一种发酵型木耳乳清分离蛋白复合饮料的制备方法
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体涉及一种发酵型木耳乳清分离蛋白复合饮料的制备方法。
背景技术
木耳(Agaric)属于担子菌纲，木耳目，木耳科。色泽黑褐，质地柔软。黑木耳子实体胶质，风味特殊，是一种营养丰富的食用菌。每100g干品黑木耳中含有碳水化合物65.5g，蛋白质10.6g，纤维素7.0g，脂肪0.2g，此外还含有多种维生素和矿物质，被营养学家誉为“素中之王”和“黑燕窝”。其中的木耳多糖作为一种重要的活性成分，具有多种生物活性。
近年来，乳清分离蛋白(WPI)已被用于开发各种富含蛋白质的饮料，例如代餐饮料和恢复运动饮料。在生产过程中，许多乳清分离蛋白饮料会调节至酸性环境(pH≤3.5)，在此条件下蛋白质的涩味可能会造成产品的感官缺陷。为了解决这个问题，理想的乳清分离蛋白饮料应该在pH4～6的范围内调配。然而，该pH范围与乳清蛋白的等电点(pI)重叠。溶液的pH在等电点附近变化时，乳清蛋白可能会出现沉淀、相分离或凝胶化，这可能对乳清分离蛋白饮料的稳定性产生负面影响，通过实验证明木耳多糖在乳清蛋白等电点附近可以与分离乳清蛋白结合，一定浓度的木耳多糖与分离乳清蛋白结合物在加热和贮藏过程中具有良好稳定性。
大连工业大学在2018年申请了“一种食用菌多糖复配高浓度蛋白饮料及其制备方法”(申请号：201810497251.3)，其证实了食用菌多糖可以与乳清分离蛋白结合，然而多糖提取工艺复杂，对饮料这类快消品来说若可简化工艺有助于成本的降低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种发酵木耳乳清蛋白复合饮料的制备方法。
一种发酵型木耳乳清分离蛋白复合饮料的制备方法，包括步骤：
S1、原料预处理：取干木耳，打碎成粉进行40～60目过筛，得木耳粉；其中，所述干木耳符合GB/T6192-2019要求，耳正面黑褐色，有光泽，耳背面暗灰色，耳片完整且具有黑木耳特有的气味，无异味；
S2、浸提：将步骤S1所述木耳粉与纯净水按照质量比1:30～50，搅拌均匀，在温度为70～90℃加热2～4小时，然后冷却至室温，得木耳浸提混合物A；
S3、酶解：将步骤S2所述的木耳浸提混合物A中添加纤维素酶至纤维素酶的质量浓度为0.6％～0.8％，在温度为35～55℃酶解1～2小时，加热灭酶，得木耳浸提混合物B；所述纤维素酶的酶活为10000U/g；
S4、分离：将步骤S3所述木耳浸提混合物B离心取上清液，得木耳浸提液；
S5、浸提液发酵：向步骤S4所述木耳浸提液中加入其质量3％～6％的蔗糖，搅拌均匀后以106～107CFU/mL的接种量加入活化的植物乳杆菌，在35～38℃静置发酵18～24小时；待发酵完成后进行杀菌处理，然后将其迅速冷却回室温，得发酵液；
S6、调配：向步骤S5所述发酵液中添加其质量2％～4％的乳清分离蛋白，搅拌均匀后用柠檬酸缓冲液将pH调至4.5～4.8，得饮料；
S7、杀菌、罐装：将步骤S6所述饮料进行杀菌处理，然后罐装冷却，得成品。
优选方式下，步骤S3所述加热灭酶的具体条件为：90～100℃加热15～30min。
优选方式下，步骤S5所述杀菌处理具体为：85～95℃加热15～30min；申请号为201910025420.8的发明专利申请《一株植物乳杆菌及其在降低鱼茶生物胺含量中的应用》记载了一种植物乳杆菌Yc-2，保藏号为CGMCC No.16614，本发明涉及的植物乳杆菌可选用该发明所述的菌体。
优选方式下，步骤S7所述杀菌的条件为：85～95℃加热15～30min。
优选方式下，所述发酵型木耳乳清分离蛋白复合饮料的制备方法，包括步骤：
S1、原料预处理：选用无霉变，朵大体松，胶质肥厚，有光泽的优质干木耳，用破壁机将木耳打碎成粉状然后进行60目过筛，得木耳粉；
S2、浸提：将步骤S1所述木耳粉与纯净水按照质量比1:40，搅拌均匀，在温度为90℃的条件下水浴加热2小时，然后冷却回室温，得木耳浸提混合物A；
S3、酶解：在步骤S2所述的木耳浸提混合物A中添加纤维素酶，纤维素酶添加的质量浓度为0.8％，在温度为50℃的条件下酶解1小时，然后加热至100℃、15分钟灭酶，得木耳浸提混合物B；
S4、分离：将步骤S3所述木耳浸提混合物B在4℃条件下10000rpm离心10min取上清液，得木耳浸提液；
S5、浸提液发酵：向步骤S4所述木耳浸提液中加入其质量3％的蔗糖，搅拌均匀后，加入浓度为108CFU/mL的植物乳杆菌Yc-2，每100mL浸提液添加1mL菌液，在37℃发酵24小时；待发酵完成后在温度为85℃的条件下15分钟进行杀菌处理，然后将其迅速冷却回室温，得发酵液；
S6、调配：向步骤S5所述发酵液中添加其质量2％的乳清分离蛋白，搅拌均匀后用柠檬酸缓冲液将pH调至4.7，得饮料；经试验在pH4.7时木耳多糖可以与分离乳清蛋白很好结合；
S7、杀菌、罐装：将步骤S6所述饮料进行杀菌处理，杀菌条件85℃，杀菌15分钟，然后罐装、冷却，得成品。
如无特殊说明，所述室温为20～25℃。
本发明的有益效果是：
本发明是一种木耳饮料制备方法，饮用简单、营养丰富，适合各年龄段人群引用。将木耳和分离乳清蛋白按不同比例调配，利用木耳中木耳多糖可以与分离乳清蛋白结合而防止加热杀菌过程中分离乳清蛋白聚集沉淀的原理在不添加稳定剂的的条件下增大饮料中分离乳清蛋白浓度。此工艺获得的产品木耳的利用率高，制得的木耳饮料水溶性维生素和多糖含量高，口味柔和纯正，营养价值高，风味独特。
本发明提出一种新技术，一方面酶解后提高了2.5％mg/mL多糖的浸提率,效果显著；另一方面可使乳清分离蛋白与木耳多糖浸提液有效结合。此外，多糖与乳清蛋白的结合需要调配pH在4～5范围，本发明除了用木耳浸提液代替分离纯化木耳多糖，还在木耳浸提液中添加植物乳杆菌进行发酵产生乳酸，使其具有发酵食品的独特风味，可有效降低饮料的苦味和涩味，减轻木耳本身的木腥味；再将木耳浸提液与乳清分离蛋白调配成饮料，同样可以得到制备工艺简单，可工厂化，原料利用率高，营养丰富，具有优良口感的饮料。
本发明通过实验证明在不去除蛋白的的情况下木耳浸提液中的木耳多糖也可以与乳清分离蛋白结合，并优化了木耳浸提液制备方法。
附图说明
图1是本发明实施例1，酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后浸提液中总糖含量测定。(注：不同小写字母表示不同质量浓度纤维素酶对总糖含量测定有显著性的影响。(p<0.05))
图2是本发明实施例1，酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后去除纤维素酶影响后浸提液中总糖含量测定。(注：不同小写字母表示不同质量浓度纤维素酶对总糖含量测定有显著性的影响。
(p<0.05))
图3是本发明实施例1，酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后浸提液流变特性曲线。
图4是本发明实施例2，酶解时纤维素酶添加的质量浓度为0.8％分别酶解1h、2h、3h、4h后浸提液中总糖含量测定。(注：不同小写字母表示纤维素酶酶解不同时间对总糖含量测定有显著性的影响。(p<0.05))
图5是本发明实施例2，酶解时纤维素酶添加的质量浓度为0.8％分别酶解1h、2h、3h、4h后浸提液流变特性曲线。
图6是本发明对比例1，在pH4.7时含2％、3％、4％w/w分离乳清蛋白的对照组溶液的流变特性曲线。
图7是本发明对比例1，调配时添加2％、3％、4％w/w分离乳清蛋白后未加热组溶液的流变特性曲线。
图8是本发明对比例1，对照组溶液，未加热组溶液以及加热组溶液的ZETA电位。(注：不同大写字母表示不同加工方式对电位有显著性的影响；不同小写字母表示不同浓度乳清分离蛋白对电位有显著性的影响。(p<0.05))
图9是本发明对比例1，不添加木耳浸提液的乳清分离蛋白对照组溶液通过冷场扫描电镜拍摄的在放大倍率8000×时获得的微观结构图片。
图10是本发明对比例1，添加木耳浸提液的乳清分离蛋白，未加热组溶液通过冷场扫描电镜拍摄的在放大倍率8000×时获得的微观结构图片。
图11是本发明对比例1，添加木耳浸提液的乳清分离蛋白，加热组溶液通过冷场扫描电镜拍摄的在放大倍率8000×时获得的微观结构图片。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。
一种发酵型木耳乳清蛋白复合饮料的制备方法:
原料预处理：选择肉质肥厚，无杂质的高品质木耳。用破壁机将木耳打碎成粉状然后进行40～60目过筛。
热水浸提：将木耳粉与纯净水按照质量比1:30～50，搅拌均匀，在温度为70～90℃的条件下加热2～4小时，然后冷却回室温。
酶解：在冷却好的木耳浸提混合物中添加0.6％～0.8％纤维素酶，在温度为35～55℃的条件下酶解1～2小时，然后煮沸5～15分钟灭酶。
分离：将灭酶后的木耳浸提混合物离心分离后取的液体部分储存至容器中当做原料。
浸提液发酵：向木耳浸提液中加入3％～6％蔗糖，搅拌均匀后加入活化的植物乳杆菌在37℃发酵18～24小时。待发酵完成后在温度为85～95℃的条件下加热15～30分钟然后将其迅速冷却回室温进行杀菌处理。
调配：向灭菌后的发酵液中添加2％～4％分离乳清蛋白，搅拌均匀后用柠檬酸缓冲液将pH调至4.5～4.8。
杀菌、罐装：将调配好的饮料进行杀菌处理，杀菌条件85～95℃，杀菌15～30分钟，然后罐装冷却成品。
如无特殊说明，下述各例中使用的乳清分离蛋白：美国NOW集团生产的乳清分离蛋白，商品号为733739021748；下述各例中使用的纤维素酶，其酶活为10000U/g；植物乳杆菌为植物乳杆菌Yc-2，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.16614。
实施例1：
一种发酵型木耳乳清蛋白复合饮料的制备方法:
S1、原料预处理：选用无霉变，朵大体松，胶质肥厚，有光泽的优质干木耳，用破壁机将木耳打碎成粉状然后进行60目过筛，得木耳粉；
S2、浸提：将步骤S1所述木耳粉与纯净水按照质量比1:40，搅拌均匀，在温度为90℃的条件下水浴加热2小时，然后冷却回室温，得木耳浸提混合物A；S3、酶解：在步骤S2所述的木耳浸提混合物A中添加纤维素酶，纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％，在温度为50℃的条件下酶解1小时，然后加热至100℃、15分钟灭酶，得木耳浸提混合物B；S4、分离：将步骤S3所述木耳浸提混合物B在4℃条件下10000rpm离心10min取上清液，得木耳浸提液；
S5、浸提液发酵：向步骤S4所述木耳浸提液中加入其质量3％的蔗糖，搅拌均匀后，加入浓度为108CFU/mL的植物乳杆菌菌液，每100mL浸提液添加1mL菌液，在37℃发酵24小时；待发酵完成后在温度为85℃的条件下15分钟进行杀菌处理，然后将其迅速冷却回室温，得发酵液；
S6、调配：向步骤S5所述发酵液中添加其质量2％的乳清分离蛋白，搅拌均匀后用柠檬酸缓冲液将pH调至4.7，得饮料；经试验在pH4.7时木耳多糖可以与分离乳清蛋白很好结合；
S7、杀菌、罐装：将步骤S6所述饮料进行杀菌处理，杀菌条件85℃，杀菌15分钟，然后罐装冷却成品。
图1是本实施例酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后，步骤S4所述木耳浸提液中总糖含量测定；
因为纤维素酶的添加对实验中测量总糖含量数值有影响，对纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％的水溶液进行了总糖含量测定。图2是本实施例酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后经计算得出的去除纤维素酶影响后浸提液中总糖含量测定。
因为纤维素酶也含有糖对总糖含量有影响，所以需结合图1和图2在纤维素酶添加量质量浓度为0.8％时浸提液中总糖含量最高，相比较于未酶解时总糖含量提高2.5mg/mL，效果明显。
图3是酶解时纤维素酶添加的质量浓度分别为0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.2％酶解1h后浸提液流变特性曲线。不同纤维素酶添加量的酶解液在低剪切率0.005至0.05 1/S时黏度均为10Pa.s左右，变化不明显。
因此，步骤S2所述木耳浸提混合物A中添加纤维素酶至纤维素酶的质量浓度为0.6％～0.8％时，效果较优。
实施例2：
一种发酵型木耳乳清蛋白复合饮料的制备方法:
S1、原料预处理：选用无霉变，朵大体松，胶质肥厚，有光泽的优质干木耳，用破壁机将木耳打碎成粉状然后进行60目过筛，得木耳粉；S2、浸提：将步骤S1所述木耳粉与纯净水按照质量比1:40，搅拌均匀，在温度为90℃的条件下水浴加热2小时，然后冷却回室温，得木耳浸提混合物A；
S3、酶解：在步骤S2所述的木耳浸提混合物A中添加纤维素酶，纤维素酶添加的质量浓度为0.8％，在温度为50℃的条件下分别酶解1、2、3、4小时，然后加热至100℃、15分钟灭酶，得木耳浸提混合物B；
S4、分离：将步骤S3所述木耳浸提混合物B在4℃条件下10000rpm离心10min取上清储存至容器中，得木耳浸提液；
S5、浸提液发酵：向步骤S4所述木耳浸提液中加入其质量3％的蔗糖，搅拌均匀后加入浓度为108CFU/mL的植物乳杆菌菌液，每100mL浸提液添加1mL菌液，在37℃发酵24小时；待发酵完成后，在温度为85℃的条件下加热杀菌15分钟，然后将其迅速冷却回室温，得发酵液；
S6、调配：向步骤S5所述发酵液中添加其质量2％的乳清分离蛋白，搅拌均匀后用柠檬酸缓冲液将pH调至4.7，得饮料；经试验在pH4.7时木耳多糖可以与分离乳清蛋白很好结合；
S7、杀菌、罐装：将调配好的饮料进行杀菌处理，杀菌条件85℃，杀菌15分钟，然后罐装冷却成品。
图4是本实施例酶解时纤维素酶添加的质量浓度为0.8％分别酶解1h、2h、3h、4h后浸提液中总糖含量测定。不同酶解时间总糖含量没有明显差异。
图5是本实施例酶解时纤维素酶添加的质量浓度为0.8％分别酶解1h、2h、3h、4h后浸提液流变特性曲线。不同酶解时间木耳浸提液流变特性曲线中低剪切率时粘度均在7Pa.s左右，变化不大。本着时间节约原则，选取酶解1～2小时较为合适。
对比例1：
用以论证乳清分离蛋白可以与木耳浸提液相结合的实验样品制备方法:
S1、原料预处理：选用无霉变，朵大体松，胶质肥厚，有光泽的优质干木耳，用破壁机将木耳打碎成粉状然后进行60目过筛，得木耳粉；
S2、浸提：将步骤S1所述木耳粉与纯净水按照质量比1:40，搅拌均匀，在温度为90℃的条件下水浴加热2小时，然后冷却回室温，得木耳浸提混合物A；
S3、酶解：在步骤S2所述的木耳浸提混合物A中添加纤维素酶，纤维素酶添加的质量浓度为0.8％，在温度为50℃的条件下分别酶解1小时，然后加热至100℃、15分钟灭酶，得木耳浸提混合物B；
S4、分离：将步骤S3所述木耳浸提混合物B在4℃条件下10000rpm离心10min，取上清液，得木耳浸提液；
S5、制备乳清分离蛋白溶液：将乳清分离蛋白溶解于水中，室温下以200rpm搅拌3小时，其中蛋白质与水的质量比为1:10，然后在5℃过夜使蛋白充分水合，制得乳清分离蛋白溶液，备用。
S6、对照组溶液制备:取步骤S5所述乳清分离蛋白溶液，用水稀释，使乳清分离蛋白质量浓度分别为2％、3％和4％，将溶液pH值从7.0调节至4.7作为对照组溶液。
S7、制备乳清分离蛋白-木耳浸提液复合溶液：溶液总体积为10mL，其中含7mL步骤S4所述木耳浸提液(约含0.2％木耳多糖)，再添加步骤S5所述乳清分离蛋白溶液，加水，使乳清分离蛋白质量浓度分别为2％、3％和4％、混合溶液体积为10mL，将溶液pH值从7.0调节至4.7作为未加热组溶液。
S8、制备加热组溶液：先制备步骤S7所述未加热组溶液，在85℃条件下加热15min灭菌后作为加热组溶液。
图6是在pH4.7时添加2％、3％、4％w/w分离乳清蛋白(即步骤S6所述对照组)的流变特性曲线。对照组溶液的粘度剪切速率曲线在低剪切速率(<0.1s-1)下显示出明显的波动，说明对照组溶液在pH4.7时的分散性很差。
图7是调配时添加2％、3％、4％w/w分离乳清蛋白后未加热组溶液的流变特性曲线。相比较图6溶液的粘度剪切速率曲线在低剪切速率(<0.1s-1)下没有明显波动，说明溶液分散性得以改善。
图8是是对照组溶液，未加热组溶液以及加热组溶液的ZETA电位。当对照组溶液即乳清分离蛋白(WPI)的质量浓度从2％增加到4％时，ZETA电位均大于-15mV，添加浸提液溶液后(即未加热组溶液)，混合溶液的ZETA电位降低到-25mV以下。随着乳清分离蛋白质量浓度的增加，混合溶液的ζ电位从-31.13±0.32mV增加到-26.80±0.44。这可能是因为在添加带负电的木耳多糖之后，乳清分离蛋白表面的正电荷与其静电相互作用结合在一起，从而降低了混合溶液配合物的ZETA电位，使得溶液溶解性优良；在经过加热灭菌后(即加热组溶液)ZETA电位相比于未加热时变化不大，说明加热对混合溶液稳定性没有影响。
图9是中不添加木耳浸提液的乳清分离蛋白对照组溶液通过冷场扫描电镜拍摄的在放大倍率8000×时获得的微观结构图片。冻干后的乳清分离蛋白液滴内部不规则，主要呈球状结构。
图10和图11分别是添加木耳浸提液的乳清分离蛋白，未加热组溶液和加热组溶液通过冷场扫描电镜拍摄的在放大倍率8000×时获得的微观结构图片。复合溶液的冻干液滴的微观结构均呈片状结构，内部球状的蛋白质由丝状的木耳多糖相连，在片层中形成桥状结构，可能由于加热的原因，加热组的片状结构遭到了部分破坏，但没有影响丝状的木耳多糖与内部球状蛋白相连的结构，能说明木耳多糖可以增强乳清分离蛋白溶液稳定性，且经过加热处理仍可保持稳定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
