<20)已删除。对于操作分类单元(OTU)分析，通过使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个OUT的门、纲、目、科和属水平上进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes(QIIME)的16S RNA序列数据库(108,453个序列)对在该属水平上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析(profiled)。
实施例3.来源于胃癌患者的粪便、血液和尿细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从粪便中存在的囊泡中提取基因，对来自63名胃癌患者和126名年龄和性别相匹配的正常人的粪便进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的粪便相比，胃癌患者的粪便中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表2和图2A)。
[表2]
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对66名胃癌患者和198名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，胃癌患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表3和图2B)。
[表3]
此外，通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自61名胃癌患者和120名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估了来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，胃癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表4和图2C)。
[表4]
实施例4.来源于结直肠癌患者的尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2中的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自38名结直肠癌患者和38名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析之后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，结直肠癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表5和图3)。
[表5]
实施例5.来源于胰腺癌患者的血细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自176名胰腺癌患者和271名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，胰腺癌患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表6和图4)。
[表6]
实施例6.来源于胆管癌患者的血细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自79名胆管癌患者和259名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，胆管癌患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表7和图5)。
[表7]
实施例7.来源于乳腺癌患者的尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自127名乳腺癌患者和220名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，乳腺癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表8和图6)。
[表8]
实施例8.来源于卵巢癌患者的血液和尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2中的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自137名卵巢癌患者和139名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，卵巢癌患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表9和图7A)。
[表9]
此外，通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自136名卵巢癌患者和136名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，卵巢癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表10和图7B)。
[表10]
实施例9.来源于膀胱癌患者的血液和尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自96名膀胱癌患者和184名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，膀胱癌患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表11和图8A)。
[表11]
此外，通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自95名膀胱癌患者和157名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，膀胱癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表12和图8B)。
[表12]
实施例10.来源于前列腺癌患者的尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自53名乳腺癌患者和159名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，前列腺癌患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表13和图9)。
[表13]
实施例11.来源于淋巴瘤患者的血液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自63名淋巴瘤患者和53名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，淋巴瘤患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表14和图10)。
[表14]
实施例12.来源于患有心脏病的患者的血液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2中的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自57名心肌梗塞患者和163名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，心肌梗塞患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡明显减少(参见表15和图11)。
[表15]
此外，通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自72名扩张型心肌病患者和163名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，与正常人的血液相比，证实了扩张型心肌病患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表16和图12)。
[表16]
此外，通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自32名心房颤动患者和32名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，确认了与正常人的血液相比，心房颤动患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表17和图13)。
[表17]
此外，通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自80名患有变异型心绞痛的患者和80名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，患有变异型心绞痛的患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表18和图14)。
[表18]
实施例13.来源于中风患者的血液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自115名中风患者和109名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，中风患者的血液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表19和图15)。
[表19]
实施例14.来源于糖尿病患者的血液和尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2中的方法从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自73名糖尿病患者和146名年龄和性别相匹配的正常人的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的血液相比，来自糖尿病患者的血液中的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表20和图16A)。
[表20]
此外，通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对60名糖尿病患者和134名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，糖尿病患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表21和图16B)。
[表21]
实施例15.来源于帕金森氏病患者的尿液细菌的囊泡的宏基因组学分析
通过实施例2的方法从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自39名帕金森氏病患者和79名年龄和性别相匹配的正常人的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于摩根氏菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与正常人的尿液相比，帕金森氏病患者的尿液中来源于摩根氏菌属细菌的囊泡显著减少(参见表22和图17)。
[表22]
实施例16.从摩氏摩根菌培养液中分离囊泡
根据实施例，将来自韩国微生物培养中心(KCCM)的一种标准菌株(MMR101)和分离自人的两种分离的菌株(MMR201、MMR202)培养成摩氏摩根菌(M.morganii)菌株，然后从培养液分离囊泡并分析了其特性。在37℃的培养箱中，在Luria-Bertani(LB)培养基中培养摩氏摩根菌(M.morganii)菌株，直至吸光度(OD 600)达到1.0至1.5，然后继代培养。之后，通过回收包括菌株的培养液并在10,000g和4℃下将培养液离心20分钟来去除菌株，并用0.22μm的过滤器过滤菌株。通过使用具有100kDa Pellicon 2盒式滤膜(Merck Millipore，美国)的MasterFlex泵系统(Cole-Parmer，美国)通过微滤将过滤的上清液浓缩至50ml或更少的体积。将浓缩的上清液再次用0.22μm的过滤器过滤。此后，通过使用BCA测定法对蛋白质进行定量，并对获得的囊泡进行以下实验。
实施例17.来源于摩氏摩根菌的囊泡的细胞凋亡作用
为了评估来源于摩氏摩根菌(M.morganii EV)的囊泡在炎性细胞中的凋亡作用，将小鼠巨噬细胞Raw 264.7细胞用不同浓度(0.1、1、10μg/ml)的来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡处理，评估细胞凋亡程度。更具体地，将Raw 264.7细胞按5x 104细胞/孔等分分入48孔细胞培养板，用不同浓度的用DMEM无血清培养基稀释的来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡处理，将处理的囊泡培养12小时。之后，使用EZ-CYTOX(韩国Dogen)测量细胞凋亡。结果，在用来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡处理期间，未观察到细胞凋亡(见图18)。
实施例18.来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用
为了研究来源于摩氏摩根菌的囊泡对炎性细胞中炎症介质分泌的影响，用不同浓度(0.1、1、10μg/ml)的来源于摩氏摩根菌(MMR101)的囊泡处理小鼠巨噬细胞Raw 264.7细胞后，通过处理来源于大肠杆菌(E.coli EV)的囊泡(所述囊泡是用于炎性疾病发病机理的囊泡)来测量分泌的炎症介质(IL-6、TNf-α等)的量。更具体地，在将Raw 264.7细胞以1×105细胞/孔等分分到24孔细胞培养板中之后，将细胞在DMEM完全培养基中培养24小时。之后，将培养上清液收集在1.5ml试管中，并以3,000g离心5分钟，回收上清液并在4℃下保存，然后进行ELISA分析。结果，证实了当对来源于摩氏摩根菌的囊泡进行预处理时，显著抑制了来源于大肠杆菌的囊泡分泌IL-6和TNF-α(参见图19A和19B)。特别地，当对来源于摩氏摩根菌的囊泡进行预处理时，与植物乳杆菌囊泡相比，巨噬细胞中TNF-α的分泌抑制程度显著更高(参见图19B)。
为了评估从各种样品中分离出的摩氏摩根菌菌株分离的囊泡的抗炎作用，在小鼠巨噬细胞系用各种浓度(0.1、1和10μg/ml)的来源于摩氏摩根菌(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡进行预处理12小时后，细胞系用1μg/ml的来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的囊泡(其是病原性囊泡)处理，然后通过ELISA测量炎性细胞因子TNF-α的分泌。结果，证实了通过对来源于植物乳杆菌(一种有用的微生物对照)的囊泡进行预处理，来源于摩氏摩根菌(Morganella morganii)(MMR101、MMR201、MMR202)的囊泡的TNF-α分泌抑制作用高于通过对来源于植物乳杆菌(一种有用的微生物对照)的囊泡预处理对TNF-α分泌的抑制作用(参见图20)。这意指，不管摩氏摩根菌的来源是什么，摩氏摩根菌分泌的囊泡都具有抗炎作用。
实施例19.热处理或酸处理对来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用的影响
通过实施例18，鉴定了来源于摩氏摩根菌标准菌株(MMR101)和分离菌株(MMR201)的囊泡的抗炎作用，而且，具体研究了囊泡的稳定性和有效材料的特性。为了这个目的，通过用在100℃下煮沸10分钟或用酸处理的来源于两个摩氏摩根菌菌株(MMR101、MMR201)的囊泡预处理巨噬细胞(Raw 264.7)来评估抗炎作用。结果，证实了即使将囊泡在100℃煮沸或用酸处理，也可保持来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用(参见图21)。这意味着来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗炎作用对温度和酸是稳定的。
实施例20.来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗癌作用
此外，基于实施例研究了来源于摩氏摩根菌的囊泡的抗癌作用。为了这个目的，如图22所示，通过向6周龄的C57BL/6雄性小鼠腹膜内注射或口服施用来源于分离的摩氏摩根菌菌株(MMR201)的囊泡，并在施用后第4天皮下注射癌细胞系(CT26细胞)来产生癌症模型。在施用癌细胞系之后，每天腹膜内注射或口服施用来源于分离的摩氏摩根菌菌株的囊泡，并测量癌组织的大小直到24天为止(参见图22)。结果，与作为对照的口服施用生理盐水的组相比，通过腹膜内注射施用囊泡的小鼠和口服施用囊泡的小鼠的癌组织尺寸减小，并且尤其是，当口服施用囊泡时，尺寸进一步减小(参见图23)。这意指当施用来源于摩氏摩根菌的囊泡时，可以有效地抑制癌组织的生长。
提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例仅在所有方面进行了说明，而不是限制性的。
【工业实用性】
预期根据本发明的来源于摩根氏菌属细菌的囊泡可有效地用于诊断胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心肌病、心房颤动、变异型心绞痛、中风、糖尿病和帕金森氏病的方法，以及用于预防或治疗所述疾病或炎性疾病的组合物，例如食品组合物或药物。
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<120> 来源于摩根氏菌属细菌的纳米囊泡及其用途
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gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
