一种具有治疗神经退行性疾病作用的药物组合物
技术领域
本发明属于中药领域，尤其涉及一种具有治疗神经退行性疾病作用的中药提取物组合。
背景技术
痴呆症是一种多因素诱发的以记忆损害和认知功能障碍为特征的慢性中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为慢性记忆损害、认知功能障碍和人格改变，逐渐进展为严重痴呆，是一种在老年人群体中发病率较高的神经退行性疾病。痴呆症分为阿尔兹海默症(AD)、血管性痴呆(VaD)、脑外伤性痴呆、或中毒、缺氧等因素引起的痴呆和混合性痴呆。一般发病患者中AD比例为50-75％，VaD比例为5-20％。全世界痴呆症患者人数估计为4400万，预计每20年就会增加一倍。由于我国老龄化情况的加剧，患有痴呆症的人数也是急剧增长，因此，研发安全有效的预防、治疗药物是目前国内外科研工作中面临的重大课题。
痴呆发病机制较为复杂，尚未完全明确，普遍观点是认为痴呆症由于大脑皮质β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和tau蛋白过度磷酸化引起。AD发病过程中Aβ及其前体淀粉样前体蛋白(APP)、早老素(PS)、tau蛋白及载脂蛋白E(ApoE)等起着极为重要的作用。VaD则主要与脑中风、脑缺血等血管性损伤有关，与脑血流的减少及脑血管疾病有着密切的关系，由于缺血、缺氧性脑损害继而导致认知损害，也与Aβ沉积及tau蛋白等有关。
现如今上市的相关治疗痴呆症药物主要包含胆碱酷酶抑制剂(多奈呱齐、加兰他敏)；改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物(如尼角麦林、毗拉西坦等)；谷氨酸受体拮抗剂，代表药物如美金刚；钙离子阻滞剂，代表药物尼莫地平；神经保护剂；非甾体抗炎药物(阿司匹林)；自由基清除剂和抗氧化剂等。然而，以上所述药物作用与治疗效果均有限，并且长期使用会出现耐药及副作用，临床缺乏更多的药物选择。我国中药文化博大精深，且治疗效果显著，因此开发中药类治疗神经退行性疾病药物具有很好的实用价值。
天麻(Gastrodia elata)属于名贵中药材，主要分布在四川、陕西、云南等地，中医临床用于治疗惊风抽搐、风湿痹、头痛、眩晕、胸痹、癫痫等。现代药理研究发现，天麻中活性成分具有增智健脑的作用，对老年期痴呆有一定疗效，减少AD动物模型Aβ水平，抑制胆碱酶活性，改善AD模型动物症状等。昭通是全国公认的天麻道地药材产区，昭通天麻是昭通独具特色的生物资源，国家地理标志产品“昭通天麻”历史悠久，与文山三七并称“北天麻，南三七”。课题组前期研究发现，昭通乌天麻提取物具有较强的益智健脑作用，与其他中药成分配伍形成复方制剂，可能在防治AD方面具有更良好的协同作用。
三七，以云南文山三七最为著名，其临床主要功效为活血化瘀，消肿止痛。近年来，也有研究显示三七可提高免疫力。石菖蒲，性微温，味辛、苦，属开窍药，临床主要用于癫痫、健忘、及心胸烦闷等。现代药理学研究发现，石菖蒲具有镇静、改善记忆缺失、开窍等药理作用。毛喉鞘蕊花，为云南特色要用植物，具有抗炎等药理作用，对于痴呆神经退行性疾病的治疗作用未见报道。花生壳，是一年生草本植物花生的木质外壳，可药用。其药用功效主要为止咳化痰、抗菌消炎、降压降脂等，但鲜有治疗神经退行性疾病的药理作用报道。
发明内容
本发明针对目前痴呆药物治疗存在的不足，结合中药在痴呆治疗方面独特的优势，提供了一种具有治疗神经退行性疾病作用的中药提取物组合。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种药物组合物，包含如下重量份的：天麻或天麻提取物10-90份、三七或三七提取物1-10份、石菖蒲或石菖蒲提取物1-10份、毛喉鞘蕊花或毛喉鞘蕊花提取物1-10份、花生壳或花生壳提取物1-50份。
所述的药物组合物，优选包含如下重量份的：天麻或天麻提取物20-50份、三七或三七提取物5-10份、石菖蒲或石菖蒲提取物5-10份、毛喉鞘蕊花或毛喉鞘蕊花提取物1-5份、花生壳或花生壳提取物5-20份。
所述的药物组合物，更优选包含如下重量份的：天麻或天麻提取物30份、三七或三七提取物6.25份、石菖蒲或石菖蒲提取物6份、毛喉鞘蕊花或毛喉鞘蕊花提取物2份、花生壳或花生壳提取物10份。
本发明所述药物组合物可以将药材按比例混合后粉碎直接服用，也可以进一步加工成提取物按比例混合制备成药。
本发明所述天麻提取物、三七提取物、石菖蒲提取物、毛喉鞘蕊花提取物及花生壳提取物可以为采用水、醇或其混合溶液(如水，乙醇、50％-70％的乙醇)提取获得。
一个具体的示例，采用如下方法制备得到，但不应受此公开的方法限制，同等极性或性质相似的的提取溶剂或者是溶剂的组合以及方法可视为此提取方法中所用试剂及提取方法的等同方式。
天麻提取物的制备：取检验合格的天麻药材，干燥，粉碎，以50％乙醇/水冷浸，浓缩浸出液。将浓缩物加入至50％乙醇/水，以85℃-90℃回流提取。浓缩提取液，干燥得天麻提取物。
三七提取物的制备：取检验合格的三七根药材，干燥，加8倍重量70％乙醇，回流，浓缩提取液，干燥得三七提取物。
石菖蒲提取物的制备：取检验合格的石菖蒲药材，干燥，切片，置入挥发油提取装置，蒸溜水浸泡后，连续提取，以石油酸萃取油层，并用蒸溜水洗至中性，脱水，挥去石油醚，即得石葛蒲挥发油粗油。
毛喉鞘蕊花提取物的制备：取检验合格的毛喉鞘蕊花地上部分，室温下以乙醇冷浸、渗漉，减压回收溶剂，得浸膏，加入适量水混悬，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩萃取液，得毛喉鞘蕊花提取物。
花生壳提取物的制备：将花生壳干燥，粉碎，加20倍重量70％乙醇，在搅拌下升温至61℃，在该温度下提取，过滤，浓缩。加入乙醇进行醇沉，抽滤，蒸发滤液干燥，即得花生壳提取物。
本发明还提供了上述药物组合物在制备预防或治疗神经退行性疾病药物或保健品中的应用。神经退行性疾病是一组由慢性、进行性中枢神经组织的退行性变性而产生的疾病总称，包括中枢神经退行性疾病痴呆或非中枢神经退行性疾病痴呆。所述中枢神经退行性疾病痴呆包括阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿病，所述非中枢神经退行性疾病痴呆包括血管性痴呆、脑外伤性痴呆、或中毒、缺氧因素引起的痴呆中的一种或几种。
本发明所述药物组合物可以单独使用，也可以和其它药物或功能性食品组合使用。优选的，可以采用口服的形式，如片剂或冲剂，有效量为10-1000mg/kg/d，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。
本发明根据天麻、三七等植物药活性成分的现代药理学研究特点，参考中医中药理论基础及临床用药经验，进行配方配伍设计。在以下4种疾病模型上进行了相关药理药效实验研究：
(1)脑缺血诱导VaD动物模型：该实验采用双侧永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)造成脑缺血损伤，导致控制学习和记忆功能的海马区缺血，使海马区神经元损伤甚至调亡，出现知功能的改变。血管性痴呆占了现阶段所有痴呆患者大约20％，按照现在的发展速度与患病率到2050年VaD患者可能增加3倍，亚洲许多国家老年期痴呆的首要原因为VaD。
(2)APP/PS1转基因小鼠AD动物模型：AD是痴呆的主要类型，约60％痴呆属于AD。此种动物模型可表达突变的人类早老素及人鼠淀粉样前蛋白融合体，从而导致早发型老年痴呆。6-7月龄的APP/PS1转基因小鼠脑内即会形成Aβ沉积，而Aβ沉积为目前公认的老年痴呆的主要原因。
(3)Aβ沉积线虫模型：CL4176线虫株，是一种利用表达载体将Aβ等基因通过显微注射导入线虫株系中，经温度诱导后可在其肌肉组织中表达人类Aβ1-42蛋白，之后迅速进入麻痹状态。由于其生长周期短，虫体方便观察，并且基因功能与人类之间高度相似的特点，目前被广泛用于神经系统病变的研究中。
(4)脑缺血再灌注损伤(CIR)动物模型：CIR模型可造成脑血管损伤，导致脑供血不足，是临床VaD发生的主要原因之一。
附图说明
图1发明所述药物组合物对VaD大鼠停留目标平台时间的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Model,*p<0.05)。
图2本发明所述药物组合物对VaD大鼠穿越目标平台次数的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Model,*p<0.05)。
图3本发明所述药物组合物对转基因AD小鼠停留目标平台时间的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Model,*p<0.05.)。
图4本发明所述药物组合物对转基因AD小鼠穿越目标平台次数的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Model,*p<0.05)。
图5本发明所述药物组合物对线虫瘫痪瘫痪时间的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Control,***p<0.001)。
图6本发明所述药物组合物对大鼠CIR损伤脑切片TTC染色图。
图7本发明所述药物组合物对大鼠CIR损伤的脑切片缺血面积的影响(注：统计学检验方法采用单因素ANOVA Student-Newman-Keuls test,vs Model,**p<0.01)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1天麻提取物、三七提取物、石菖蒲提取物、毛喉鞘蕊花提取物、花生壳提取物的制备
天麻提取物的制备：取检验合格的天麻药材，去杂质洗净后经低温＜60℃干燥，粉碎过100目筛；将粉末以60L 50％乙醇/水冷浸，摇匀，静置过夜。第二天将60L溶剂倒出过滤，转移至旋转蒸发器中浓缩。将天麻初滤物加入至50％乙醇/水，并转移至回流提取罐中，以85℃-90℃回流提取2h。然后以旋转蒸发器浓缩提取液，至干，得天麻提取物。
三七提取物的制备：取检验合格的三七根药材，去杂质洗净后经低温＜60℃干燥，粉碎过20目筛；加8倍重量70％乙醇，回流3次，每次1小时，然后以旋转蒸发器浓缩提取液，至干，得三七提取物。
石菖蒲提取物的制备：取检验合格的石菖蒲提取物药材，去杂质洗净后经低温＜60℃干燥，切片，置入挥发油提取装置，蒸溜水浸泡后，连续提取，以石油酸萃取油层，并用蒸溜水洗至中性，脱水，挥去石油醚，即得石菖蒲挥发油粗油。
毛喉鞘蕊花提取物的制备：取检验合格的毛喉鞘蕊花地上部分，室温下以乙醇反复冷浸、渗漉，减压回收溶剂，得浸膏约，加入适量水混悬，依次用乙酸乙酷和正丁醇萃取，减压浓缩萃取液，得毛喉鞘蕊花提取物。
花生壳提取物的制备：将花生壳置于干燥箱中，在50℃下干燥4h，用粉碎机粉碎，过20目筛，加20倍重量70％乙醇，在搅拌下升温至61℃，在该温度下提取1.6h，过滤，提取三次，滤液合并，浓缩。加入乙醇进行醇沉，搅拌1h，静置过夜，抽滤，滤液蒸发至无乙醇味，干燥，即得花生壳提取物。
实施例2
将实施例1得到药物提取物进行组合，得到药物组合物含有如下重量份的：天麻提取物30份，三七提取物6.25份，石菖蒲提取物6份。
实施例3
将实施例1得到药物提取物进行组合，得到药物组合物含有如下重量份的：天麻提取物30份，三七提取物6.25份，石菖蒲提取物6份，毛喉鞘蕊花提取物2份。
实施例4
将实施例1得到药物提取物进行组合，得到药物组合物含有如下重量份的：天麻提取物30份，三七提取物6.25份，石菖蒲提取物6份，花生壳提取物10份。
实施例5
将实施例1得到药物提取物进行组合，得到药物组合物含有如下重量份的：天麻提取物30份，三七提取物6.25份，石菖蒲提取物6份，毛喉鞘蕊花提取物2份，花生壳提取物10份。
实施例6大鼠血管性痴呆(VaD)实验
实验材料：肝素钠注射液购自江苏万邦生化医药公司；氯霉素滴眼液购自四川美大康华康药业有限公司；水合氯醛购自天津市光复精细化工研究所；75％乙醇溶液购自昆明利健消毒制品有限公司；0.9％氯化钠注射液购自浙江国镜药业有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司。
实验动物：实验动物：健康SD大鼠，SPF级，体重160-180g，雄性，由昆明医科大学实验动物中心提供。以标准饲料喂养并自由饮水，动物饲养于可控制的实验环境(温度：25±2℃)。
实验组：
F2：实施例2药物组合物、F3：实施例3药物组合物、F4：实施例4药物组合物、F5：实施例5药物组合物、Col：毛喉鞘蕊花提取物组、Pea：花生壳提取物组、Col+Pea：毛喉鞘蕊花提取物+花生壳提取物组。
给药剂量：720mg/kg，毛喉鞘蕊花提取物组给药剂量为14.5mg/kg(Col)，花生壳提取物组(Pea)给药剂量为72.7mg/kg，毛喉鞘蕊花提取物+花生壳提取物组(Col+Pea)中毛喉鞘蕊花提取物组给药剂量为7.25mg/kg，花生壳提取物组(Pea)给药剂量为36.35mg/kg，给药，以生理盐水溶解，按照大鼠体重1ml/100g的剂量给药。
实验方法：采用永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)，建立VaD模型，建模时间为1month。建模后第3d进行水迷宫筛模，将模型成功的大鼠按轻、中、重度痴呆均一随机分为假手术组(Sham)、VaD模型组(Model)、实施例2、3、4、5药物组合物组、毛喉鞘蕊花提取物组、花生壳提取物组、毛喉鞘蕊花提取物+花生壳提取物组。并在造模后第7d开始，每天按大鼠体重灌胃给药1个月。采用Morris水迷宫检测各处理组大鼠的学习、记忆变化的情况，采集数据，采用SigmaStat 10.0统计分析软件对数据进行分析处理。各指标多组间采用双/单因素方差分析，以p<0.05为有统计学意义。
大鼠定位航行实验五天逃避潜伏期实验结果如表1所示。与模型组和其他药物组合物相比，实施例5药物组合物(F5)处理后，VaD模型大鼠定位航行逃避潜伏期显著减少(p<0.05)，其余处理组无显著改变，说明本发明所述药物组合物对模型大鼠的学习记忆能力具有很好改善作用。
表1 大鼠定位航行实验五天逃避潜伏期(Mean±SEM)
注：统计学检验方法采用双因素-Fisher LSD，vs Model，***p<0.001，and*p<0.05.Data were analyzed by Two-way ANOVA-Fisher LSD，***p<0.001，and*p<0.05compared to Model group.
本发明所述药物组合物对VaD大鼠停留目标平台时间与穿越目标平台次数的影响实验结果如图1和2所示。与模型组和其他药物组合物相比，实施例5药物组合物(F5)处理后，VaD模型大鼠的停留目标平台时间与穿越目标平台次数均显著增加(p<0.05)。
实施例7AD小鼠实验
实验材料：实施例5药物组合物；水合氯醛购自天津市光复精细化工研究所；75％乙醇溶液购自昆明利健消毒制品有限公司；0.9％氯化钠注射液购自浙江国镜药业有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司。
实验动物：APP(PSN)B6品系转基因AD小鼠，由南京生物医药研究所提供。实验动物以标准饲料并自由饮水适应性饲养1周，(实验室湿度25℃，相对湿度60％-70％，白天与黑夜各12小时。)
给药剂量：以药物组合物中天麻提取物的含量为计量标准计算给药剂量：720mg/kg，以生理盐水溶解，按照大鼠体重1ml/100g的剂量给药。
实验方法：采用市售APP/PS1转基因的AD小鼠，自由进食含有实施例5的饲料8个月，采用水迷宫实验，检测实施例5药物组合物对APP/PS1转基因小鼠学习记忆的影响。
本发明所述药物组合物对转基因AD小鼠停留目标平台时间和穿越目标平台次数的影响实验结果如图3和图4所示。与模型相比，实施例5药物组合物(F5)处理后，AD小鼠的停留目标平台时间与穿越目标平台次数均显著增加(p<0.05)，说明本发明药物组合物对AD小鼠的学习记忆能力具有很好改善作用。
实施例8线虫瘫痪实验
实验材料：实施例5的提取物组合；CL4176(smg-1ts[pAF29(myo-3/Aβ1-42/letUTR)+pRF4(rol-6(sul0069))])线虫株、线虫食物活菌OP50由中科院昆明植物所提供；制作培养基作用琼脂、蛋白胨及胆固醇等试剂购自美国Sigma公司。
给药剂量：按照实施例5所述的提取物组合比例分别称取相应质量的天麻提取物、三七提取物、石菖蒲提取物、毛喉鞘蕊花提取物、花生壳提取物混合后，根据组合物中天麻素的含量用PBS稀释成含天麻素100μM的工作液。
实验方法：采用线虫的瘫痪表型方法。
复苏CL4176线虫株，将线虫置于含新鲜OP50培养板中，置于16℃培养箱中培养。待线虫产卵后，对新生线虫进行同步化处理，使其均处于L1期。在16℃下培养约48h，幼虫发育至L3期，立即升温至25℃条件下培养。升温后20h，开始观察记录瘫痪行为，每2h观察记录一次瘫痪的时间和数量。用蠕虫拾取器接触线虫头部或躯干，若线虫仅能移动头部但不能移动躯干，则判定为线虫处于瘫痪状态；每个药物浓度做3次以上重复，线虫总数大于100条；统计每个平板瘫痪的线虫数和线虫总数，采用Sigmaplot3.5进行数据分析与作图。数据用
实验结果如表2及图5所示。结果显示，与Control组比较，本发明所述药物组合物能显著降低线虫的瘫痪时间。
表2 线虫生存率
实施例9大鼠脑缺血再灌注(CIR)实验
实验材料：实施例4、5的药物组合物；肝素钠注射液购自江苏万邦生化医药公司；氯霉素滴眼液购自四川美大康华康药业有限公司；水合氯醛购自天津市光复精细化工研究所；75％乙醇溶液购自昆明利健消毒制品有限公司；0.9％氯化钠注射液购自浙江国镜药业有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司。
实验动物：健康SD大鼠，SPF级，体重160-180g，雄性，由昆明医科大学实验动物中心提供。以标准饲料喂养并自由饮水，动物饲养于可控制的实验环境(温度：25±2℃)。
给药剂量：按照实施例4、5所述的的药物组合物比例分别称取相应质量的天麻提取物、三七提取物、石菖蒲提取物、毛喉鞘蕊花提取物、花生壳提取物混合后，按混合物中天麻提取物的含量配制剂量为720mg/kg，以生理盐水溶解，按照大鼠体重1ml/100g的剂量给药。
实验方法：采用MCAO线栓法建立大鼠CIR损伤模型。
实验分组为模型组(Model)，实施例4、5组，每组10只大鼠。模型组给予0.9％氯化钠，每日灌胃提取物1次，连续灌胃4天，第4天灌胃后立即手术。采用经典的操作简单的线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)/再灌注模型，每只动物缺血1h后再灌注24h。模型建立完成后，以10％水合氯醛腹腔麻醉，断头取脑，置于-20℃低温冰箱中冷冻，约30min后取出自头侧向尾侧将大脑均匀切成5片，放入1％TTC溶液中，37℃水浴恒温振荡染色10min，后在4％多聚甲醛溶液中固定，当天照相以备分析缺血面积和体积用。用Image-Pro Plus17.0图像分析软件处理，计算脑组织切片缺血面积及校正缺血体积。实验结果以
本发明所述药物组合物对大鼠CIR损伤脑切片TTC染色图如图6所示。本发明所述药物组合物对大鼠CIR损伤的脑切片缺血面积的影响结果如图7所示。结果显示，与模型组相比，本发明所述药物组合物能显著减小缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积(p<0.05)。
