一种高GABA含量、高蛋白的发芽糙米面包的制备方法
技术领域
本发明属于糙米面包制备技术领域，具体涉及一种高GABA含量、高蛋白的发芽糙米面包的制备方法。
背景技术
萌芽留胚糙米主要由幼芽和带种皮的胚乳构成，是一种具有全营养概念和特殊营养价值的功能性主食。糙米经过发芽之后，其内糠层纤维得到了一定的软化，从而使得糙米的蒸煮、口感和消化性得到了很大的改善。发芽糙米最高起源于日本，并将发芽糙米称为“营养丸”、“神农米”、“元气米”。
日本科学家认为，在21世纪，发芽糙米将在增进人体健康，防治疾病等方面发挥有益作用。我们国家在研究萌芽留胚糙米方面开始比较晚，所以在生产方法和市场营销方面经验欠缺；但是因为我国经济发展较快，人们追求健康的脚步也越来越快，所以萌芽糙米在不久的将来有望成为人们餐桌主要的食物原料之一。
糙米在浸泡发芽过程中，内源性酶被生产或激活，淀粉及蛋白质等主要大分子成分发生降解，产生一些次生代谢物，如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)和酚醛物质，使营养价值得到大大提升。糙米经发芽处理后，多种功能性成分也显著增加，其中最主要成分有 GABA、γ-谷维素、谷胱甘肽、六磷酸肌醇、膳食纤维等。糙米经发芽后总淀粉和直链淀粉含量明显降低，氨基酸总量显著提高，GABA含量明显增加。Komatsuzaki等发现在96h的发芽过程中，GABA的含量从6.04mg/100g上升至149mg/100g。研究发现发芽糙米具有的降血脂和降血压功效与其富含的生理活性成分，如GABA，膳食纤维，γ-谷维素及其它抗氧化成分有关。糙米发芽后增加了不溶性但可被水解的酚类成分，有利于减少癌症的发病率。除此之外，发芽糙米还具有降低心血管疾病发生率、改善记忆、预防老年痴呆症、调节情绪等功效。
目前已经知道一种富含γ-氨基丁酸(GABA)发芽糙米生产方法，例如专利文献1主要包括选料、灭菌、浸泡、发芽、出料和烘干等工序，生产富含有GABA、六磷酸肌醇(IP～6)、谷胱甘肽(GSH)、膳食纤维和抗氧化物质等功能性成分的发芽糙米。该文献在灭菌阶段使用臭氧灭菌，安全无残留；浸泡阶段使用经过臭氧灭菌的水，保证了产品的安全、无毒。所涉及的糙米发芽生产方法具有成本低、操作简单、易于大规模生产等优点，并且将色泽棕黄、口感不佳的糙米生产成富集GABA的发芽糙米。还有通过浸泡，冷冻和解冻过程增加谷物种子中γ－氨基丁酸含量的方法，例如专利文献2。关于使谷粒中富集γ－氨基丁酸的方法，例如专利文献3，将水份已预先调整成10-15％的干燥谷粒，以0.5-2.0％/小时的加水速度进行缓慢的加水，使其水份成为20-30％的范围，再将此谷粒倒入槽中，进行2-15小时的调质。但是均没有系统性的提出将软米或者谷物进行发芽方法，而且还有一些传统性技术问题有待解决，我们将在说明书后面的部分进行说明。
专利文献1一种富含γ-氨基丁酸发芽糙米生产方法CN201210336639.8；
专利文献2用于提高大豆种子中γ-氨基丁酸含量的方法CN200580024259.9；
专利文献3使谷粒中富集γ－氨基丁酸的方法及用该方法得到的谷物200480021582.6
发明内容
本发明的目的在于提供一种高GABA含量、高蛋白的发芽糙米面包的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种高GABA含量、高蛋白的发芽糙米面包的制备方法，包括如下步骤：
(1)培育富含GABA的糙米；
(2)对糙米进行发芽处理；
(3)对糙米进行烘干处理；
(4)将烘干后的糙米粉碎成糙米粉并过60目筛；
(5)将过筛后的糙米粉进行挤压膨化处理；
(6)对挤压膨化处理后的糙米粉进行糖化处理；
(7)将糖化处理后的糙米粉与火麻粉进行混合得到火麻糙米粉；
(8)混合后的火麻糙米粉进行第一阶段发酵；
(9)对经过第一阶段发酵后的火麻糙米粉进行第二阶段发酵；
(10)经过二次发酵后的火麻糙米粉进行成型、醒发后烘烤成发芽糙米面包。
所述的培育富含GABA的糙米，将经过清理并分级后的稻谷，用蒸馏水清洗二次，依次用去离子水和质量分数为2％的双氧水溶液在26℃下浸泡9h，浸泡液与稻米的质量比为3：1。
所述的对糙米进行发芽处理，包括如下步骤：
(2.1)将糙米用浓度为3％的次氯酸钠溶液浸泡20min进行消毒；
(2.2)用去离子水冲洗三次沥干；
(2.3)将糙米在10℃条件下处理4h，20℃回温20min后，在30℃、50kHz、功率40％超声处理15min后用37℃第一营养液浸泡2h；所述的第一营养液条件为2mmol/L的Ca2+浓度，pH为6；
(2.4)在糙米发芽机内第二营养液37℃条件下对糙米发芽4-6D，每隔6h更换一次第二营养液，至糙米胚芽在5-10mm时发芽结束；所述的第二营养液为：3mM Ca2+，pH值自然；
(2.5)将发芽糙米取出后，用蒸馏水冲洗二次沥干，冷冻干燥至水分含量小于10％，过100目筛，得到发芽糙米，在10℃条件储藏。
所述的第一营养液和第二营养溶液中添加有碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铍、碳酸镁、碳酸钙、碳酸锶、碳酸钡和氨基碳酸盐中至少一种物质，碳酸氢根离子浓度为0.020-0.15mol/l；通过基准测量法得到的发芽糙米的谷氨酸含量为1250-1300mg/kg，得到的发芽糙米的GABA 含量提高到发芽前的糙米的2.5-4倍；含量为300-880mg/kg。
在(2.4)中，每5h喷浓度为130mM的NaCl溶液在糙米上，同时低氧通气胁迫处理，通气量为1.2L/min，平均溶氧浓度为6.25mg/L，GABA含量为600-900mg/kg。
所述的将烘干后的糙米粉碎成糙米粉的过程中加蛋白酶水解发芽糙米的米胚蛋白，同时加谷氨酸脱羧酶、标准氨基酸，提高GABA含量。
所述的粉碎过程中加入乙醇，粉碎后通过滤纸过滤，然后对发芽糙米粉进行干燥；通过控制加入乙醇后的混合物溶液的浓度、温度、时间条件控制GABA结晶参数，得到富含GABA 晶粒的发芽糙米粉。
所述的控制加入乙醇后的混合物溶液的浓度、温度、时间条件控制GABA结晶参数包括：
GABA晶体成核速率为：
A为GABA晶体成核速率(#·ml-1·s-1)，kt为GABA晶体成核速率常数(#·ml-1·s-1)， Mx为GABA晶体悬浮密度(g·ml-1)，α为悬浮密度指数因子，β为搅拌速度指数因子，ωr为混合物溶液的搅拌速度(r·s-1)，Q为溶液过饱和比，Υ0为GABA晶体成核过饱和度指数因子，xc为乙醇摩尔分数(mol·mol-1)，Bt为GABA晶体成核自由能(J·mol-1)，Ry为气体常数(J·mol-1·K-1)，T为热力学温度；
GABA晶体生长速率为：
B为GABA晶体生长速率(cm·s-1)，ks为GABA晶体生长速率常数(cm·s-1)，Bs为GABA晶体生长自由能(J·mol-1)，Z0为GABA晶体生长过饱和度指数因子；
GABA晶体结晶粒数为：
n为GABA晶体粒数密度(#·ml-1·cm-1)，V为溶液体积(ml)，l为GABA晶体粒度(μm)， t为GABA结晶时间；
GABA晶体单一晶粒的质量变化率为：
dMd＝2.67ρgkvl2dl
ρg为GABA晶体密度，kv为GABA晶体的体积形状因子。
所述的挤压膨化处理包括：物料含水量11％、螺杆频率21Hz、喂料频率29Hz和膨化温度95℃。
所述的糖化处理包括如下步骤：
(6.1)称取对挤压膨化处理后的糙米粉，每份1000g；
(6.2)用浓度为90％的乙醇溶液浸泡脱脂，并用磁力搅拌器持续搅拌20min，然后用转速为5000r/min的离心机离心30min，去掉上清液，收集沉淀得到脱脂粉末；
(6.3)重复步骤(6.2)四次以上；
(6.4)用800ml的蒸馏水在室温下对脱脂粉末进行抽提，并不断搅拌2h，用转速5000r/min 的离心机离心40min，收集上清液；
(6.5)重复步骤(6.4)3次以上，合并上述所有上清液，再减压浓缩，得到糙米粉提取浓缩液；
(6.6)加入缓冲溶液和抑菌剂甲苯，调节浓缩液的pH值在5.5-6之间，温度控制在32-35℃之间，升温灭酶后，用透析袋进行72h流水透析，除去小分子杂质色素，将透析袋内液进行冷冻干燥，得到干燥品粗多糖。
所述的第一次发酵和第二次发酵包括，在火麻糙米粉中加入碱性蛋白酶，在温度60±2℃调节pH值为9-10，加酶量为火麻糙米粉的4±0.3％，料液比为1:4.5，时间为3±0.5h的条件进行酶解，然后加入米曲霉进行第一次发酵，发酵时间3h；所述的碱性蛋白酶，是固态化的碱性蛋白酶，达到第一次发酵时间后，再加入木瓜蛋白酶，在温度70-80℃，加酶量0.4-0.6％，进行第二次酶解，1-2h后，高温灭酶，冷却，然后加入长双歧杆菌1g、大豆低聚糖溶液3ml，进行第二次发酵，发酵时间3h。
碱性蛋白酶的制作步骤如下：首先使用PH值为6.5的磷酸溶液配置15ml琼脂糖的质量分数为3％的琼脂糖-磷酸溶液；在微波条件下沸腾5min以上，然后冷却至室温，加入60g/L 的碱性蛋白质酶溶液2ml，冷却至13-16℃呈凝胶状，切割成1cm*1cm小块，3-7℃保存为固态化的碱性蛋白酶。
木瓜蛋白酶的制作步骤如下：首先使用PH值为7.5的磷酸溶液配置15ml琼脂糖的质量分数为3％的琼脂糖-磷酸溶液；在微波条件下沸腾5min以上，然后冷却至室温，加入65g/L 的碱性蛋白质酶溶液2ml，冷却至10-14℃呈凝胶状，切割成1cm*1cm小块，2-5℃保存为固态化的木瓜蛋白酶。上述固态化材料在切割成1cm*1cm小块后，低温保存之前向碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶加入质量分数为0.15％的1,2,3,4,5-戊五醇溶液作为保护剂，浸泡5min以上。
本发明的有益效果在于：
本发明的面包既有GABA的保健性，加入火麻粉增加了面包蛋白含量，增强韧性，增加口感，方便成型，并且补充发芽糙米蛋白含量低的缺点，使面包具有独特香味。
附图说明
图1为本发明方法流程图；
图2为本发明次氯酸钠溶液效果图；
图3为本发明GABA浓度变化曲线；
图4为本发明GABA晶体成核速率曲线；
图5为本发明GABA晶体生长速率曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述。
如图1所示，是本发明方法的步骤示意图，本发明采用生物工艺，采用先进设备将糙米进行精心培养，待糙米胚芽萌发到最佳程度，让保留的糙米生理层与胚芽再通过加工工艺制成一种高GABA含量、高蛋白的发芽糙米面包，本发明的技术主旨是在生理活性工艺条件下，将糙米的活性激活和释放，并使各种营养成分从结合状态转化为游离态的过程，其易烹调、易吸收，无添加的发芽糙米面包，包括如下步骤：(1)培育富含GABA的糙米；(2)对糙米进行发芽处理；(3)对糙米进行烘干处理；(4)将烘干后的糙米粉碎成糙米粉并过60目筛；(5)将过筛后的糙米粉进行挤压膨化处理；(6)对挤压膨化处理后的糙米粉进行糖化处理；(7)将糖化处理后的糙米粉与火麻粉进行混合得到火麻糙米粉；(8)混合后的火麻糙米粉进行第一阶段发酵；(9)对经过第一阶段发酵后的火麻糙米粉进行第二阶段发酵；(10)经过二次发酵后的火麻糙米粉进行成型、醒发后烘烤成发芽糙米面包。所述的培育富含GABA的糙米，将经过清理并分级后的稻谷，用蒸馏水清洗二次，依次用去离子水和质量分数为2％的双氧水溶液在26℃下浸泡9h，浸泡液与稻米的质量比为3：1。
所述的对糙米进行发芽处理，包括如下步骤：(2.1)将糙米用浓度为3％的次氯酸钠溶液浸泡20min进行消毒；(2.2)用去离子水冲洗三次沥干；(2.3)将糙米在10℃条件下处理4h， 20℃回温20min后，在30℃、50kHz、功率40％超声处理15min后用37℃第一营养液浸泡 2h；所述的第一营养液条件为2mmol/L的Ca2+浓度，pH为6；(2.4)在糙米发芽机内第二营养液37℃条件下对糙米发芽4-6D，每隔6h更换一次第二营养液，至糙米胚芽在5-10mm时发芽结束；所述的第二营养液为：3mM Ca2+，pH值自然；(2.5)将发芽糙米取出后，用蒸馏水冲洗二次沥干，冷冻干燥至水分含量小于10％，过100目筛，得到发芽糙米，在10℃条件储藏。
本发明首先使用了次氯酸钠对糙米进行浸泡不仅能够给软米消毒，如图2所示，我们发现随着次氯酸根浓度的进一步增加，发芽糙米中GABA的含量呈现下降趋势，这是因为在浸泡中添加一定浓度的次氯酸根促进了GABA的产生，因为次氯酸根能活化GAD，刺激酶活性，从而促进谷氨酸转化为GABA，达到增加GABA含量的目的。随着次氯酸根浓度的进一步升高，糙米中GABA含量开始下降，这可能是因为次氯酸根浓度过高反而会抑制GAD 的活性，从而使得GABA含量下降。此外，本发明首先使用了超声波和低温培养两种环境压力共同作用的方式对糙米发芽进行影响。
所述的第一营养液和第二营养溶液中添加有碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铍、碳酸镁、碳酸钙、碳酸锶、碳酸钡和氨基碳酸盐中至少一种物质，碳酸氢根离子浓度为0.020-0.15mol/l；通过基准测量法得到的发芽糙米的谷氨酸含量为1250-1300mg/kg，得到的发芽糙米的GABA 含量提高到发芽前的糙米的2.5-4倍；含量为300-880mg/kg。二次营养液的培养，在发芽时，钙离子能够进一步提高GAD活性，促进转化，通过三种方式的培养，GABA含量随着芽体的长成，达到培养巅峰。本发明糙米在发芽过程中，大量的生物酶被激活和释放，使其经历了一系列复杂化学和生理变化。在内源酶的作用下蛋白质水解为小分子肽和氨基酸，而产物又参与其他分解或合成代谢产生新的小分子物质。糙米在发芽之后，淀粉总量和直链淀粉的含量明显降低，而还原糖含量有显著性的提高，糙米发芽后淀粉总量和直链淀粉含量减少是由α-淀粉酶、β-淀粉酶、脱支酶和α-葡萄糖苷酶等降解作用造成的，降解为寡糖，如还原糖，部分供给于种子发芽。发芽后粗蛋白含量稍有增加，对应总氨基酸含量增加。游离氨基酸含量显著增加。灰分明显增加来源于发芽过程中微量元素增大。
在(2.4)中，每5h喷浓度为130mM的NaCl溶液在糙米上，同时低氧通气胁迫处理，通气量为1.2L/min，平均溶氧浓度为6.25mg/L，GABA含量为600-900mg/kg。
所述的将烘干后的糙米粉碎成糙米粉的过程中加蛋白酶水解发芽糙米的米胚蛋白，同时加谷氨酸脱羧酶、标准氨基酸，提高GABA含量。
所述的粉碎过程中加入乙醇，粉碎后通过滤纸过滤，然后对发芽糙米粉进行干燥；通过控制加入乙醇后的混合物溶液的浓度、温度、时间条件控制GABA结晶参数，得到富含GABA 晶粒的发芽糙米粉。
所述的控制加入乙醇后的混合物溶液的浓度、温度、时间条件控制GABA结晶参数包括：
GABA晶体成核速率为：
A为GABA晶体成核速率(#·ml-1·s-1)，kt为GABA晶体成核速率常数(#·ml-1·s-1)，Mx为GABA晶体悬浮密度(g·ml-1)，α为悬浮密度指数因子，β为搅拌速度指数因子，ωr为混合物溶液的搅拌速度(r·s-1)，Q为溶液过饱和比，Υ0为GABA晶体成核过饱和度指数因子，xc为乙醇摩尔分数(mol·mol-1)，Bt为GABA晶体成核自由能(J·mol-1)，Ry为气体常数(J·mol-1·K-1)，T为热力学温度；
GABA晶体生长速率为：
B为GABA晶体生长速率(cm·s-1)，ks为GABA晶体生长速率常数(cm·s-1)，Bs为GABA晶体生长自由能(J·mol-1)，Z0为GABA晶体生长过饱和度指数因子；
GABA晶体结晶粒数为：
n为GABA晶体粒数密度(#·ml-1·cm-1)，V为溶液体积(ml)，l为GABA晶体粒度(μm)， t为GABA结晶时间；
GABA晶体单一晶粒的质量变化率为：
dMd＝2.67ρgkvl2dl
ρg为GABA晶体密度，kv为GABA晶体的体积形状因子。
所述的挤压膨化处理包括：物料含水量11％、螺杆频率21Hz、喂料频率29Hz和膨化温度95℃。
溶液结晶是固体溶质从结晶母液中以晶体状态分离的过程。长久以来，结晶广泛应用于食品加工、医药生产和冶金化工等领域，本发明提出通过对米粉进行乙醇析出的方式进行结晶，同时提出了结晶控制参数，能够通过自行设计获得想要的富含GABA结晶颗粒的米粉。与现有技术相比，本发明的一个区别特征在于，在制作米粉原料研磨后就按照本发明的参数进行了结晶，本特征要解决的技术问题是：传统制作米粉等食用原料的方法，用水搅拌米粉后直接进行干燥，容易造成GABA等营养成分的流失。本发明使用乙醇加入到混合溶液中执行结晶操作，是米粉制作或者食用原料制作领域没有提出过任何启示的，而通过matlab对本发明方法进行析出实验仿真与实验对比后(图3、图4、图5)，我们得出了该种方法应用到本发明这种特殊米粉中各参数的形式，能够进一步指导后续使用本方法得到不同晶粒的产品。图2-4中单一点为实验数据，曲线为模拟数据，通过最优控制给出了方法的参数控制形式。图2为那么通过此种方法，我们即可得到一种特殊的直接含有GABA晶粒的米粉原料，营养价值更高，制作过程只使用了乙醇，可保证环保无污染析出，因此本原料也不含任何其他防腐或添加成分。综上所述，本发明具有效率高、晶体纯度高、污染小和能耗低的优点，是批量生产和小规模纯品制备最方便快捷的方法。
所述的糖化处理包括如下步骤：
(6.1)称取对挤压膨化处理后的糙米粉，每份1000g；
(6.2)用浓度为90％的乙醇溶液浸泡脱脂，并用磁力搅拌器持续搅拌20min，然后用转速为5000r/min的离心机离心30min，去掉上清液，收集沉淀得到脱脂粉末；
(6.3)重复步骤(6.2)四次以上；
(6.4)用800ml的蒸馏水在室温下对脱脂粉末进行抽提，并不断搅拌2h，用转速5000r/min 的离心机离心40min，收集上清液；
(6.5)重复步骤(6.4)3次以上，合并上述所有上清液，再减压浓缩，得到糙米粉提取浓缩液；
(6.6)加入缓冲溶液和抑菌剂甲苯，调节浓缩液的pH值在5.5-6之间，温度控制在32-35℃之间，升温灭酶后，用透析袋进行72h流水透析，除去小分子杂质色素，将透析袋内液进行冷冻干燥，得到干燥品粗多糖。
所述的第一次发酵和第二次发酵包括，在火麻糙米粉中加入碱性蛋白酶，在温度60±2℃调节pH值为9-10，加酶量为火麻糙米粉的4±0.3％，料液比为1:4.5，时间为3±0.5h的条件进行酶解，然后加入米曲霉进行第一次发酵，发酵时间3h；所述的碱性蛋白酶，是固态化的碱性蛋白酶，达到第一次发酵时间后，再加入木瓜蛋白酶，在温度70-80℃，加酶量0.4-0.6％，进行第二次酶解，1-2h后，高温灭酶，冷却，然后加入长双歧杆菌1g、大豆低聚糖溶液3ml，进行第二次发酵，发酵时间3h。
碱性蛋白酶的制作步骤如下：首先使用PH值为6.5的磷酸溶液配置15ml琼脂糖的质量分数为3％的琼脂糖-磷酸溶液；在微波条件下沸腾5min以上，然后冷却至室温，加入60g/L 的碱性蛋白质酶溶液2ml，冷却至13-16℃呈凝胶状，切割成1cm*1cm小块，3-7℃保存为固态化的碱性蛋白酶。
木瓜蛋白酶的制作步骤如下：首先使用PH值为7.5的磷酸溶液配置15ml琼脂糖的质量分数为3％的琼脂糖-磷酸溶液；在微波条件下沸腾5min以上，然后冷却至室温，加入65g/L 的碱性蛋白质酶溶液2ml，冷却至10-14℃呈凝胶状，切割成1cm*1cm小块，2-5℃保存为固态化的木瓜蛋白酶。上述固态化材料在切割成1cm*1cm小块后，低温保存之前向碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶加入质量分数为0.15％的1,2,3,4,5-戊五醇溶液作为保护剂，浸泡5min以上。
本发明提出二次蛋白酶水解发酵的方法，将蛋白水解成小分子肽更易于人体吸收，避免过敏反应。同时本发明提出的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在适温条件下进行酶解，传统的酶解手段多直接采用液态的酶制剂进行酶化，即配置好蛋白酶溶液，混合进入蛋白质进行液态酶解，蛋白质酶解速度从40℃到70℃时有一个明显的降速波动，因为超过60℃以后，碱性蛋白酶的活性显著下降，因此为了保证酶活性，应当使酶解过程处于一个较低的事宜温度，如本发明所示，但是一旦温度过低，火麻蛋白的性态趋于稳定甚至凝固，且随着温度降低，酶解反应速度会降低，不利于酶解；温度过高，蛋白质出现变态反应，也会呈现固态属性，影响蛋白质的有效保存，降低了本发明蛋白质的含量，降低了保健功能。因此对于液态的酶制剂来说，反应条件要求较苛刻，容易受到高温、酸碱等因素影响而导致失活失效，同时游离酶在反应体系中难以回收重复利用，因此在大规模工业化生产中的应用受到限制。另外本发明催化过程中的蛋白酶可能是在碳二亚胺的作用下，酶与酶之间发生交联作用，使蛋白酶的酶活力反而受到限制，影响了催化水解底物。因此本发明提出将蛋白酶进行固态化，将其分子锁定在固态化结构中使蛋白酶活性中心受到保温层的保护，提高了对温度变化的稳定性，同时能够将蛋白酶分子定位化避免了交联作用。
综上所述，本发明的制作的面包既有GABA的保健性，加入火麻粉增加了面包蛋白含量，增强韧性，增加口感，方便成型，并且补充发芽糙米蛋白含量低的缺点，使面包具有独特香味。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
