一种渔用免疫增强剂及其应用
技术领域
本发明属于水产动物疾病防治技术领域，更具体地说，本发明涉及一种渔用免疫增强剂及其在水产养殖中的应用。
背景技术
随着我国集约化养殖程度的提高，养殖密度的不断增大，养殖鱼类病害越来越严重，细菌性病、病毒性病、寄生虫病给鱼类养殖带来巨大的经济损失。目前，针对疾病的防控主要是以化学药物防治为主，但是化学药物的长期反复使用，容易造成耐药性、环境污染、水产品药物残留等问题，并且不能从根本上解决鱼类病害的问题。
发明内容
植物多糖是广泛存在于植物体内的一种天然大分子活性物质，临床应用显示，多种植物多糖具有免疫调节作用，特别是在免疫增强方面疗效显著。黄芪多糖是从黄芪中提取的天然活性成分，具有抗病毒、抗氧化、调节机体体液和细胞免疫等作用，因其具有显著的免疫增强及抗病毒作用，同时价格低廉、无毒副作用，广泛应用于临床医疗、畜牧及水产动物的养殖中。白术多糖，主要成分为甘露糖和果聚糖，是白术发挥免疫促进作用的重要活性成分，研究表明，白术多糖具有明显的免疫增强作用，因其天然性，无毒无抗等特点，成为饲料添加剂研发的热点。
针对上述现有技术存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种渔用免疫增强剂及其在水产养殖中的应用。本发明从鱼体本身出发，利用渔用免疫增强剂提高鱼体自身免疫力，增强对病原及不良环境的抵抗能力，从根本上减少鱼体疾病的发生。
为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种渔用免疫增强剂，由按质量百分比的以下组分组成：
黄芪多糖%2033％～75％
白术多糖%2025％～67％；各组分质量百分比之和为100％。
进一步地，上述技术方案，所述渔用免疫增强剂，由按质量百分比的以下组分组成：
黄芪多糖%2045％～70％
白术多糖%2030％～55％；各组分质量百分比之和为100％。
更进一步地，上述技术方案，所述渔用免疫增强剂，由按质量百分比的以下组分组成：
黄芪多糖%2055％～65％
白术多糖%2035％～45％；各组分质量百分比之和为100％。
优选地，上述技术方案，所述渔用免疫增强剂，由按质量百分比的以下组分组成：
黄芪多糖%2060％
白术多糖%2040％；各组分质量百分比之和为100％。
本发明的第二个目的在于提供上述所述渔用免疫增强剂作为水产养殖饲料在水产养殖中的应用。
一种水产养殖饲料，包括上述所述渔用免疫增强剂。
与现有技术相比，本发明具有以下的明显有益效果：
(1)本发明的渔用免疫增强剂为组合制剂，更能发挥免疫增强作用。本发明采用的黄芪多糖和白术多糖都能提高鱼体非特异性免疫，但是两者作用方式不同，作用效果也不同，将两者结合，作用互补，提高鱼体非特异性免疫的能力大大增强。
(2)本发明优化配比，效果更佳。通过反复试验，得到黄芪多糖和白术多糖的最佳配比范围，进一步优化，得到最佳配比，能够达到最佳的免疫增强作用。
(3)本发明的渔用免疫增强剂作用效果好。室内攻毒试验显示，免疫保护率达58.8％，大塘应用试验显示，免疫保护率达64％。
(4)本发明采用的原料均为中草药提取物，无毒无公害，不存在对养殖生态环境破坏和水产品药物残留的隐患。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1(配方筛选)
1材料和方法
1.1试验材料
分别选取黄芪多糖、白术多糖、灵芝多糖、香菇多糖进行两两复配，例如：黄芪多糖：白术多糖(质量比1:1)；黄芪多糖：灵芝多糖(质量比1:1)；黄芪多糖：香菇多糖(质量比1:1)；白术多糖：香菇多糖(质量比1:1)；白术多糖：灵芝多糖(质量比1:1)；灵芝多糖：香菇多糖(质量比1:1)。以普通黄鳝饲料为对照组。
1.2试验方法
试验分为7个组，1个对照组，6个试验组，每组2个平行。对照组投喂普通黄鳝饲料，试验组投喂分别添加有质量比1：1的黄芪多糖与白术多糖、质量比1：1的黄芪多糖与灵芝多糖、质量比1：1的黄芪多糖与香菇多糖、质量比1：1的白术多糖与香菇多糖、质量比1：1的白术多糖与灵芝多糖、质量比1：1的灵芝多糖与香菇多糖的饲料。各组药物(复方制剂)在饲料中的添加量为1％。每天投喂两次，分别于9:00和16:00各投喂一次，每次投喂量相同，实验持续15天。
1.3指标测定
试验结束时，每组取6尾黄鳝，断尾取血，凝血后4℃下以4000r/min，离心10min，收集血清，冻存备用；收集肠道，去除内容物后，冻存备用。
血清测定指标：碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)。
2试验结果
以黄鳝血清碱性磷酸酶和酸性磷酸酶为考察指标，结果表1。
由表1可以看出，单从碱性磷酸酶指标来看，该指标从高到低的组别顺序依次为：黄芪多糖：灵芝多糖(1：1)＞黄芪多糖：白术多糖(1：1)＞白术多糖：灵芝多糖(1：1)＞灵芝多糖：香菇多糖(1：1)＞黄芪多糖：香菇多糖(1：1)＞白术多糖：香菇多糖(1：1)＞对照组，其中黄芪多糖：白术多糖(1：1)同黄芪多糖：灵芝多糖(1：1)无显著性差异(P＞0.05)，黄芪多糖：白术多糖同白术多糖：灵芝多糖无显著性差异(P＞0.05)，其它组间均具显著性差异(P＜0.05)。
单从酸性磷酸酶指标来看，从高到低的组别顺序依次为：黄芪多糖：灵芝多糖(1：1)＞黄芪多糖：白术多糖(1：1)＞黄芪多糖：香菇多糖(1：1)＞白术多糖：灵芝多糖(1：1)＞灵芝多糖：香菇多糖(1：1)＞白术多糖：香菇多糖(1：1)＞对照组，其中黄芪多糖：白术多糖(1：1)同黄芪多糖：灵芝多糖(1：1)无显著性差异(P＞0.05)，其它组间均具显著性差异(P＜0.05)。各复配药物对两个酶学指标影响并不一致，其中黄芪多糖：灵芝多糖(1：1)同黄芪多糖：白术多糖组(1：1)两个酶活性均无显著性差异(P＞0.05)，考虑到灵芝多糖价格相对昂贵，选择作用效果第二的黄芪多糖：白术多糖作为优选配方。
表1不同配方制剂对ALP和ACP的影响
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
实施例2(配比筛选)
选择实施例1筛选出的优选配方：黄芪多糖和白术多糖，分别以表2中的比例制备复方制剂，以普通黄鳝饲料为对照组，以黄鳝血清碱性磷酸酶和酸性磷酸酶为考察指标，结果发现各比例配制的复方制剂碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性显著高于对照组(p＜0.05)，而当黄芪多糖与白术多糖的质量比为3:1，2:1，1:1，1:2时，碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性显著高于等质量单方制剂(p＜0.05)，其中3:1和2:1组增重率和成活率显著高于其他组(p＜0.05)。因此确定复方制剂最佳配比在3:1～1:1之间。
表2复方制剂不同配比情况表
实施例3
本实施例的一种渔用免疫增强剂，由按质量百分比的以下组分组成：
黄芪多糖 60％
白术多糖 40％；各组分质量百分比之和为100％。
实施例4渔用免疫增强剂对黄鳝非特异性免疫指标的影响试验
1材料和方法
1.1试验材料
黄芪多糖、白术多糖、黄芪多糖：白术多糖(60％：40％)
1.2试验方法
试验分为4个组，1个对照组，3个试验组，每组2个平行。对照组投喂普通黄鳝饲料，试验组投喂分别添加有黄芪多糖、白术多糖、黄芪多糖：白术多糖(60％：40％)(简称黄芪：白术)的饲料，各药物的饲料添加量为1％。每天投喂两次，分别于9:00和16:00各投喂一次，每次投喂量相同，实验持续15天。
1.3指标测定
试验结束时，每组取6尾黄鳝，断尾取血，凝血后4℃下以4000r/min，离心10min，收集血清，冻存备用；收集肠道，去除内容物后，冻存备用。
血清测定指标：碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合成酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、补体C3、补体C4。
肠道测定指标：超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合成酶(NOS)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)。
2试验结果
2.1血清酶学指标
由表3可以看出，饲喂药物组黄鳝血清中ALT、AST活性均显著小于对照组(P＜0.05)，且药物组间差异显著(P＜0.05)，其中黄芪：白术＜黄芪多糖＜白术多糖，ALP、SOD、NOS、ACP活性均显著大于对照组(P＜0.05)，且药物组间差异显著(P＜0.05)，其中黄芪：白术＞黄芪多糖＞白术多糖。说明，3种药物均可显著(P＜0.05)降低血清中ALT、AST活性，提高血清中ALP、SOD、NOS、ACP活性，其中黄芪：白术效果最佳。
表3不同配方制剂对血清酶学指标变化情况对比表
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
由表4可以看出，饲喂药物组黄鳝血清中补体C3、C4含量均显著高于对照组(P＜0.05)，且药物组间差异显著(P＜0.05)，其中：黄芪：白术＞黄芪多糖＞白术多糖。说明，3种药物均可显著(P＜0.05)提高黄鳝血清中补体C3、C4含量，其中黄芪：白术效果最佳。
表4不同配方制剂对血清中补体变化情况对比表
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
2.2肠道酶学指标
由表5可以看出，饲喂药物组黄鳝肠道中SOD、NOS、ACP、AKP活性均显著高于对照组，且药物组间差异显著(P＜0.05)，其中黄芪：白术＞黄芪多糖＞白术多糖。说明3种药物均可显著(P＜0.05)提高黄鳝肠道中SOD、NOS、ACP、AKP酶活性，其中黄芪：白术效果最佳。
表5不同配方制剂对肠道酶学指标变化情况对比表
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
血清转氨酶(AST、ALT等)是肝细胞受到损伤的敏感指标，转氨酶的升高在一定程度上反映了肝细胞受到损伤的程度。碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶是鱼类非特异性免疫中主要的体液免疫因子，一般情况下，这三种酶的活性升高，代表着鱼类机体的免疫状态良好，机体免疫能力也提高。一氧化氮(NOS)是由生物体内的一氧化氮合酶催化精氨酸生成，在多种生物中，是调节者和效应分子，也是神经信使，还可以调节由感染引起的炎症，并可以对其进行免疫抑制等，因此一氧化氮合成酶的活力能够在一定程度上反映生物的健康状况与抗病能力。超氧化物歧化酶(SOD)中重要的抗氧化酶，能阻断与修复机体内的氧自由基对细胞的损伤。补体是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，激活后具有机体靶细胞溶解和调理作用，而C3、C4是补体系统的主要成分。
用药后，转氨酶活性显著下降(P＜0.05)，血清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、补体C3、C4活性显著升高(P＜0.05)；肠道碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶活性显著升高(P＜0.05)，说明白术多糖、黄芪多糖以及黄芪多糖和白术多糖混合物能够显著(P＜0.05)提高黄鳝非特异性免疫力，其中混合物作用效果最佳。
实施例5对黄鳝抗病能力的影响
1材料和方法
1.1试验材料
黄芪多糖、白术多糖、黄芪多糖：白术多糖(60％：40％)
1.2室内攻毒试验
试验分为4个组，1个对照组，3个试验组，每组2个平行。对照组投喂普通黄鳝饲料，试验组投喂分别添加有黄芪多糖、白术多糖、黄芪多糖：白术多糖(60％：40％)(简称黄芪：白术)的饲料，各药物的饲料添加量为1％。每天投喂两次，分别于9:00和16:00各投喂一次，每次投喂量相同，实验持续15天。
试验结束后采用嗜水气单胞菌(2.0×108cell/mL)对各组试验鱼进行攻毒。每组分别取试验鱼20尾，经胸鳍基部注射0.1mL嗜水气单胞菌悬液。饲养观察96h后，统计各组的死亡率，依下式计算死亡率(mortality rate，MR)与免疫保护率(protective rate，PR)。
死亡率(％)＝[(试验初鱼体尾数一试验末鱼体尾数)/试验初鱼体尾数]×100；
免疫保护率(％)＝(1一试验组死亡率/对照组死亡率)×100
1.3大塘应用试验
在仙桃某黄鳝养殖户选择4个相同网箱(1.5m*1.5m*0.7m)，每个网箱投放黄鳝100尾，对照组投喂普通黄鳝饲料，试验组投喂分别添加有黄芪多糖、白术多糖、黄芪多糖：白术多糖(60％：40％)(简称黄芪：白术)的饲料，各药物的饲料添加量为1％。每天投喂两次，分别于9:00和16:00各投喂一次。试验从9月3日开始，持续1个月，记录各组黄鳝的发病状况及死亡数。
1.4试验结果
1.4.1室内攻毒试验
由表6可以看出，经嗜水气单胞菌攻毒后，对照组死亡率达85％，黄芪多糖组死亡率为45％，白术多糖为55％，黄芪：白术组为35％，黄芪多糖和白术多糖混合物的免疫保护率(58.8％)显著(P＜0.05)高于黄芪多糖(47.1％)和白术多糖(35.3％)，说明黄芪多糖和白术多糖混合使用，免疫效果增强。
表6不同配方制剂对黄鳝的免疫保护作用对比表
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
1.4.2大塘应用试验
由表7可以看出，在试验期间，该养殖区域黄鳝爆发了出血病，对照组黄鳝死亡率达25％，黄芪多糖、白术多糖、黄芪：白术死亡率分别为12％、15％和9％，黄芪多糖和白术多糖混合物免疫保护率(64％)显著(P＜0.05)高于黄芪多糖(52％)和白术多糖(40％)，说明黄芪多糖和白术多糖混合使用，免疫效果增强。
表7不同配方制剂对大塘使用效果对比表
注：表中同列数据后不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
由以上结果可知，黄芪多糖、白术多糖、黄芪：白术这三种药物均具有较好的免疫保护作用，其中黄芪多糖和白术多糖混合物的作用效果最佳。
