利用类球红细菌粗提物抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化的方法
技术领域
本发明涉及食品技术领域，特别涉及利用类球红细菌粗提物抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化的方法。
背景技术
腊肠是中国传统肉制品，色泽诱人，具有独特的风味和口感，深受人们的喜爱。脂肪和蛋白质氧化是腊肠风味物质产生的主要来源，对腊肠的品质起决定性作用。然而，腊肠蛋白质、脂肪氧化过度氧化，尤其是脂肪过度氧化会造成酸败，导致腊肠品质大大降低，消费者不再认可。加工腊肠时添加亚硝酸盐不仅可以有效抑制脂肪和蛋白质氧化分解，同时改善腊肠的风味。但亚硝酸盐毒性较强，可与生物胺反应生成具有强致癌作用的亚硝胺，影响腊肠的食用安全性。
类球红细菌分布广泛，生命力强，易于培养，富含类胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物岐化酶、维他命等活性物质，在食品、医药和保健品领域有着广泛的应用。类球红细菌作为益生菌有着广泛的应用前景，广泛用于畜禽和水产养殖。此外，类球红细菌已经完成全基因组测序，没有毒性基因。相对于植物提取物，类球红细菌粗提物抑制肉制品脂肪和蛋白质氧化具有更多的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供利用类球红细菌粗提物抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化的方法，工艺简单，成本低廉，并且在抑制脂肪和蛋白质氧化的同时，提高腊肠的食用价值和安全性，可以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
利用类球红细菌粗提物抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化的方法，将类球红细菌在MMS培养基中活化后恒温避光微氧培养48 h，离心后用适量生理盐水重悬，超声波破碎后离心，将上清作为辅料添加到腊肠中，风干10 d后4 ºC真空冷藏。
进一步地，所述活化的类球红细菌由以下方法制得：先将类球红细菌划线培养于MMS固体培养基上，30 ºC黑暗条件培养3 d长出红色单菌落，挑取红色单菌落接种于MMS液体培养基中，30 ºC黑暗条件培养下微氧培养至OD660=0.4-0.8。
进一步地，类球红细菌的微氧培养及离心重悬按以下操作进行：按2%接种量，将活化培养的类球红细菌接种1 L锥形瓶中，150 rpm、30 ºC和黑暗条件培养下48 h，离心力7000 g，4 ºC条件下离心10 min。
进一步地，超声波破碎类球红细菌及离心获得上清按以下操作进行：按1 L菌用10mL生理盐水的比例重悬，超声条件：功率200 W，总时间20 min，工作6 s，停歇7 s，超声后，离心力8000 g，4 ºC条件下离心10 min。
进一步地，将类球红细菌粗提物作为辅料加工腊肠按以下操作进行：原料肉处理→肥肉瘦肉均切细丝→混料→每1 kg肉加入1 L类球红细菌的粗提物混匀→灌肠→成熟风干→成品→4 ºC真空冷藏。
进一步地，所述混料的原料百分比如下：前夹肉肥瘦比7:3、味精1.5%（w/w）、食盐2%（w/w）、十三香3%（w/w）。
进一步地，成熟风干的环境为：白天12 ºC，晚上8 ºC，相对湿度70-80%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了利用类球红细菌粗提物抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化的方法，在腊肠加工过程中没有添加亚硝酸钠，提高了产品的安全性。同时，类球红细菌粗提物富含类胡萝卜素、辅酶Q10等生理活性物质，能够有效清除自由基，具有延缓衰老、增强机体免疫力、预防心血管疾病和防治癌症、糖尿病等多种疾病。因此，本方法在显著抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化分解的同时大大提高了腊肠的食用价值和安全性。
附图说明
图1为本发明对照腊肠和样品腊肠的TBA值分析图；
图2为本发明对照腊肠和样品腊肠的羰基值（A）和巯基值分析（B）图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
（1）类球红细菌的培养
将-80 ºC保存的类球红细菌划线培养于MMS固体培养基（该培养基在专利号为ZL201510219267.4的发明专利已公开，故在此不做赘述）上，在30 ºC黑暗条件培养3 d长出红色单菌落。然后，挑取红色单菌落接种于装有40 mL 的MMS液体培养基的50 mL锥形瓶中，在30 ºC、150 rpm、黑暗条件下培养至OD660=0.4-0.8（具体操作见专利号为ZL2015 10219267.4的发明专利，故在此不做赘述）。将活化的类球红细菌按2%接种到1 L的锥形瓶中（含0.8 L MMS培养基），在30 ºC、150 rpm、黑暗条件下培养48 h。
（2）类球红细菌粗提物的制备
将培养的类球红细菌在离心力7000 g，4 ºC条件下离心10 min。按1 L菌用10 mL生理盐水的比例重悬，超声条件：功率200 W，总时间20 min，工作6 s，停歇7 s。超声后，离心力8000 g，4 ºC条件下离心10 min，上清即为粗提物。
（3）类球红细菌破碎物作为辅料加工腊肠
原料肉处理→肥肉瘦肉均切细丝→混料（前夹肉，瘦肉:肥肉=7：3、味精1.5%（w/w）、食盐2%（w/w）、十三香3%（w/w））→每1 kg肉加入1 L类球红细菌的粗提物混匀→灌肠→成熟风干（白天12 ºC，晚上8 ºC，相对湿度70-80%）→成品→4 ºC真空冷藏。不加类球红细菌粗提物和亚硝酸盐的腊肠作为对照。
（4）风干期和冷藏期腊肠的脂肪氧化分析
TBA测定采用GB 5009.181-2016《食品安全国家标准-食品中丙二醛的测定》中的分光光度法。
腊肠风干期和冷藏期的TBA值如图1所示，风干2天后开始脂肪氧化，并且没有添加类球红细菌粗提物的腊肠的TBA值极显著高于添加类球红细菌粗提物的腊肠（P<0.01），说明类球红细菌粗提物有效抑制了腊肠的脂肪氧化。
（5）风干期和冷藏期腊肠的蛋白质氧化分析
羰基含量测定方法：称取5 g去掉肥肉并绞碎的样品，于20 mL预冷的提取液（10 mmol/L磷酸盐缓冲液，含100 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2 和1 mmol/L EDTA，pH 7.0）中匀浆60 s。吸取1 mL匀浆液到10 ml EP管中，每管加入1 mL 10 mM DNPH在2 M HCl中的溶液在室温下避光反应1 h（每15 min涡漩振荡一次）。将另外1 mL匀浆液与1 mL 2 M HCl（对照）混合。孵育后，加入1 mL 20％TCA，并将混合物以10000 rpm，4 ºC离心5 min，弃上清液。用1mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）洗涤沉淀3次，以除去DNPH。加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，37ºC孵育15 min，充分溶解沉淀，10000 rpm，4 ºC离心5 min，在370 nm波长处测定上清液的吸光度。用此匀浆液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白作为标准品。根据公式计算羰基含量，表示为nmol羰基/mg蛋白。
羰基含量=(A370×106)÷(2.2×104×C)
式子中：A370是370 nm下的吸光度。2.2×104 L/(mol·cm)代表摩尔吸光系数。106表示单位换算系数，C表示用考马斯亮蓝法在595 nm下测得的匀浆液蛋白浓度。
总巯基含量的测定：依据DTNB法，吸取羰基测定中的匀浆液1 mL，与8 mL Tris-甘氨酸溶液（每L该溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol尿素，pH 8）混合均匀，均质60 s，然后10000 rpm，4 ºC离心15 min。吸取上清液4.5 mL与0.5 mL 10 mM5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）混合（DTNB）。在40 ºC水浴中孵育30 min。在412 nm处测量上清液的吸光度。根据公式计算总巯基含量，表示为nmol巯基/mg蛋白（nmol/mg protein）。
巯基含量=（A412×106）/(1.36×104×C)
A412表示412 nm下的吸光度，1.36×104代表摩尔吸光系数，106是单位转换系数。C为用考马斯亮蓝法在595 nm下测得的匀浆液蛋白浓度。
风干期和冷藏期对照和样品的羰基值和巯基值分别如图2A和2B所示，从图中可以看出，从风干期第2天开始，不添加类球红细菌粗提物的对照的羰基值极显著高于添加类球红细菌粗提物的腊肠样品（P<0.01），说明对照腊肠蛋白质氧化程度极显著高于样品腊肠的蛋白质氧化。从风干期第4天开始，添加类球红细菌粗提物的样品的巯基含量极显著高于不添加类球红细菌粗提物的对照腊肠（P<0.01），说明对照腊肠的蛋白质分解程度极显著高于样品腊肠。巯基含量和羟基含量数据说明，类球红细菌粗提物显著抑制了腊肠的蛋白质氧化分解。
类球红细菌富含类胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶SOD等生理活性物质。类胡萝卜素、辅酶Q10和SOD具有良好的抗氧化活性，能够有效清除自由基，具有延缓衰老、增强机体免疫力、预防心血管疾病和防治癌症、糖尿病等多种疾病，并且稳定性较好，广泛用于食品、医药和化妆品行业。此外，类球红细菌已全基因组测序，基因组没有毒性基因，并且类球红细菌作为益生菌广泛用于畜禽和水产养殖，安全无毒。因此，将类球红细菌粗提物用于腊肠加工不仅可以有效抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化，也大大提高腊肠的食用价值和安全性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
