一种水热处理提高芦笋多酚对酪氨酸酶抑制作用的方法
技术领域
本发明涉及一种水热处理提高芦笋多酚对酪氨酸酶抑制作用的方法，属于果蔬精深加工技术领域。
背景技术
酪氨酸酶(EC1.14.18.1)又称多酚氧化酶，其活性中心包含铜原子，在果蔬、动物、微生物及人体中分布广泛，且是黑色素生成的关键限速酶。酪氨酸酶的活性包括以酪氨酸为底物的单酚酶活性和以左旋多巴为底物的二酚酶活性。在食品领域，果蔬中由于酪氨酸酶所引起的褐变会破坏其感官品质，甚至引起营养价值的损失，降低加工过程的商业价值。曲酸、熊果苷等人工合成抑制剂尽管抑制效果明显，但由于其较强的副作用而使其应用受到限制。因此近几年来从植物中提取的天然活性成分因其作用效果显著、安全无毒而备受关注。
芦笋学名石刁柏(Asparagus officinalis L.)，是百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，食用部分为嫩茎。芦笋含有丰富的酚类物质(槲皮素、没食子酸、阿魏酸、肉桂酸、香豆酸、山柰酚、异鼠李亭衍生物等)。尽管其中芦丁、槲皮素、香橼素、山柰素等天然黄酮类化合物对酪氨酸酶具有抑制作用，但许多天然多酚由于其吸收不佳进而导致抑制作用不显著而限制了它们的应用。现有关于酪氨酸酶的抑制作用研究主要集中在单一活性成分对酪氨酸酶活性的抑制，其中化学合成化合物毒副作用较强，而天然成分的抑制效果不够显著。
天然成分的酯化是一种可以增强多酚前体物质渗透和利用的有效方法，进而增强对酪氨酸酶的抑制作用。而水热处理是酯化反应发生的必要条件之一，水热处理因其简单而经济的操作、无毒、环保且安全等特点成为一种流行且广泛使用的加工方式。目前，水热处理在果蔬领域的应用主要集中在增加某些功能性高分子化合物的溶解性和增强膳食纤维的抗氧化性。但是并未有通过水热处理提高芦笋多酚对酪氨酸酶的抑制活性方法。
发明内容
[技术问题]
从植物中提取的天然活性成分-多酚，因其作用效果显著、安全无毒而备受关注，但由于天然成分的吸收不佳导致其抑制效果不够显著。
[技术方案]
针对上述问题，本发明以新鲜芦笋为原料，经过干燥、提取、干燥、水热处理的方法提高其对酪氨酸酶的抑制作用。
本发明提供了一种通过水热处理提高芦笋多酚对酪氨酸酶抑制作用的方法，有效地提高芦笋多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用，包括以下步骤：
(1)新鲜芦笋干燥磨粉；
(2)芦笋多酚的提取：将步骤(1)中芦笋粉末用提取溶剂进行提取，得到芦笋多酚提取物；
(3)芦笋多酚提取物的干燥：将步骤(2)中得到的芦笋多酚提取物冷冻干燥脱水；
(4)水热处理：将步骤(3)中的多酚提取物配置成溶液，进行水热反应，水热反应温度为100-130℃，水热反应时间为30-80min，反应结束后得到能够提高对酪氨酸酶抑制作用的芦笋多酚提取物。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中新鲜芦笋采用的干燥方式是真空干燥，真空干燥的干燥温度为50-60℃，干燥时间为8-10h，真空度为-0.068-0.095Mpa。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的新鲜芦笋干燥后磨粉至50～200目。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的提取溶剂为乙醇溶液，乙醇溶液的体积浓度为50％-90％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的提取温度为50-80℃，每次提取时间为30-50min，重复提取步骤，对芦笋粉末重复提取3-5次。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中芦笋多酚提取物冷冻干燥的条件为：干燥温度为-50-60℃，干燥时间为48-72h，真空度为0.01-0.03mbar。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中的芦笋多酚提取物用体积分数为50-90％的乙醇溶液配置成浓度为10-40mg/mL的溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述水热处理条件是指通过高温反应釜在130℃的条件下加热80min。
本发明提供了通过该上述方法处理后得到的芦笋多酚提取物。
本发明提供了上述芦笋多酚提取物在抑制水果褐变中的应用。
本发明提供了上述芦笋多酚提取物在护肤品或化妆品中的应用。
[有益效果]：
(1)本发明以新鲜芦笋为原料，通过真空干燥、磨粉、提取、冷冻干燥、水热处理等步骤，使芦笋多酚提取物的酪氨酸酶抑制率可提高44％。
(2)当芦笋多酚提取物浓度为100μg/mL时，本发明方法可以使B16F10小鼠黑素瘤细胞内黑色素的生成量降低95％，细胞内酪氨酸酶活力降低20％。
附图说明
图1为不同处理后B16F10细胞内黑色素含量的实物图，其中ASE表示实施例1中未加热芦笋多酚提取物，ASEH表示实施例1中经过水热处理后的芦笋多酚提取物。
具体实施方式
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,128KDa)：购于上海源叶生物科技有限公司。
B16F10细胞：第四代小鼠黑素瘤冻存细胞，购于上海沪震生物科技有限公司。
1.细胞外酪氨酸酶的测定方法：用2.8mL 2.5mM的L-多巴溶液作为底物，取芦笋多酚提取物100μL，然后加入100μL 0.2mg/mL的酪氨酸酶溶液在30℃下孵育15min后在475nm下测量其吸光值变化，计算公式如下：
酪氨酸酶相对活性＝(B2-B1)/(A2-A1)×100％
A1和A2表示空白组在0min和15min时的吸光值，B1和B2表示样品在0min和15min时的吸光值。
2.B16F10细胞内黑色素生成量的测定方法：消化生长良好的对数期细胞：用血细胞计数板计数，调整细胞密度为2×104个/mL接种于6孔培养板，每孔2mL，置于二氧化碳培养箱中培养过夜后，弃去上清液，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗1次，每孔加入2mL含有不同浓度受试物的DMEM培养液，每一浓度3个复孔，空白组不用药，用等量的DMEM新鲜培养液替代，置于二氧化碳培养箱继续培养。培养72h后弃上清液并用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化后收集细胞于离心管中，1500r/min离心10min，弃上清液加1mL含10％DMSO的1mol/L氢氧化钠，80℃孵育1h，移入96孔培养板中，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光值，由下述公式计算细胞内黑色素含量：
黑色素含量＝A3/A4×100％
A3和A4分别表示试验孔和空白孔的吸光值。
3.B16F10细胞内酪氨酸酶活力的测定方法：调节细胞悬液密度为2×104个/mL接孔于96孔板中，每孔100μL。24h后换液，更换含有不同浓度芦笋多酚提取物的培养液，设8个复孔。对照组以完全培养液代替添加了芦笋多酚提取物的培养液。37℃，5％CO2条件下孵育24h，吸出每孔中含药物培养基后用PBS洗涤细胞，每孔加入1mL含1％辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100)的PBS溶液，-80℃冰箱放置30min，室温下溶解50min，按此时间段冻融两次。第二次细胞溶解后，吹打吸出每孔溶液于2mL离心管中，每管加入0.5mL的含0.2％L-dopa的PBS溶液，37℃孵育2h后使用酶标仪在490nm测吸光度值。
细胞内酪氨酸酶相对活力＝A5/A6×100％
A5和A6分别表示试验孔和空白孔的吸光值。
【实施例1】
将新鲜芦笋清洗干净后，切片、摆盘，放入真空干燥箱中，调节真空干燥箱的温度为70℃，真空度为-0.098MPa，脱水干燥7.5h后取出磨粉至100目，称取1g芦笋粉末置于烧杯中，按料液比1:40(m/V)加入40.0mL体积分数为70％乙醇，提取40min，按照上述提取条件，重复加入乙醇对芦笋粉末一共提取4次。合并提取液并冷冻干燥后，加入体积分数为70％的乙醇将其重新配置成浓度为20mg/mL的多酚提取物溶液。取一半体积的多酚提取物溶液将其放入高温反应釜中进行水热处理，水热处理温度为130℃，处理时间为80min。剩余的多酚提取物溶液不进行水热处理，作为对照组。
将上述经过水热处理和未经水热处理的多酚提取物溶液分别稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，通过分光光度法测定其对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素的生成量以及胞内酪氨酸酶活力的抑制作用，测定方法参见上文。测定的结果如表1所示，从表1的数据中可以看出，130℃80min的热处理条件可以明显加强样品对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用；并且随着样品浓度的增加，这种加强作用更为明显。图1为不同处理后B16F10细胞内黑色素含量的照片，其中ASE表示未加热芦笋多酚提取物，ASEH表示经过水热处理后的芦笋多酚提取物。由图1可以看出，未加热的芦笋提取物处理后的培养基颜色较深，而经过加热后的芦笋提取物处理的培养基颜色较浅，且浓度越大颜色越浅。
表1为不同浓度抑制剂经过130℃、80min热处理后的作用效果
【实施例2】
将新鲜芦笋清洗干净后，切片、摆盘，放入真空干燥箱中，调节真空干燥箱的温度为70℃，真空度为-0.098MPa，脱水干燥7.5h后取出磨粉至100目，称取1g芦笋粉末置于烧杯中，按料液比1:40(m/V)加入40.0mL体积分数为70％乙醇，提取40min，按照上述提取条件，重复加入乙醇对芦笋粉末一共提取4次。合并提取液并冷冻干燥后，加入体积分数为70％的乙醇将其重新配置成浓度为20mg/mL，随后将其放入高温反应釜中进行水热处理，水热处理温度为110℃，处理时间为80min。
将水热处理后的溶液定稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，通过分光光度法测定其对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素的生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用，测定方法参见上文。测定的结果如表2所示，从表2的数据中可以看出，110℃、80min的热处理条件一定程度加强样品对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用。与实施例1相比，水热处理温度降低至110℃，水热处理仍会增强样品对酪氨酸酶的抑制作用，但增强作用不如实施例1中条件。
表2为不同浓度抑制剂经过110℃80min热处理后的作用效果
【实施例3】
将新鲜芦笋清洗干净后，切片、摆盘，放入真空干燥箱中，调节真空干燥箱的温度为70℃，真空度为-0.098MPa，脱水干燥7.5h后取出磨粉至100目，称取1g芦笋粉末置于烧杯中，按料液比1:40(m/V)加入40.0mL体积分数为70％乙醇，提取40min，按照上述提取条件，重复加入乙醇对芦笋粉末一共提取4次。合并提取液并冷冻干燥后，加入体积分数为70％的乙醇将其重新配置成浓度为20mg/mL，随后将其放入高温反应釜中进行水热处理，水热处理温度为130℃，处理时间为30min。
将上述水热处理后的溶液定稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，通过分光光度法测定其对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素的生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用，测定方法参见上文。测定的结果如表3所示，从表3的数据中可以看出，130℃30min的热处理条件一定程度加强样品对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用。与实施例1相比，水热处理时间缩短至30min，水热处理仍会增强样品对酪氨酸酶的抑制作用，但增强作用不如实施例1中条件。与实施例1和实施例2相比，水热处理效果受加热时间的影响比加热温度的影响更为显著。
表3为不同浓度抑制剂经过130℃30min热处理后的作用效果
【实施例4】
将新鲜芦笋清洗干净后，切片、摆盘，放入真空干燥箱中，调节真空干燥箱的温度为70℃，真空度为-0.098MPa，脱水干燥7.5h后取出磨粉至100目，称取1g芦笋粉末置于烧杯中，按料液比1:40(m/V)加入40.0mL体积分数为70％乙醇，提取40min，按照上述提取条件，重复加入乙醇对芦笋粉末一共提取4次。合并提取液并冷冻干燥后，加入体积分数为30％的乙醇将其重新配置成浓度为20mg/mL的多酚提取物溶液，随后将多酚提取物溶液其放入高温反应釜中进行水热处理，水热处理温度为130℃，处理时间为80min。
将上述水热处理后的溶液定稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，通过分光光度法测定其对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素的生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用，测定方法参见上文。测定的结果如表4所示，从表4的数据中可以看出，与实施例1相比，降低的乙醇浓度会降低芦笋多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用。
表4为采用体积分数为30％的乙醇配制的不同浓度抑制剂经过130℃80min热处理后的作用效果
【实施例5】
将新鲜芦笋清洗干净后，切片、摆盘，放入真空干燥箱中，调节真空干燥箱的温度为70℃，真空度为-0.098MPa，脱水干燥7.5h后取出磨粉至100目，称取1g芦笋粉末置于烧杯中，按料液比1:40(m/V)加入40.0mL体积分数为70％乙醇，提取40min，按照上述提取条件，重复加入乙醇对芦笋粉末一共提取4次。合并提取液并冷冻干燥后，加入体积分数为90％的乙醇将其重新配置成浓度为20mg/mL的多酚提取物溶液，随后将多酚提取物溶液其放入高温反应釜中进行水热处理，水热处理温度为130℃，处理时间为80min。
将上述水热处理后的溶液定稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)，通过分光光度法测定其对细胞外酪氨酸酶、细胞内黑色素的生成量以及酪氨酸酶活力的抑制作用，测定方法参见上文。测定的结果如表5所示，从表5的数据中可以看出，与实施例1相比，过高的乙醇浓度并不会显著提高芦笋提取物对酪氨酸酶的抑制作用。
表5为采用体积分数为90％的乙醇配制成的不同浓度抑制剂经过130℃80min热处理后的作用效果
【对比例1】
将实施例1中经过水热处理的多酚提取物溶液分别稀释成不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)；未经水热处理的多酚提取物溶液也分别稀释成不同浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)；分别利用这些溶液对细胞内黑色素进行处理。具体的方法为：用血细胞计数板计数，调整细胞密度为2×104个/mL接种于6孔培养板，每孔2mL，置于二氧化碳培养箱中培养过夜后，弃去上清液，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗1次，每孔加入2mL含有不同浓度受试物的新鲜DMEM培养液继续培养72h，然后测定其黑色素含量
设置一个空白组，设置一个曲酸组，曲酸组加入的是200μg/mL的曲酸，由图1可以看出，空白组的培养基颜色很深，与实施例1相比，加热后的芦笋提取物对细胞内黑色素的抑制作用与曲酸效果相当。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
