含有解脂亚罗酵母的饲料、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于动物饲料领域，更具体地，本发明涉及含有解脂亚罗酵母的饲料、其制备方法及其应用。
背景技术
动物饲料在畜牧生产中不可或缺，安全性良好的动物饲料是促进畜牧生产良性发展的因素之一。动物饲料通常包括蛋白质饲料、能量饲料、粗饲料、青绿饲料、青贮饲料、矿物质饲料和饲料添加剂。
按类别区分，动物饲料可以分为：全价料、浓缩料和预混料。全价料是由蛋白质饲料、能量饲料、粗饲料和添加剂四部分组成的配合料，市场上销售的全价料主要是经过机器加工制粒的颗粒状饲料，部分为膨化颗粒料，能直接用于饲喂饲养对象。浓缩料是由蛋白原料和添加剂预混而成，饲喂时需补加能量料，具有使用方便的优点，适合于规模大，尤其是自家有玉米等能量饲料的农户使用，目前市场上的浓缩料至少有50多种。预混料是添加剂预混合饲料的简称，是将一种或多种微量组分(包括各种微量矿物元素、各种维生素、合成氨基酸、某些药物等添加剂)与稀释剂或混合料按要求配比，均匀混合后制成的中间型配合饲料产品，是全价配合饲料的一种重要组分。
随着人们生活水平的提高，对于一些农场动物(例如猪等)的肉质要求越来越高，而通过改善饲料的配方能够解决一些这方面的需求，为动物提高更未均衡、合理的营养供给。
目前本领域中已经有一些以酵母为配方的动物饲料。但是，目前市面上常用于饲料的酵母主要是酿酒酵母、毕赤酵母、产朊假丝酵母、红发夫酵母等，它们的菌体都可以含有丰富的蛋白质和必需氨基酸，但是在脂肪和必需脂肪酸的含量方面却存在显著的不足，这就需要在用作饲料时，进一步添加鱼粉或油脂等，以保证饲喂动物的营养需要，这种添加提高了饲养成本，限制了其大规模的运用。
因此，本领域还需要开发改进的饲料，来提供营养更为全面的饲料，
发明内容
本发明的目的在于提供含有解脂亚罗酵母的饲料、其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备解脂耶罗酵母发酵产物的方法，所述方法包括：
(1)发酵培养解脂耶罗酵母，发酵过程中向发酵体系中流加碳源底物；其中，(a)所述的碳源底物为油脂底物，且控制脂肪酸总量在0.05％～2％(w/V)；或，(b)所述的碳源底物为产生乙酸根的底物，且控制乙酸根离子浓度在0.4～2g/L；
(2)发酵后，收集发酵沉淀，烘干获得解脂耶罗酵母发酵产物。
在一个优选例中，(a)中，控制脂肪酸总量在0.08％～1％；较佳地0.1％～0.8％。
在另一优选例中，(b)中，控制乙酸根浓度在1±0.5g/L；较佳地1±0.3g/L。
在另一优选例中，发酵培养解脂耶罗酵母时，初始培养基包含：酵母抽提物(或酵母膏)，硫酸镁，硫酸铵，磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾；较佳地，还包括微量元素；和/或所述的产生乙酸根的底物为乙酸钠、乙酸铵、乙酸。
在另一优选例中，含有：酵母抽提物(或酵母膏)0.5～5g/L，硫酸镁0.5～5g/L，硫酸铵1～30g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，和/或磷酸氢二钾1～5g/L。
在另一优选例中，微量元素包括：氯化铁，硫酸锰，硫酸锌，硫酸铜，硫酸钼。
在另一优选例中，所述的解脂耶罗酵母为解脂亚罗酵母CICC%2032291。
在另一优选例中，所述的解脂亚罗酵母发酵产物包括选自下组的产物：解脂亚罗酵母发酵液经部分脱水后获得的湿酵母，或经干燥脱水后获得酵母粉，或经油脂提取后获得的酵母粕。
在另一优选例中，(a)中，pH保持在7.5±0.3；较佳地，7.5±0.2或7.5±0.1。
在另一优选例中，(b)中，pH保持在6.5±0.3；较佳地，6.5±0.2或6.5±0.1。
在本发明的另一方面，提供一种解脂耶罗酵母发酵产物，其通过前面所述的方法制备获得；较佳地，所述的解脂亚罗酵母发酵产物包括选自下组的产物：解脂亚罗酵母发酵液经部分脱水后获得的湿酵母，或经干燥脱水后获得酵母粉，或经油脂提取后获得的酵母粕。
在一个优选例中，所述的解脂耶罗酵母发酵产物中，蛋白质含量丰富，脂肪含量丰富，酵母多糖含量丰富，氨基酸和必需氨基酸含量丰富，其中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量特别丰富。
在另一优选例中，所述的解脂耶罗酵母发酵产物中，脂肪酸含量丰富，其中不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸含量特别丰富。
在另一优选例中，发酵持续时间为24～120小时，如36、48、60、72、84、96、108小时等。
在本发明的另一方面，提供所述的解脂耶罗酵母发酵产物的用途，用于制备动物饲料或饲料添加剂。
在本发明的另一方面，提供一种动物饲料或饲料添加剂，其含有所述的解脂耶罗酵母发酵产物，以及食品学或饲料学上可接受的混合料；较佳地，所述的食品学或饲料学上可接受的混合料包括(但不限于)选自下组的材料：玉米粉，猪饲料预混料，玉米，麸皮，豆粕。
在本发明的另一方面，提供一种制备动物饲料的方法，所述方法包括：(i)将玉米粉与饲料预混料混合；(ii)将所述的方法制备获得的解脂耶罗酵母发酵产物与(i)的混合产物混合；(iii)将(ii)的混合产物与粗饲料混合。
在一个优选例中，(i)中，所述的玉米粉与饲料预混料混合时，按照重量比(1～10):1混合，较佳地按照(2～8):1混合，更佳地按照(3～7):1或(4～6):1混合。
在另一优选例中，(ii)中，解脂耶罗酵母发酵产物与(i)的混合产物混合时，按照重量比(1～5):(1～5)混合，较佳地按照(1～3):(1～3)混合，更佳地按照(1～3):(1～3)或(1～2):(1～2)混合。
在另一优选例中，(iii)中，将(ii)的混合产物与粗饲料混合时，按照重量比(2～15):1混合，较佳地按照(4～10):1混合，更佳地按照(5～8):1或(6～7):1混合。
在另一优选例中，所述的粗饲料包括但不限于：玉米、麸皮。
在另一优选例中，所述的饲料预混料包括但不限于：市售的用于猪、牛、鸡、鱼等的预混料。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新型的可应用于动物饲料的发酵产物，其主要通过解脂耶罗酵母(Yarrowia%20lipolytica或Saccharomycopsis%20Lipolytica)在适当条件下发酵后获得，其具有良好的营养组成。
基于本发明的新发现，提供一种制备解脂耶罗酵母发酵产物的方法，包括：(1)发酵培养解脂耶罗酵母，发酵过程中向发酵体系中流加碳源底物；其中，所述的碳源底物为油脂底物，且控制脂肪酸总量在0.05％～2％；或，所述的碳源底物为产生乙酸根的底物，且控制乙酸根浓度在0.4～2g/L；(2)发酵后，收集发酵沉淀，烘干获得解脂耶罗酵母发酵产物。
本发明确定了一种理想的利用解脂耶罗酵母进行发酵的方法，在本发明的一个优选实施例中，所述的解脂耶罗酵母为在中国工业微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CICC32291的菌株，其发酵产物呈现良好的营养组成，适用于饲料的制备。
在发酵开始后流加碳源底物，所述的碳源底物可以是：有机酸或有机酸盐、可挥发性脂肪酸或脂肪酸盐、甲醇乙醇等醇类、甲醛乙醛等醛类、甘油、植物油、动物油、废弃餐厨垃圾、石油、矿物油、烯烃等。也可以运用一些废弃的或常规菌难于利用的底物。
作为本发明的优选方式，所述的碳源底物为油脂底物或产生乙酸根的底物。当以油脂底物发酵时，较佳地，控制脂肪酸总量在0.05％～2％，更佳地控制脂肪酸总量在0.08％～1％，进一步地可以是0.1％～0.6％。当以乙酸根底物发酵时，较佳地，控制乙酸根浓度在1～2g/L，更佳地，控制乙酸根浓度在1±0.5g/L；进一步地可以是1±0.3g/L或1±0.2g/L。
作为本发明的优选方式，所述的解脂亚罗酵母发酵产物包括但不限于：解脂亚罗酵母发酵液经部分脱水后获得的湿酵母，或经干燥脱水后获得酵母粉，或经油脂提取后获得的酵母粕。从易于存储或加工的角度，较佳地为经干燥脱水后获得酵母粉。
在发酵起始时，发酵罐中装入初始发酵培养基。所述初始发酵培养基可以是适合酵母生长的常规酵母培养基，能够提供必要的菌株生长所需的组分。作为本发明的优选方式，发酵培养解脂耶罗酵母时，初始培养基包含：酵母抽提物(或酵母膏)，硫酸镁，硫酸铵，磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾；较佳地，还包括微量元素。例如，所述的培养基可以是如表1所示的配方，但也不限于此。
表1
作为本发明的优选方式，初始的发酵培养基中，还加入微量元素，较佳地，微量元素包括：氯化铁，硫酸锰，硫酸锌，硫酸铜，硫酸钼。例如，所述的微量元素可以是如表2所示的配方，但也不限于此。
表2
本发明的方法中，发酵持续时间为24～120小时，如36、48、60、72、84、96、108小时等。
本发明中，根据底物的不同pH有不同，pH的调节是依照在菌株自身最适的基础上根据底物的使用不同而调节。当底物使用油脂的时候为了能在弱碱性下更好的互溶而适当提高pH。
本发明还包括利用上述的方法发酵所获得的发酵产物。该发酵产物的蛋白质含量丰富，脂肪含量丰富，酵母多糖含量丰富，氨基酸和必需氨基酸含量丰富，其中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量特别丰富。同时，该发酵产物的脂肪酸含量丰富，其中不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸含量特别丰富。
本发明中，所述的“丰富”是显著丰富，其具有统计学意义上的特征，一般是指相应的营养成分含量高于市售同类产品5％以上；更佳地高10％以上，如高15％，20％，30％，50％，70％，90％或更高。
浓缩型的发酵产物中活性成分的含量较高，如30％-100wt％，而稀释型发酵产物和实际使用的发酵产物中活性成分含量较低，通常为0.00005-30wt％。此外，还可以包含其他合适的微量元素、稳定剂、粘合剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。
前述的发酵产物在经过适当的加工后，可以作为一种用于喂养动物的饲料添加剂或作为精饲料；或者，其可进一步地与食品学或饲料学上可接受的混合料或赋形剂等混合，制备动物饲料。所述动物饲料营养成分丰富。所述的适当的加工例如浓缩、干燥等。
因此，本发明还提供一种动物饲料或饲料添加剂，其包含有效量的前面所述的发酵产物，以及食品学或饲料学(包括肥料领域或农药学领域)上可接受的混合料。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或发酵产物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“食品学或饲料学上可接受的”的成分是适用于食品学或饲料用途而对动物没有过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，一些“食品学或饲料学上可接受的混合料”例如，但不限于：玉米粉，猪饲料预混料，玉米，麸皮，豆粕等。
本发明还提供了一种制备动物饲料的方法，所述方法包括：(i)将玉米粉与饲料预混料混合；(ii)将本发明制备获得的解脂耶罗酵母发酵产物与(i)的混合产物混合；盒(iii)将(ii)的混合产物与粗饲料混合。
本发明所述的发酵产物、含有该发酵产物以及食品学或饲料学上可接受的混合料的动物饲料，也可以被包含在一种包装(如盒或袋)中，以应用于生产或饲料供给。
本发明的有益效果是：
本发明解释揭示了解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)是一种富含蛋白质和必需氨基酸，以及脂肪和必需脂肪酸的酵母，其发酵产物中的蛋白质和必需氨基酸的含量与目前市面上常用于饲料的酵母品种相当，但脂肪和必需脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸的含量则要远远超过。
本发明的方法，能利用来源广泛、价格便宜的生产原料，除了使用常规发酵底物如葡萄糖，木糖，纤维素等为底物发酵制得以外，还可以使用废弃的或难于利用的有机酸或有机酸盐、可挥发性脂肪酸或脂肪酸盐、甲醇乙醇等醇类、甲醛乙醛等醛类、甘油、植物油、动物油、废弃餐厨垃圾、石油、矿物油、烯烃等。具有很大的饲料应用潜力。
同时，本发明的饲料，在提供饲喂动物所需的营养物质的同时，还可调理动物肠胃，增强动物免疫力，是一种天然成分，不会使动物产生耐受性，其优势是其它饲料成分不可比拟的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、以大豆油发酵生产单细胞蛋白饲料酵母粉
将解脂耶罗酵母CICC 32291(Yarrowia lipolytica)接入100mL种子培养基中进行发酵，以制备种子液。种子培养基通常为葡萄糖酵母蛋白胨培养基，其组成一般为：20％的葡萄糖、10％的酵母抽提物、20％的蛋白胨。发酵在摇瓶中进行，摇床转速通常在100～200rpm，温度为28℃。
获得种子液后，按照5％(v/v)的接种浓度接入5L发酵罐中进行培养，温度为28℃，初始搅拌转速为200rpm，初始通气量为1vvm，整个发酵过程通过设置搅拌转速和通气量保证溶解氧在20～60％之间。培养周期为72小时。其中，5L发酵罐的培养基为2L经121℃、30分钟高压灭菌的发酵液，pH为7.5。发酵液的组成为：酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵20g/L、磷酸二氢钾3g/L和磷酸氢二钾3g/L，以及微量元素：氯化铁的含量为0.01g/L，硫酸锰的含量为0.02g/L，硫酸锌的含量为0.02g/L，硫酸铜的含量为2mg/L，钼酸钠的含量为2mg/L。
发酵初始向发酵罐按照10g/L加入无菌大豆油，当取样检测总脂肪酸低于0.1％时，进行大豆油补料，控制脂肪酸总量在0.1％～0.3％之间，发酵开始后，使用25％的浓氨水自动流加调控，使pH保持在7.5。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀在80℃过夜烘干后称重，即得解脂亚罗酵母粉，测得发酵液中细胞干重为68g/kg。
粗蛋白的测定：
1.试样的消煮：称取试样0.5～1g(含氮量5-80mg)，放入消化管中，加入0.4g五水硫酸铜和6g硫酸钾混合催化剂、20ml浓硫酸，于420℃下在消煮炉上消化1h左右至溶液澄清，取出放凉后转置于凯氏定氮仪的消解管托盘上，将蒸汽管子插入消化管内并将管口抵住胶头，设定加酸量(硼酸)为25ml、加碱量(氢氧化钠)为50ml、蒸馏水量为20ml、蒸馏时间为400s(使吸收体积达到100ml为宜)，蒸馏结束后，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液需流入锥形瓶，取下冷凝管末端的锥形瓶，加溴甲酚绿-甲基橙指示剂5滴左右。
2.滴定：用0.1mol/L的标准盐酸溶液滴定上述溶液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
同时使用0.5g的蔗糖同上法做空白对照。根据计算，1g细胞干重中可以得到71.2％的粗蛋白。
实施例2、解脂亚罗酵母粉的制备2
按如下步骤来制备解脂亚罗酵母粉：
1)将解脂亚罗酵母CICC 32291菌液(Yarrowia lipolytica CICC 32291)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
2)再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
3)然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L；以及微量元素：氯化铁的含量为0.01g/L，硫酸锰的含量为0.02g/L，硫酸锌的含量为0.02g/L，硫酸铜的含量为2mg/L，钼酸钠的含量为2mg/L。pH值6.5，高温蒸汽灭菌。该发酵过程中，流加乙酸钠(CH3COONa)以补充酵母生长所必需的碳源，测定乙酸根的浓度来确定补加量，当乙酸根离子浓度低于1g/L时，流加乙酸钠溶液。
4)发酵结束后，发酵液以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后粉碎，即得解脂亚罗酵母粉。
实施例3、解脂亚罗酵母粉的制备3
主要步骤根据实施例3中所描述的方法，变化仅在于：
100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠15g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾3g/L，酵母膏0.6g/L，硫酸镁1g/L；以及微量元素：氯化铁的含量为0.02g/L，硫酸锰的含量为0.015g/L，硫酸锌的含量为0.015g/L，硫酸铜的含量为1.8mg/L，钼酸钠的含量为2.5mg/L。pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
该发酵过程中，流加乙酸钠(CH3COONa)以补充酵母生长所必需的碳源，测定乙酸根的浓度来确定补加量，当乙酸根浓度低于0.9g/L时，流加乙酸钠溶液。
实施例4、实施例1、2、3的解脂亚罗酵母粉的营养成分分析
购买鱼粉(国产鱼粉，山东顺源饲料)、大豆粕、玉米蛋白粉、啤酒酵母粉，与前述的自制解脂亚罗酵母粉一起进行营养物质分析，结果见表3。
表3、自制解脂亚罗酵母粉与几种市售饲料成分的营养物质分析
根据表3可见，自制解脂亚罗酵母粉中的蛋白质含量丰富，优于市售啤酒酵母粉和大豆粕，堪比市售鱼粉和玉米蛋白粉。
根据表3可见，自制解脂亚罗酵母粉中的脂肪含量丰富，优于市售大豆粕、玉米蛋白粉和啤酒酵母粉，堪比市售鱼粉。
根据表3可见，自制解脂亚罗酵母粉中的酵母多糖含量丰富；氨基酸和必需氨基酸含量丰富，其中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量特别丰富。
进一步地，对自制解脂亚罗酵母粉中的脂肪酸含量进行了分析，结果见表4。
表4、自制解脂亚罗酵母粉的脂肪酸含量分析
根据表4，自制解脂亚罗酵母粉的脂肪酸含量丰富，其中不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸含量特别丰富。
实施例5、动物喂食研究
按如下步骤使用自制解脂亚罗酵母粉和市售大豆粕(山东顺源饲料)对比饲喂中国瘦肉型30～60kg生长育肥猪：
1)饲喂前述制备的解脂亚罗酵母粉的实验组如下：
将市售玉米粉与中国瘦肉型30～60kg生长育肥猪市售预混料(山东顺源饲料)按重量比为5：1的比例混匀后制成干粉料；将上述制备的解脂亚罗酵母粉与上述干粉料按重量比为1：1的比例混匀后制成解脂亚罗酵母精料；将该解脂亚罗酵母精料与市售粗饲料(市售玉米和市售麸皮按重量比为45：7的比例混匀后制成)按重量比为48：52的比例混匀后制成最终的实验组日粮。
2)饲喂市售大豆粕的对照组：按照实验组日粮的配方，将所用的自制解脂亚罗酵母粉全部替换成市售大豆粕，制成最终的对照组日粮。
3)选取20头35kg左右的生长育肥猪作为实验动物，随机分为实验组和对照组，每组10头，分别饲喂实验组日粮和对照组日粮，预饲期为5天，实验期为35天，共40天，实验结果见表3。
自制解脂亚罗酵母粉(实验组)和市售大豆粕(对照组)对比饲喂中国瘦肉型30～60kg生长育肥猪的实验结果如表5。
表5
根据表5，对比饲喂实验显示，与大豆粕相比，解脂亚罗酵母能显著提高生长育肥猪的日增重，降低料肉比，可部分或全部替代大豆粕。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
