一种加快肉牛宰后成熟的方法
技术领域
本发明涉及一种加快肉牛宰后成熟的方法，具体涉及一种采用跟腱吊挂-颈臂束缚的方式加快肉牛宰后成熟的方法。
背景技术
肉类的食用品质决定了商品的价值，在肉的诸多品质因素中，嫩度是消费者最为关注的食用品质。牛肉嫩度低、产品间嫩度一致性差是当今肉类工业面临的两大主要问题，所以提高牛肉嫩度十分必要。影响嫩度的因素主要包括宰前因素(品种和基因型、动物性别和年龄、饲养与宰前管理等)与宰后因素(屠宰胴体加工中的肌肉pH值和温度下降速率、电刺激处理、胴体吊挂方式、肉的成熟和烹调方法等)，延长成熟时间可以解决中国牛肉嫩度差的问题。但是，成熟时间延长将大大增加企业生产成本，造成能量和资源的浪费。因此，如何快速提高牛肉嫩度，缩短牛肉成熟时间是中国肉类工业亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用跟腱吊挂-颈臂束缚的方式加快肉牛宰后成熟的方法，即在跟腱吊挂的基础上在牛前臂远端与牛颈部之间(通常选取牛寰椎与第二颈之间)加一径向拉力使之收紧，该处理方式能够抑制背最长肌在尸僵过程中收缩，使后腿和沿脊柱肌肉呈伸直并有轻微拉伸的状态，可以减少背最长肌肌肉收缩，增加肌节长度，减小肌纤维直径，产品嫩度好，提高肉嫩度的一致性。
具体地，本发明所提供的加快肉牛宰后成熟速度的方法，包括如下步骤：
采用跟腱吊挂-颈臂束缚的方式使牛肉成熟(排酸)，进而加快肉牛宰后成熟速度；
所述跟腱吊挂-颈臂束缚的方式指的是采用跟腱吊挂的方式吊挂牛半胴体，然后在前臂远端与牛颈部(通常选取牛寰椎与第二颈椎之间)之间施加径向拉力。
上述的方法中，所述径向拉力的大小可为10～50KG。
上述的方法中，所述肉牛宰后成熟速度指的是牛肉的嫩度增加的速度。
上述的方法中，所述吊挂时间为1h至21天。
跟腱吊挂为牛胴体的传统吊挂方式，这种吊挂方式使牛的半膜肌、半腱肌、股二头肌和背最长肌等后部肌肉在尸僵过程中处于相对游离和易于收缩变韧的状态，降低了骨骼对后腿和沿脊柱肌肉的限制作用。该吊挂方式对脊柱的拉伸较弱，脊柱呈弯曲状态，减弱了对背最长肌部位肉在僵直过程中收缩的抑制。本发明通过采用跟腱吊挂-颈臂束缚的方式解决了上述问题。
本发明考察了跟腱吊挂-颈臂束缚处理方式对肉牛宰后成熟速度的影响，选取6头年龄和活体质量相近的雄性新疆褐牛，屠宰后右侧半胴体采用常见跟腱吊挂成熟方式，左侧半胴体采用跟腱吊挂颈臂束缚技术处理成熟。分别于宰后1小时和72小时采样测定pH值、蒸煮损失率、剪切力、肌原纤维小片化指数等指标，并通过透射电镜、蛋白组学研究就其机理进行了研究。考察结果发现，采用跟腱吊挂-颈臂束缚方式处理的样本较对照样宰后3天的剪切力值显著降低，肌原纤维小片化指数明显上升；通过iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定0h和72h的不同吊挂方式的褐牛背最长肌的蛋白质共2608个，其BZC1VSBZC2、BZC3VSBZC4组间比较的差异表达蛋白分别有20个、12个。鉴定到的蛋白质进行功能注释大都是在细胞增殖、代谢活动、生物循环等方面；对组间比较的差异表达蛋白进行功能注释绝大多数都是能量转化、生物合成、信号转导机制等。所有鉴定到的蛋白质和组间比较差异表达蛋白质的GO、Pathway通路富集，其中有很多通路与本发明所涉及的肉嫩度相关。上述结果表明跟腱吊挂-颈臂束缚方式可以较大幅度地提高肉牛宰后成熟速度，缩短牛肉成熟时间，具有较高工业推广的价值。
附图说明
图1为不同吊挂方式和成熟时间下的牛肉背最长肌剪切力值(n＝6)。
图2为不同吊挂方式和成熟时间牛肉背最长肌纤维超微结构变化。
图3为蛋白质浓度标准曲线图。
图4为SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳检测结果。
图5为不同的吊挂方式和成熟时间比较的显著性差异蛋白分布图。
图6为所有鉴定到的蛋白KOG注释图。
图7为所有鉴定到的蛋白质GO注释。
图8为所有鉴定到的蛋白质Pathway注释。
图9为BZC1与BZC2组差异表达蛋白在生物学过程、细胞组分和分子功能的富集分析。
图10为BZC3与BZC4组差异表达蛋白在生物学过程、细胞组分和分子功能的富集分析。
图11为BZC1-BZC2差异蛋白Pathway分类上下调统计图。
图12为BZC3-BZC4差异蛋白Pathway分类上下调统计图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
1、材料与方法
1.1试验材料
牛肉样品取自新疆伊宁县伊新牛羊养殖专业合作社。
选取6头30月龄新疆褐牛公牛(活体质量为(566±32)kg)，屠宰分割后，右半胴体采用普通跟腱吊挂方式成熟，左半胴体采用颈臂束缚吊挂方式成熟，即在牛前臂远端和牛第一、二颈椎连接处施加30KG的径向拉力，分别在宰后1h和72h取背最长肌样品，按照各种具体指标检测要求处理、存贮样品。
试验试剂：氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化镁、叠氮化钠、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、氢氧化钠、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸铜、甲醇、乙醇、丙酮、高氯酸、戊二醛、醋铅、锇酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白BSA标准品。以上试剂除胰蛋白酶和牛血清白蛋白标准品为BR级外其他均为AR级。
1.2试验仪器
FJ200-S型高速均质机(北京维欣仪奥科技有限公司)；LG10-24A型高速离心机(北京京立离心机有限公司)；XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；H721型可见分光光度计(天津普瑞斯仪器有限公司)；TA-XT2i质构仪(英国Stable Micro System公司)；DK-S28电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；H-7500型透射电子显微镜(日本日立公司)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；高压灭菌锅(TOMY公司)；制冰机(
1.3试验方法
1.3.1pH的测定
参考GB9695.5-2008肉与肉制品pH值测定，称取4g肉样绞碎，溶于40ml0.1M的KCl溶液(7.5g氯化钾定容到1000ml)中，用20000r/min的均质器均质，磁力搅拌器边搅拌边测pH值。
1.3.2剪切力测定
参照张玉卿[张玉卿,.2015]方法。取背最长肌肉样，切取5cm×5cm×3cm的肉块，用蒸煮袋包裹密封后在80℃水浴中熟制，至中心温度达到70℃后取出肉块，自然冷却至室温(20℃)，每个温度每个时间点取6个样品，每个样品沿肌纤维方向用直径1.27cm取样器平行取3个肉柱，用质构仪测定其剪切力，结果取其平均值。
1.3.3蒸煮损失率测定
取出测定肉样后，称肉块质量W1后，肉块封口包装后，在80℃水浴中加热至肉块中心温度达到70℃，然后放于0～4℃过夜，用滤纸吸干肉块表面汁液，称肉块质量，记作W2；按公式计算蒸煮损失率(％)。
蒸煮损失率＝(W1-W2)/W1×100％
1.3.4肌原纤维小片化指数
参照黄明[黄明，2003]的测定方法：取背最长肌宰后0d和3d处理和未处理的肉样各适量，去除可见脂肪后精确称取2g，加入20mL预冷到2℃的MFI缓冲液(含100mmol/L KCl、11.2mmol/L K2HPO4、8.8mmol/L KH2PO4、1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、1mmol/LMgCl2和1mmol/L NaN3)，于匀浆器中高速匀浆3次，每次20s，中间间隔1min。匀浆液在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去上清液。沉淀中加入20mL缓冲液重新匀浆，再离心弃去上清液。沉淀中加入5mL缓冲液进行匀浆，用200目尼龙筛网过滤该悬浊液，去除结缔组织，再用5倍体积的缓冲液洗离心管并过滤，合并滤液，即为肌原纤维蛋白溶液。所得的肌原纤维蛋白悬浊液用双缩脲法测定其蛋白含量，然后用MFI缓冲液将其质量浓度调整至0.5mg/mL，在540nm下测定其吸光度，所得数值乘以200，即为肌原纤维小片化指数(MFI)。
1.3.5透射电镜观察微观结构
参考Li等(Li,et al.,2013)的方法并稍作修改。取宰后0d和3d处理和未处理的样品，用手术刀片切成3×1×1mm3的小条，用戊二醛固定液将肌肉组织固定4个小时以上。然后经过以下程序处理：
(1)样品的冲洗、固定、脱水、置换和浸透：戊二醛固定后，用0.1M磷酸缓冲溶液(pH7.4)冲洗2h。倒净清洗液，在通风处中，快速将1％锇酸倒至离心管至没过样品，并立刻盖好盖。轻轻振动样品，使样品固定充分，固定2h。然后用一系列浓度的乙醇溶液梯度脱水，每一梯度间隔6min。无水乙醇脱水后，用无水丙酮置换6次，每次3min，室温进行。然后用丙酮：树脂＝2:1比例配制的混合浸透液，在35℃恒温箱，浸透2h。用包埋液在35℃恒温箱浸透过夜。
(2)包埋：在2×4mm2的硫酸纸上写标签(需标明简单的样品名称及组织块号数)。把标签摆在包埋孔中，置于60℃烘箱烤15min后，取出后放置于40℃的温箱待用。然后在40℃恒温箱中包埋。
(3)聚合：样品包埋完后，放入烘箱进行聚合，聚合温度和时间为37℃、12h；45℃、12h；60℃、48h。
(4)修整组织块：将包埋块夹在样品夹头上，用单面刀片把包埋块的样品处修成四面锥体。后在解剖镜下，用双面刀片把包埋块顶部修成光滑的平面。
(5)切片与染色：用Leica UC6超薄切片机进行切片，再用醋酸铀染液和柠檬酸铅染液进行染色。最后，使用日立H-7500透射电子显微镜下观察和拍照。
(6)肌节长度的测定采用Image pro plus软件测定，每个样本至少选取7个视野下面60根肌纤维。
1.3.6iTRAQ实验流程
1.3.6.1蛋白提取
(1)称量适量样品到1.5ml离心管中；
(2)加入一颗5mm磁珠和适量Lysis Buffer 3，分别添加终浓度为1mM的PMSF，2mM的EDTA，涡旋振荡后静置5分钟，添加终浓度10mM的DTT；
(3)用组织研磨仪震荡2分钟(功率＝50HZ，Time＝120S)；
(4)(4)25,000g×4离心20分钟，取上清；
(5)加终浓度10mM DTT，56℃水浴1小时；
(6)恢复至室温后加入终浓度55mM IAM暗室静置45分钟；
(7)加入4倍体积冷丙酮，-20℃静置2h；
(8)重复步骤(7)两到三次，直至上清无色；
(9)25,000g×4离心20分钟，弃上清液；
(10)沉淀加入一颗5mm磁珠和适量Lysis Buffer 3；
(11)用组织研磨仪震荡2分钟(功率＝50HZ，Time＝120S)；
(12)25,000g×4离心20分钟后取上清液用于定量。
1.3.6.2蛋白提取质控
(1)Bradford定量
在96孔酶标板A1至A10位置依次加入标准蛋白(0.2μg/μl BSA)0，2，4，6，8，10，12，14，16，18μl，之后依次加入纯水20，18，16，14，12，10，8，6，4，2μl，之后各孔加入考马斯亮蓝G-250定量工作液180μl。用酶标仪测量OD595，依据OD595与蛋白浓度制作线性标准曲线。稀释待测蛋白质溶液若干倍，在20μl蛋白溶液中加入180μl定量工作液，读取OD595。依据标准曲线以及样品OD595计算样品蛋白浓度。
(2)SDS-PAGE
每样取30μg蛋白溶液加入适量loading buffer混匀后95加热5分钟，25,000g离心5分钟，取上清点入12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。120V恒压电泳120分钟；电泳结束后，考马斯亮蓝染色2小时，之后加入适量脱色液(40％乙醇10％乙酸)置于摇床脱色液3～5次，每次30分钟。
1.3.6.3蛋白酶解
(1)每个样品取100μg蛋白溶液；
(2)按蛋白:酶＝40:1的比例加入Trypsin酶2.5μg，37酶解4小时；
(3)按上述比例再补加Trypsin一次，37继续酶解8小时；
(4)酶解的肽段利用Strata X柱进行除盐，真空抽干。
1.3.6.4肽段标记
(1)根据样品数量，取出一定量iTRAQ标签试剂；
(2)待试剂恢复至室温后，每管试剂加入50μl异丙醇，涡旋震荡后低速离心；
(3)用0.5M TEAB溶解肽段样品，并加入到对应ITRAQ标签试剂中。不同样品肽段选用不同的iTRAQ标签；
(4)室温静止2小时。
1.3.6.5肽段分离
采用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为5um 4.6×250mm Gemini C18柱对样品进行液相分离。用2mL流动相A(5％ACN pH9.8)复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/分钟的流速梯度洗脱：5％流动相B(95％ACN，pH9.8)10分钟，5％至35％流动相B40分钟，35％至95％流动相B 1分钟，流动相B持续3分钟，5％流动相B平衡10分钟。在214nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集一个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到20个组分，然后冷冻抽干。
1.3.6.6高效液相
将抽干的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(75um内径，3um柱料>粒径，25cm柱长)串联，以300nl/min流速通过如下有效梯度进行分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-45min，流动相B从5％线性升至25％；45-50min，流动相B从25％升至35％；50-52min，流动相B从35％升至80％；52-54min，80％流动相B；54-60min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。
1.3.6.7质谱检测
经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HFX(ThermoFisher Scientific,San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为2kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到5+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6,二级1E5。质谱结束，得到原始数据，进行数据处理和生物信息学分析。
1.3.6.8蛋白质鉴定
Mascot是蛋白质组学领域重要的鉴定软件，使用广泛，该项目中使用的软件版本为Mascot2.3.02。原始质谱数据通过thermo scientific工具Proteome Discoverer转成MGF格式,之后转好的MGF文件经过鉴定软件Mascot和选好的蛋白质序列数据库比对搜索得到最终的蛋白鉴定结果。最终选定的可信蛋白必须包含至少一个可信的特异性(Unique)肽段，具体搜索参数如下：
表1-1 Mascot搜索参数
1.3.6.9蛋白质iTRAQ定量
ITRAQ数据的定量采用华大自主研发的IQuant软件，该软件整合了MascotPercolator算法，该算法采用机器学习算法自动对数据库搜索结果进行重新打分，从而提高结果的鉴定率。首先在谱图/肽段水平进行1％FDR的过滤(PSM-level FDR<＝0.01)，从而获得显著性鉴定的谱图和肽段列表。接着基于“简约原则”(The parsimony principle)，利用肽段进行蛋白组装，并产生一系列的蛋白组。为了控制蛋白的假阳性率，流程还会在蛋白水平上以FDR1％再次进行过滤(Protein-level FDR<＝0.01)，所使用策略为Pickedprotein FDR。IQuant的工作流程主要包括以下几个步骤:蛋白质过滤,报告基团标签纯度校正，定量值归一化，缺失值补全，蛋白定量值计算，统计检验分析，最终结果展示。
下面的表格中包含了主要的IQuant定量参数：
表1-2 IQuant定量参数
1.3.6.10差异蛋白GO富集分析
在差异蛋白的GO富集分析中，通过显著差异蛋白和作为背景的全体鉴定蛋白相比，利用超几何检验找出显著富集的GO条目；差异蛋白的Pathway富集分析原理类似于此。超几何检验的公式如下：
上式中，N表示所有鉴定到蛋白中能匹配到GO条目的数目；n表示显著差异蛋白中能匹配到GO条目的数目；M表示所有鉴定到蛋白中能匹配到某个GO条目的数目；m表示显著差异蛋白中能匹配到某个GO条目的数目。如果超几何检验的Pvalue值小于0.05，代表差异蛋白在该GO条目显著富集。
1.4数据处理与统计分析
(1)采用SPSS 20.0及Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示；对各项指标进行Duncan’s分析，采用SPSS皮尔逊(Pearson)法进行相关性分析。
(2)质谱数据转化软件：ProteoWlzard
(3)蛋白质比对软件：Mascot2.3.02
(4)Pathway分析数据库：KEGG Pathway Database
(5)GO分析工具：AmiGO
(6)NCBInr
(7)UniProt
2、结果与分析
2.1吊挂方式和成熟时间对牛背最长肌pH值的影响
如表2-1所示，在宰后1h内，颈臂束缚吊挂技术和前普通跟腱吊挂技术差异显著，可能在捆绑过程中有时间的延误，造成pH差异显著。成熟至72h，2种吊挂方式对牛肉背最长肌pH值没有显著影响。
表2-1不同吊挂方式和成熟时间下牛肉背最长肌的pH值
注：A，B：表示不同成熟时间处理差异达显著水平(P＜0.05)；a，b：表示不同吊挂方式处理差异达显著水平(P＜0.05)，下表相同。
2.2吊挂方式和成熟时间对牛背最长肌剪切力值的影响
如图1所示(图中，*表示两种吊挂方式在P＜0.05水平差异显著)，在新疆褐牛宰后1h内，虽然2种吊挂方式剪切力不存在显著差异(P＞0.05)，但是通过颈臂束缚吊挂的牛肉样品剪切力值低于普通跟腱吊挂的牛肉样品剪切力值1.05kg，成熟时间到72h时，2种吊挂方式剪切力存在显著性差异(P＜0.05)，这说明跟腱吊挂-颈臂束缚方式能够显著提高宰后72h内的牛肉嫩度，是一种牛肉快速成熟技术。
2.3吊挂方式和成熟时间对牛背最长肌蒸煮损失的影响
如表2-2所示，吊挂方式和成熟时间对牛肉背最长肌蒸煮损失没有显著影响(P＞0.05)。
表2-2不同吊挂方式和成熟时间牛肉背最长肌蒸煮损失
2.4吊挂方式和成熟时间对牛背最长肌中MFI变化
肌原纤维断裂成小片段的现象是导致肌肉自溶和肉质变嫩的直接原因，所以MFI被认为是衡量肉嫩度的重要指标。MFI可以反映肌细胞内部肌原纤维及骨架蛋白完整的程度，MFI越大，肌原纤维内部结构完整性受到破坏的程度越大，肌肉成熟度越高。如表2-3所示，宰后1h内颈臂束缚吊挂的MFI值与普通跟腱吊挂的MFI值差异不显著(P＞0.05)，而宰后72h颈臂束缚吊挂的MFI值与普通跟腱吊挂的MFI值差异显著(P＜0.05)，说明颈臂束缚吊挂方式加速了的牛背最长肌的嫩化。0d和72h的MFI值差异性显著，说明随着成熟时间的延长，肌原纤维裂解程度逐渐变大。
表2-3不同吊挂方式和成熟时间牛肉背最长肌肌原纤维小片化指数比变化
2.5吊挂成熟过程中肌纤维超微结构变化
超微结构能够直接观察宰后吊挂成熟过程中肌原纤维的形态变化。宰后1h时，颈臂束缚吊挂处理组和普通跟腱吊挂处理组肌原纤维结构清晰可见，肌原纤维紧密相连，亮带、暗带、M线、Z线和H区完整，未发现断裂现象。宰后72h时，普通跟腱吊挂处理组出现不规则形变，开始出现几个相连肌节被降解的现象，Z线降解较为明显，部分区域出现了拉伸带和痉挛带。宰后72h的颈臂束缚吊挂处理组的肌节间隙明显变宽，肌原纤维发生大面积破坏、溶解，肌原纤维结构被严重破坏，如图2所示。
2.6样品蛋白质的提取与质检
2.6.1样品蛋白质浓度检测结果
蛋白质浓度标准曲线如图3所示。
样品蛋白质浓度如表2-4所示。
表2-4样品蛋白质浓度
SDS-PAGE电泳检测结果如图4所示，其中，分离胶的浓度为12％，Marker上样量10微克，全部上样量为20微克。
2.6.2数据质量评估
在该蛋白质iTRAQ定量项目中，共有4组Bovine样品，分别为：BZC1、BZC2、BZC3、BZC4，共进行了1次重复实验，共有892027张二级谱图生成下机。在“1％FDR”过滤标准下，一共有15309条肽段和2608个蛋白被鉴定，如表2-5所示。
表2-5蛋白质鉴定数据
2.6.3蛋白质的定量结果
2.6.3.1组间比较分析结果
本发明中，BZC1/BZC2、BZC3/BZC4、BZC1/BZC3、BZC2/BZC4被设置为比较组。单次实验的显著差异蛋白以Fold change>1.2和Q-value<0.05两个条件筛选。对多次重复实验数据来说，最终差异蛋白需至少在1次重复数据中被定义为差异蛋白。BZC1是宰后1h普通跟腱吊挂处理组，BZC2是宰后1h颈臂束缚吊挂处理组，BZC3是宰后72h普通跟腱吊挂处理组，BZC4是宰后72h颈臂束缚吊挂处理组。如表2-6所示，普通跟腱吊挂处理组和颈臂束缚吊挂处理组在宰后1h上调蛋白3个，下调蛋白17个；宰后72h上调蛋白11个，下调蛋白1个。
不同的吊挂方式和成熟时间比较的显著性差异蛋白分布图如图5所示。
表2-6不同吊挂方式和成熟时间下比较结果
2.6.4蛋白注释分析结果
2.6.4.1蛋白KOG注释分析
差异蛋白KOG注释是将各比较组差异蛋白注释到的条目单独提取出来，并绘制柱状图来展示，可以更清楚的了解差异蛋白对应的功能分类，如图6所示。
2.6.4.2蛋白GO注释分析
所有鉴定到的蛋白质与NR数据库比对后，得到相应的GO功能信息，GO功能分为细胞组分(Celluar Component)、分子功能(Molecular Funtion)、生物过程(BiologicalProcess)根据比对上的GO功能信息进行整合汇总。由图7可以看出，所有鉴定到的蛋白质GO注释主要在生物过程(Biological Process)和细胞组分(Celluar Component)两个方面居多。
2.6.4.3蛋白Pathway注释
如图8所示，X轴代表蛋白注释数目，Y轴代表KEGG功能分类。KEGG代谢通路共分为7个分支：细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental InformationProcessing)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、人类疾病(HumanDiseasea)(仅限动物)、代谢(Metabolism)、有机系统(Organismal Systems)、药物开发(Drug Development)。
2.6.5差异表达蛋白通路富集
2.6.5.1差异蛋白GO分析
如图9和图10所示，将颈臂束缚吊挂和普通跟腱吊挂作为比较得到的差异表达蛋白分别进行GO通路富集分析，以q-value＜0.05阈值标准筛选显著性富集通路，两个比较组(1h颈臂束缚吊挂对1h普通跟腱吊挂，72h颈臂束缚吊挂对72h普通跟腱吊挂)显著性富集GO通路分别为：138条和94条，其中显著的通路有：纤维蛋白原复合体(fibrinogen complex)、G蛋白偶联受体结合(G-protein coupled receptor binding)、肽酶抑制剂活性(peptidase inhibitor activity)、肽酶调节剂活性(peptidase regulator activity)、磷脂结合(phospholipid binding)、血小板活化(platelet activation)、类固醇代谢过程(steroid metabolic process)、胆固醇代谢过程(cholesterol metabolic process)、激素代谢过程(hormone metabolic process)、调节蛋白质磷酸化(regulation of proteinphosphorylation)、蛋白质磷酸化的正调节(positive regulation of proteinphosphorylation)、调节蛋白质代谢过程(regulation of protein metabolic process)、磷酸盐代谢过程的积极调节(positive regulation of phosphate metabolic process)、蛋白质代谢过程的积极调节(positive regulation of protein metabolic process)、酶联受体蛋白信号通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路(transmembrane receptor protein serine/threoninekinase)。
2.6.5.2差异蛋白Pathway通路富集
将不同吊挂方式比较得到的显著性差异蛋白对KEGG Pathway数据库中，得到各比较组，数据库中，得到各比较组的Pathway通路，同GO通路富集的方法，以p-value＜0.05阈值标准筛选显著性富集的Pathway通路。如图11和图12所示，两个比较组的Pathway通路分别是：47条和42条。Pathway显著富集则分别是：9条和18条。其中显著的通路有：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)、维生素消化吸收(Vitamindigestion and absorption)、脂肪消化吸收(Fat digestion and absorption)、蛋白质消化吸收(Protein digestion and absorption)、松弛素信号通路(Relaxin signalingpathway)、血小板活化(Platelet activation)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、ECM-受体相互作用(ECM-receptorinteraction)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)等。
由上述实验可以得出如下结论：
(1)通过颈臂束缚吊挂方式，其牛背最长肌的剪切力值在宰后1h和72h都显著低于普通跟腱吊挂方式的剪切力，72h时的颈臂束缚吊挂方式的肌原纤维小片化指数数值显著高于普通跟腱吊挂方式的数值，说明跟腱吊挂-颈臂束缚的吊挂方式加快了的牛背最长肌的嫩化。
(2)通过超微结构观察到宰后吊挂成熟过程中肌原纤维中，跟腱吊挂-颈臂束缚的吊挂方式处理的肌节长度较普通跟腱吊挂方式处理的肌节长度较长，跟腱吊挂-颈臂束缚吊挂处理组的降解情况更为明显。
(3)通过iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定0h和72h的不同吊挂方式的褐牛背最长肌的蛋白质共2608个，其BZC1VSBZC2、BZC3VSBZC4组间比较的差异表达蛋白分别有20个、12个。鉴定到的蛋白质进行功能注释大都是在细胞增殖、代谢活动、生物循环等方面；对组间比较的差异表达蛋白进行功能注释绝大多数都是能量转化、生物合成、信号转导机制等。所有鉴定到的蛋白质和组间比较差异表达蛋白质的GO、Pathway通路富集，其中有很多通路与本研究主要的肉嫩度相关。
