一种具有免疫调节活性的浒苔多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种碱法提取的具有免疫调节活性的浒苔多糖及其制备方法。
背景技术
浒苔（EnteromorphaProlifera）是一种绿藻，俗称苔条、海苔，为绿藻门，石莼目，石莼科植物。在世界的潮间带广泛分布，特别是在中国，波罗的海和智利，在我国东部沿海分布较多。我国的医药典籍中记载了浒苔自古以来就被我国沿海居民食用和药用。近年来，由于浒苔的大量繁殖，破坏了海洋环境的生态平衡，甚至造成严重的“绿潮”危害，因此如何更好的利用这种海洋资源，变废为宝成为研究开发的热点领域。
免疫刺激本身被认为是改善老年人以及癌症患者体内防御机制的重要策略之一，免疫刺激性多糖是相对较新的一类生物活性化合物，在增强身体对病毒和细菌感染的天然抵抗力，或协助治疗免疫力低下的疾病，例如癌症和艾滋病。到目前为止，已建议使用各种类型的葡聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖和岩藻依聚糖作为免疫刺激剂，直接或间接与免疫系统相互作用，增强机体的免疫能力。浒苔作为一种常见的绿藻，多糖是浒苔的主要生物活性成分，通过对浒苔多糖的研究以期发现新的具有免疫调节活性的多糖。
中国专利CN108752495A，报道了一种通过酶解和碱液浸提的制备浒苔碱溶性多糖的方法，但该方法并未对制备的浒苔多糖的单糖组成，糖苷键类型以及抗肿瘤活性进行研究。目前尚未见到关于浒苔多糖的免疫调节活性的研究报道，该发明首次研究了一种具有免疫调节活性的碱法提取的低分子量多糖，可以为浒苔的开发应用提供一定的理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱法提取的具有免疫调节活性的浒苔多糖。以下为本发明具体技术方案：
一种具有免疫调节活性的浒苔多糖，通过碱液提取利用阴离子柱层析和凝胶柱层析分离纯化得到，所述的浒苔多糖分子量分布范围为1000-5000Da，平均相对分子量为4259Da,为β构型吡喃糖，主要由摩尔比分别为87.42%、7.10%、1.67%、2.67%和1.13%的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和木糖组成。体外实验研究发现可提高RAW264.7细胞的吞噬能力，并促进NO、TNF-α和IL-1β等细胞因子的分泌。
浒苔多糖的提取分离方法具体为：将粉碎的浒苔脱脂处理，脱出色素等小分子杂质，晾干后将浒苔用去离子水提取，料液比（V:V=1：10），得到水提残渣，水提的残渣再利用0.3M NaOH溶液提取，脱蛋白，透析，冷冻干燥以后得到粗提多糖。将粗提多糖用去离子水复溶后上样用阴离子柱层析，用蒸馏水洗脱，苯酚硫酸法测定糖含量绘制洗脱曲线，收集合并组分，冻干后用凝胶柱层析进一步纯化，去离子水洗脱，再次采用苯酚硫酸法测定糖含量并绘制洗脱曲线，收集组分，再经浓缩、透析、冷冻干燥后得到纯化的浒苔多糖。
所述的浒苔多糖采用如下方法进行组成分析:将纯化获得的浒苔多糖用超纯水配制成样品溶液，滤膜过滤，取过滤样品液上样至高效凝胶渗透色谱HPGPC，确认浒苔多糖纯度及相对分子质量；然后另取纯化后的浒苔多糖，经三氟乙酸水解、PMP柱前衍生化进行HPLC分析，测定浒苔多糖的单糖组成；另取纯化后的浒苔多糖，经研细、压片机压片后在4000cm-1-400cm-1范围内进行红外光谱扫描分析，获得浒苔多糖的糖苷键类型。
本发明的有益效果为：1.本发明的浒苔多糖具有免疫调节活性，为天然提取物，具有良好的安全性。本发明中的浒苔多糖可提高RAW264.7细胞的吞噬能力，并促进NO分泌、TNF-α和IL-1β等细胞因子的分泌。本发明所得浒苔多糖PWEP-1为纯品。
附图说明
图1为浒苔多糖的HPGPC图。
图2为浒苔多糖的红外光谱图。
图3为浒苔多糖PWEP-1对RAW264.7细胞增殖作用影响。图中*表示与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)（下同）。
图4为浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞的吞噬作用。
图5为浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞的NO分泌量影响。
图6为浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞的TNF-α分泌量影响。
图7为浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞的IL-1β分泌量影响。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
1）低分子量浒苔多糖的分离纯化：
将干燥的浒苔粉碎，装入提取装置中，以95%乙醇为提取液对原料粉末进行浸提3次以脱除色素及小分子杂质；将脱脂处理处理的浒苔样品晾干，以去离子水为提取液（料液比=1：10），80℃，提取2次，收集水提残渣，晾干后将水提残渣用0.3M NaOH溶液提取（料液比=1：10），90℃，提取2次，收集上清液A，将A溶液用加4倍体积乙醇醇沉，静置过夜得到絮状沉淀B，冻干，将样品进行复溶，将Sevage试剂（三氯甲烷：正丁醇=4：1, v/v)加入复溶样品溶液(样品：Sevage试剂=4：1，v:v)剧烈震荡10min以除去蛋白质，后静置分层取最上层溶液，合并所有上层溶液进行透析、冷冻干燥获得浒苔粗多糖。
将上述冻干的浒苔粗多糖溶于去离子水，上样至DEAE Cellulose-52阴离子交换层析柱中，并分别用去离子水溶液进行洗脱，采用苯酚-硫酸法检测各试管洗脱液中糖含量并绘制洗脱曲线。将收集的洗脱峰组分经透析、冷冻干燥处理后
重新溶解于去离子水中，随后上样至Saphedex G-100凝胶柱中，以去离子水为洗脱液洗脱，同样采用苯酚-硫酸法检测多糖含量并收集洗脱峰组分，透析、浓缩、冷冻干燥处理后获得纯化浒苔多糖。
2）浒苔多糖组成分析：
浒苔多糖纯度和分子量测定:将步骤1)中纯化获得的浒苔多糖采用超纯水配制成5mg/mL的样品液，经0.45um滤膜过滤后取约20uL上样至高效凝胶渗透色谱HPGPC进行数据采集。如图1结果所示，碱法提取的浒苔多糖为单一狭窄的对称峰，保留时间为17.23min，可以判断其为单一组分纯品，其平均相对分子量为4259 Da。
浒苔多糖单糖组成测定:称取8mg步骤1)纯化后的浒苔多糖，加入2mL浓度为3mol/L的三氟乙酸，在120℃条件下水解6h，将水解产物干燥后加入甲醇，重复3-4次，以除去多余三氟乙酸，加入1ml去离子水溶解。取100µL样品，加入500µL NaOH溶液（0.3mol/L），再加入500µL PMP甲醇溶液（0.5mol/L）混匀，于70℃水浴反应30min后冷却，加入510µL HCl溶液（0.3 mol/L）中和，加入1mL氯仿溶液，震摇，离心，去氯仿层，反复萃取3次，取上层清液，0.45µm滤膜过滤进行HPLC分析。分析结果表明，浒苔多糖中存在甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和木糖且其摩尔百分比分别为87.42%、7.10%、1.67%、2.67%和1.13%。
浒苔多糖红外光谱分析:取步骤1)纯化后的小球藻胞外多糖2mg与干燥溴化钾粉末混合，充分研磨后压片，然后在4000-400 cm-1范围内进行扫描。如图2所示，浒苔多糖在3438.4cm-1处的强吸收带代表O-H的拉伸振动。在2977.5cm-1和2910.0cm-1区域内观察到的谱带被指定为C-H拉伸振动。在1631.4cm-1附近观察到C-O在羰基中的拉伸振动。此外，C–O拉伸（1062.5cm-1）的吸收表明特征部分为吡喃糖构型。大约在1398.1cm-1处出现的峰表明多糖中存在硫酸酯，在892.9cm-1处的峰表明浒苔多糖为β构型，综上所述，提取的浒苔多糖为β构型吡喃糖。
3）浒苔多糖免疫调节活性鉴定
a.浒苔多糖PWEP-1对RAW264.7细胞增殖作用的影响
取对数生长期的 RAW264.7细胞，将RAW264.7细胞调整浓度为4×104个/mL，接种到96孔板中，37℃、5%CO2条件下常规培养4 h后用100μL不同浓度（25，50，100，250，500µg/ml）浒苔多糖PWEP-1组分处理 RAW264.7，同时设定空白对照组和阳性对照组，每组设6个复孔。以1 µg/mL LPS脂多糖（LPS）作阳性对照，以相同体积的细胞培养液为空白对照。培养 2h，向每孔加入10µL CCK-8 试剂，培养箱中继续反应一段时间后利用酶标仪测定450 nm 处的吸光度值。用细胞存活率衡量增殖作用：
细胞存活率 (%) =1/0×100
A1：处理组和阳性对照组吸光度值；A0：空白对照组吸光度值
图3为浒苔多糖PWEP-1对RAW264.7的增殖活性的影响。可以看到在实验浓度范围内PWEP-1对RAW264.7细胞增殖无毒害作用，还可显著（P<0.05）提高该细胞的增殖活力，当PWEP-1的浓度分别为100 µg/mL时，细胞存活率最高可达到130%。
b. 浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞吞噬作用的影响
利用RAW264.7 吞噬中性红的能力衡量其吞噬能力。取对数生长期的 RAW264.7 细胞，按 4×104个/孔加入 96 孔细胞培养板中培养 24 h，每孔 200 μL。弃去上清液，分别加入100 μL 含有不同浓度（25，50，100，250，500µg/ml）的浒苔多糖PWEP-1的 DMEM 完全培养基，空白对照和阳性对照组分别加入等体积的 DMEM 完全培养基和1 µg/mLLPS，每组设置6个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。24h后弃去上清液，各孔分别加入50 µL含有0.05%中性红PBS溶液，继续培养4h。弃去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入细胞裂解液（乙醇：冰醋酸=1：1）100 µL，室温下放置2 h，待细胞溶解后，在酶标仪上测定540 nm处吸光值。用吞噬指数衡量吞噬作用：
吞噬指数=A1/A0
A1：处理组和阳性对照组吸光度值；A0：空白对照组吸光度值
图4纵坐标为纵坐标代表吞噬指数。根据图4 可知，PWEP-1在中低浓度（25-100µg/mL）能够显著（P<0.05）提高吞噬能力，表现出浓度依赖关系，在浓度为100 µg/mL 时吞噬指数最大，达到1.59，约为空白对照组的 1.5倍，但弱于阳性对照组。当PWEP-1浓度进一步增大至250和500µg/mL，吞噬活性降低。
c. 浒苔多糖PWEP-1对 RAW264.7细胞的NO分泌量的影响
取对数生长期的 RAW264.7 细胞，按 4×104个/孔加入96孔细胞培养板中培养 24 h，每孔 200 μL。分别加入 100μL 含有不同浓度（25，50，100，250，500µg/ml）的浒苔多糖PWEP-1的 DMEM完全培养基，空白对照和阳性对照组分别加入等体积的 DMEM 完全培养基和 1 µg/mL LPS，每组设置6个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。24h后取50µL细胞培养上清液，与等体积的Griess试剂混合，避光反应15 min，在酶标仪上测定 550 nm 处吸光度值。
如图5所示，PWEP-1对 RAW264.7细胞的NO分泌量作用效果呈现先增大后降低的趋势，当PWEP-1浓度 100µg/mL，此时的NO分泌量最高，达40.44µmol/L，显著（P<0.05）高于阳性对照组。当浓度进一步增大，NO分泌量虽有降低但仍高于空白对照组，这说明PWEP-1在合适的浓度下可发挥出最优的促 NO 分泌作用。
d.浒苔多糖PWEP-1对RAW264.7的TNF-α和IL-1β分泌量的影响
取对数生长期的 RAW264.7 细胞，按 4×104个/孔加入96孔细胞培养板中培养 24 h，每孔 200 µL。分别加入 100 µL 含有不同浓度（25，50，100，250，500µg/ml）的浒苔多糖PWEP-1的 DMEM完全培养基，空白对照和阳性对照组分别加入等体积的 DMEM 完全培养基和 1 µg/mL LPS，每组设置6个复孔，置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。孵育24小时后，收集培养基加入ELISA 试剂测定IL-1β和TNF-α的值。
图6和图7纵坐标分别代表RAW264.7细胞的TNF-α和IL-1β分泌量。图6和图7表明PWEP-1能提高RAW264.7分泌TNF-α和 IL-1β 的能力。在 PWEP-1 的浓度为 100 µg/ml 和250 µg/ml 时， TNF-α 和 IL-1β 的分泌量为343.12 ng/L 和 22.32 ng/L，为空白对照组的 3.5 倍、1.5 倍，结果表明，PWEP-1对TNF-α的提高程度大于IL-1β。TNF-α可杀死或抑制肿瘤细胞，能够加强免疫反应并诱导其它免疫因子的分泌；IL-1β可进一步激活巨噬细胞，可参与抗体产生。
体外细胞实验表明PWEP-1在 25-500µg/mL浓度范围内对 RAW264.7无毒害作用，能够显著地提高该细胞的吞噬能力（P<0.05），同时具有促进NO、细胞因子TNF-α和IL-β分泌的作用，表现出较好的免疫调节活性，有望进一步开发，作为免疫调节剂添加到食品中。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征等同替换所组成的技术方案。本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识。
