测序文库的归一化
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月8日提交的美国临时申请序列号62/555,782、2017年11月6日提交的美国临时申请序列号62/582,162和2018年5月14日提交的美国临时申请序列号62/671,410的权益，其全部内容各自通过引用合并在此。
技术领域
本公开通常涉及基因组学和分子生物学。
背景技术
下一代测序(NGS)技术(例如，NGS平台)可以降低DNA和/或其他核酸测序的成本，改进所获得的信息的质量，和/或改进测序过程的可扩展性。NGS技术可以促进具有高分析深度的少量到大量DNA和/或其他核酸样品的测序，这可以允许精确的靶标DNA序列和/或其他合适序列的检测和破译(deciphering)。可以同时分析不同核酸(例如，不同DNA核酸等)的混合物，这可以促进复杂混合物(例如，从包括微生物的复杂生态群落提取的DNA和/或其他核酸等)和/或来自保守序列池的稀有DNA序列变体(例如，在大型组织的少量细胞中稀有突变的生成等)的组成分析。然而，用于NGS和/或其他测序方法的测序文库的构建可以包括文库制备过程(例如，DNA操纵、扩增等)，该文库制备过程可以引入各种偏差(例如，针对不同靶标、如DNA靶标，针对靶标之间的比例等)。例如，测序文库中过表示(overrepresented)的靶标分子可能导致不足表示(underrepresented)的其他靶标分子的检测减少。额外地，测序的读段数量可能不一定表示文库(例如，在同一测序运行中测序的)中或原始混合物中存在的核酸分子(例如，DNA分子)的直接比例，这可能会展现出生成绝对定量数据(例如，所分析的原始生物样品的组成的精确数字或估计等)中的困难。
另外，NGS技术和/或其他合适测序技术可以用于扩增相关联测序(例如，与单个或少量基因区相关联的分析，诸如用于识别生物样品中一个或多个微生物分类群等)或微生物群落相关联测序(例如，与生物样品的微生物群落(microbial community)和/或其他合适生态群落相关联的分析，诸如包括与单个基因扩增子的分析相对的整个核酸群落等)。然而，本文描述的偏差可以额外地或替代地与用于该类测序应用的文库制备相关联。
附图说明
图1包括方法的实施方式的变体的流程图表示；
图2包括方法的实施方式的变体的流程图表示；
图3包括方法的实施方式的变体的流程图表示；
图4包括方法的实施方式的变体的流程图表示；
图5包括方法的实施方式的变体的流程图表示；
图6包括与生成归一化的测序文库相关联的图表表示的特定实施例；
图7包括与生成归一化的测序文库相关联的图表表示的特定实施例；
图8包括与执行基于磁性的归一化过程相关联的图表表示的特定实施例；
图9包括与执行基于磁性的归一化过程相关联的图表表示的特定实施例；
图10包括与执行基于磁性的归一化过程相关联的可视化表示的特定实施例；
图11包括与执行基于磁性的归一化过程相关联的图表表示的特定实施例。
图12包括与执行基于磁性的归一化过程相关联的图表表示的特定实施例。
具体实施方式
对实施方式的以下描述并非旨在限制实施方式，而是使本领域技术人员能够制造和使用。
1.概述
如图1所示，方法100(例如，用于制备测序用归一化的文库(normalizedlibrary)、诸如下一代测序(next-generation sequencing,NGS)；与微生物相关联的文库的制备、诸如用于测序微生物核酸等)的实施方式可以包括以下一项或多项：生成一个或多个归一化的扩增子文库S110；和/或生成归一化的微生物群落相关联文库(例如，归一化的宏基因组相关联文库(metagenome-associated library)；归一化的宏转录组相关联文库(metatranscriptomic-associated library)等)S120。
在特定实施例中，方法100(例如，用于制备测序用归一化的扩增子文库)可以包括以下一项或多项：基于第一扩增过程、用至少一个样品和扩增子生成引物集合，生成扩增子靶标分子集合，该扩增子生成引物集合与对应于来自该至少一个样品的靶标分子的靶标集合相关联；基于第二扩增过程、用扩增子靶标分子集合与基于归一化的引物(normalization-based primers)集合，生成归一化的靶标分子集合；和/或基于第三扩增过程、用归一化的靶标分子集合与基于测序的引物集合，生成测序就绪(sequencing-ready)靶标分子集合(例如，适于NGS的归一化的测序就绪靶标分子等)。
在特定实施例中，方法100(例如，用于制备测序用归一化的微生物群落相关联文库)可以包括以下一项或多项：从样品的总核酸中生成微生物群落相关联片段集合，其中微生物群落相关联片段集合包括宏基因组相关联核酸片段集合与宏转录组相关联核酸片段集合的至少之一；基于连接过程、用微生物群落相关联片段集合与连接衔接子分子(ligation adapter molecule)集合，生成连接的微生物群落相关联片段集合；基于第一扩增过程、用连接的微生物群落相关联片段集合与基于归一化的引物集合，生成归一化的微生物群落相关联片段集合；和/或基于第二扩增过程、用归一化的微生物群落相关联片段集合与基于测序的引物集合，生成测序就绪微生物群落相关联片段集合(例如，适于NGS的归一化的测序就绪微生物群落相关联片段集合等)，其中测序就绪微生物群落相关联片段集合包括测序就绪宏基因组相关联片段集合与测序就绪宏转录组相关联片段集合的至少之一。
额外地或替代地，如图1-3所示，方法100的实施方式可以包括生成组合测序文库(例如，归并(aggregate)测序文库)，例如与扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序(例如，宏基因组相关联测序与宏转录组相关联测序的至少之一等)相关联(例如，可用于等)的组合测序文库S150。
如图2-3所示，方法100的实施方式(例如，包括制备组合测序文库S150的方法100的实施方式的部分等)可以额外地或替代地包括：用扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合，基于执行归一化过程(例如，第二扩增过程、诸如第二PCR过程，诸如其中第一扩增过程可以用于生成扩增子靶标分子等)生成归一化的混合物S156；和/或基于归一化的混合物(例如，基于第三扩增过程、用归一化的混合物；基于第三PCR过程、用归一化的混合物与基于测序的引物集合等)生成归一化的组合文库(例如，包括测序就绪靶标分子集合等)S158。
在特定实施例中，方法100(例如，用于制备与靶标集合和微生物群落相关联的测序用归一化的组合文库等)可以包括以下一项或多项：基于第一扩增过程、用与来自微生物群落的微生物相关联的至少一个样品的靶标分子，生成扩增子靶标分子集合，其中靶标分子对应于靶标集合；基于处理来自至少一个样品的总核酸集合生成微生物群落相关联片段集合，其中微生物群落相关联片段集合包括宏基因组相关联核酸片段与宏转录组相关联核酸片段的至少之一；基于第二扩增过程、用扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合，生成归一化的混合物；和/或基于第三扩增过程、用归一化的混合物，生成包括测序就绪分子集合的归一化的组合文库，其中测序就绪分子集合与靶标集合和微生物群落相关联。
额外地或替代地，方法100的实施方式可以包括执行可替代或额外的基于磁性的归一化过程S160；处理(例如，收集；用于促进方法100的实施方式的部分的样品制备；对起其执行方法100的实施方式的部分等)来自一个或多个用户(例如，受试者；人类；动物；患者；植物等)的一个或多个生物样品、诸如从一个或多个身体位点收集的生物样品，该身体位点可包括以下一种或多种：肠位点(例如，如基于粪便样品分析的等)、皮肤位点、鼻位点、口位点、生殖器位点和/或其他合适生理位点；调整引物集合(例如，用于本文描述的特定扩增过程等)的一个或多个引物子集(例如，靶向第一靶标的引物子集等)相对于其他引物子集(例如，靶向第二靶标的引物子集等)的浓度，诸如用于改进归一化结果和/或其他合适目的；基于微生物序列数据集(例如，基于测序、用从方法100的实施方式的部分中生成的测序文库而生成的微生物序列数据集；从生物信息学分析生成的微生物序列数据集，该生物信息学分析与如本文描述地制备的测序文库的测序的区域相关联；等)确定微生物组特征(例如，微生物组成特征；微生物功能特征；诸如关于诊断和/或疗法的与微生物有关状况相关联的特征等)。然而，方法100的实施方式可以额外地或替代地包括任何合适过程。
方法100和/或系统200的实施方式可以起到促进制备一个或多个归一化的测序文库(例如，诸如关于核酸靶标的具有来自一个或多个样品的、诸如独立于靶标原始输入的靶标的平衡输出的测序文库等)的作用，归一化的测序文库诸如包括归一化的扩增子文库、归一化的微生物群落相关联文库(例如，归一化的宏基因组相关联文库；归一化的宏转录组相关联文库等)、归一化的组合文库(例如，归一化的组合扩增子文库和微生物群落相关联文库；归一化的归并测序文库等)、和/或其他合适文库中的一种或多种；以诸如通过使用基于独特分子识别符(unique molecular identifier,UMI)的分子(例如，基于UMI的引物；包括UMI区域的引物、如包括UMI区域的扩增子生成引物；包括UMI区域的连接衔接子分子等)，针对这样的文库促进分子(例如，靶标分子、微生物群落相关联片段等)的绝对定量；和/或以促进诸如关于微生物相关联测序的其他合适文库制备有关目标和/或测序有关目标。这里我们描述一种简单的、可复用(multiplexable)和可自动化的方案，以获取归一化量的各种DNA靶标，用于构建扩增子类型和宏基因组/宏转录组类型的平衡的下一代测序文库。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式可以起到以下作用：降低与测序技术相关联的偏差(例如，与常规测序文库制备方法相关联的偏差；影响来自一个或多个原始生物样品的个体分子和/或靶标分子的原始比例的偏差；与NGS技术和/或其他合适测序技术相关联的偏差等)；(例如，通过基于特定的多步骤扩增过程将分子的量归一化等)改进与扩增子文库和/或微生物群落相关联文库(例如，宏基因组相关联文库；宏转录组相关联文库等)相关联的靶标(例如，核酸；DNA分子；一个或多个原始样品中的核酸等)和/或其他合适成分的定量分析(例如，绝对量的分析；分子、等位基因(allele)、基因变体和/或其他成分的绝对定量等)；改进与RNA转录的归一化相关联的过程(例如，在RNA到DNA转变后；用于宏转录组相关联文库制备等)；改进自动化(例如，通过用于促进关于文库制备的归一化的可自动化过程等)；针对样品内和/或样品间的不同靶标改进归一化过程，诸如独立于初始模板复制数；改进并行(in parallel)制备包括复杂混合物中的多个靶标的文库；和/或改进与文库制备和/或测序相关联的任何合适过程。
额外地或替代地，在变体中，方法100和/或系统200可以通过改进磁性粒子、和一种或多种磁场系统(例如，配置为将磁场应用到与靶标分子结合的磁性粒子等)的应用，起到改进自动化、降低成本和促进归一化的作用。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式可以起到实现制备组合测序文库的作用，诸如用于同时促进扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序的执行(例如，的组合等)(例如，用于使用NGS技术和/或其他合适测序技术的测序等)，诸如以利用扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序的优点(例如，其可以抵消缺点；其可以促进新的优点：降低对微生物群落的丰富微生物的分析偏差，降低对靶标表征程度的要求、如对引物设计的要求等，该引物设计包括针对诸如关于分类标记物如16S rRNA、rpoB和/或其他标记物的靶标的保守区和针对与其他分类群的区别的可变区)(例如，扩增子相关联测序的优点，如在实现分析包括靶标基因和/或其他靶标的微生物群落中的大部分生物体中；微生物群落相关联测序的优点，如在基于整个群落DNA实现微生物群落的无偏分析(unbiasedanalyse)中，如在关于微生物组组成、微生物组特征、相关联多样性和/或其他合适特征实现微生物群落的表征中等)。
在特定实施例中，方法100可以包括生成组合扩增子(例如，用于分类学有关基因，如16S、18S、ITS等)和微生物群落相关联文库(例如，用于实现如抗生素基因、毒力基因(virulence gene)、人类遗传标记物的功能相关联基因的宏基因组检测；用于实现如病毒的多种RNA生物体的检测；用于实现检测来自生物样品的宿主和通过mRNA微生物转录基因；宏基因组DNA文库等)。在特定实施例中，方法100可以包括生成宽靶核酸(broad targetnucleic acid)(例如，DNA)文库。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式可起到促进提供用于一个或多个生物样品中生物体的定向分类学概况分析(taxonomic profiling)(和/或其他合适的组成有关分析)的数据(例如，微生物序列数据等)的作用；以及(例如，通过微生物群落相关联方法、诸如宏基因组相关联测序和/或宏转录组相关联测序等)起到促进提供用于生物体的遗传功能概况分析(和/或其他合适的组成有关分析)的数据(例如，微生物序列数据等)的作用，诸如以基于标准或已知基因组执行功能有关分析(例如，确定微生物组功能特征等)的额外或替代的方式，诸如用于针对一种或多种微生物有关状况进行表征(例如，诊断、分析、提供有关信息等)和/或促进治疗干预(例如，提供疗法；提供疗法推荐等)。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式可以起到促进微生物有关检测的作用(例如，样品的生物体的分类学检测以及在相同样品中存在或表达的基因的检测；以定向方式的具有保守分类学基因的生物体的检测，和/或无偏差地检测一个或多个生物样品中的具有表征的或未先前表征的DNA的其他真核生物、原核生物、病毒生物体和/或其他合适微生物；诸如通过基于诸如特定靶标或像16S、18S、ITS的区域的扩增或任何其他基于定向位点的技术、与用于促进降低偏差文库制备的归一化的方案互补富集，来检测新的、未知的和/或未识别的潜在核酸靶标；例如通过互补基于富集的方案或基于贫化(depletion-based)的方案，以无偏方式检测诸如与抗生素抗性、毒力因子分子标记物和其他合适的感兴趣靶标相关联的已知或识别的核酸靶标等)。然而，方法100和/或系统200的实施方式可以包括任何合适功能。
方法100和/或系统200的实施方式优选地促进与NGS(例如，NGS技术)相关联的文库制备。NGS可以包括以下任何一种或多种：高通量测序(例如，通过高通量测序技术、大规模并行签名测序、波罗尼(Polony)测序、454焦磷酸测序、因美纳(Illumina)测序、SOLiD测序、离子激流半导体测序(IonTorrent semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序、海里斯卡普(Heliscope)单分子测序、单分子实时(single molecule real time,SMRT)测序、纳米孔DNA测序等)、任何代数的测序技术(例如，第二代测序技术、第三代测序技术、第四代测序技术等)、扩增子相关联测序(例如，靶向扩增子测序)、微生物群落相关联测序(例如，宏转录组测序、宏基因组测序等)、合成测序、隧道电流测序、杂合测序、质谱测序、基于显微镜的技术和/或任何合适的NGS技术。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式可以促进与任何合适的测序(例如，任何合适测序技术等)相关联的文库制备和/或其他合适过程，任何合适的测序可以包括以下任何一种或多种：毛细管测序、桑格(Sanger)测序(例如，微流体Sanger测序等)、焦磷酸测序、纳米孔测序(牛津纳米孔测序等)和/或通过任何合适的测序技术促进的任何其他合适类型的测序。
方法100和/或系统200的实施方式可以改进测序文库制备，来针对一种或多种微生物有关状况促进(例如，基于衍生自测序文库的测序的微生物序列数据集等)表征和/或疗法，该微生物有关状况可以包括以下一项或多项：疾病、症状、病因(例如，诱因等)、障碍、相关联风险(例如，倾向性得分等)、相关联严重性、行为(例如，咖啡因消耗、习惯、饮食等)和/或与微生物有关状况相关联的任何其他合适方面。微生物有关状况可以包括一种或多种疾病有关状况，该疾病有关状况可以包括以下任何一种或多种：胃肠道有关状况(例如，肠易激综合征、炎性肠病、溃疡性结肠炎、腹腔疾病、克罗恩病(Crohn’s disease)、腹胀、痔的疾病、便秘、反流、血便、腹泻等)；过敏有关状况(例如，与小麦、麸质、乳制品、大豆、花生、贝类、树坚果、蛋类等相关联的过敏和/或不耐症)；皮肤有关状况(例如，痤疮、皮肌炎、湿疹、酒渣鼻、皮肤干燥、牛皮癣、头皮屑、光敏性等)；运动有关状况(例如，痛风、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、多发性硬化、帕金森病等)；癌症有关状况(例如，淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤、生殖细胞瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、基底细胞癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌、与任何合适的生理区域相关联的癌症状况等)、心血管有关状况(例如，冠心病、炎性心脏病、瓣膜性心脏病、肥胖症、中风等)、贫血状况(anemiacondition)(例如，地中海贫血、镰状细胞、恶性贫血、范可尼贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血、铁缺乏症等)、神经有关状况(例如，注意缺陷多动障碍(attention deficithyperactivity disorder,ADHD)、注意缺陷障碍(attention deficit disorder,ADD)、焦虑症、阿斯伯格(Asperger)综合症、自闭症、慢性疲劳综合症、抑郁症等)、自身免疫有关状况(例如，口炎性腹泻(Sprue)、艾滋病(AIDS)、舍格伦综合征(Sjogren’s)、狼疮等)、内分泌有关状况(例如，肥胖症、格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、代谢病、I型糖尿病、II型糖尿病等)、莱姆(Lyme)病状况、沟通有关状况、睡眠有关状况、代谢有关状况、体重有关状况、疼痛有关状况、遗传有关状况、慢性病和/或任何其他合适类型的疾病有关状况。额外地或替代地，微生物有关状况可以包括一种或多种人类行为状况，人类行为状况可以包括以下任何一种或多种：咖啡因消耗、酒精类消耗、其他食品类消耗、饮食补充剂消耗、益生菌有关行为(例如，消耗、避免等)、其他饮食行为、习惯行为(例如，吸烟；诸如低、中和/或极端锻炼状况的锻炼状况等)、更年期、其他生物过程、社会行为、其他行为和/或任何其他合适的人类行为状况。状况可以与任何合适表型(例如，对人类、动物、植物、真菌体可测量的表型等)相关联。
方法100和/或系统200的实施方式可以针对来自单个用户的一个或多个生物样品实施，诸如关于执行方法100的实施方式的部分，以从来自单个用户的一个或多个生物样品中制备测序文库。额外地或替代地，实施方式可以针对来自用户集合(例如，包括用户、排除用户的受试者群体等)的生物样品实施，其中用户集合可以包括与针对任何合适类型的特征(例如，关于微生物有关状况、人口统计学特征行为、微生物组组成和/或功能等)的任何其他受试者相似和/或不相似的受试者；针对用户亚组实施(例如，共享特征，如影响方法100的实施方式的部分的特征等)；针对植物、动物、微生物(例如，来自环境微生物群落)和/或任何其他合适实体实施。因此，衍生自用户集合(例如，受试者群体、受试者集合、用户亚组等)的信息可以用于针对后续用户提供额外见解(例如，关于在执行方法100的实施方式的部分中使用的实验参数等)。在变体中，生物样品的集合的归并可以与多种多样的用户相关联，并针对各种各样的用户进行处理，多种多样的用户诸如包括以下一种或多种的用户：不同的人口统计学(例如，性别、年龄、婚姻状态、种族、国籍、社会经济地位、性取向等)、不同的微生物有关状况(例如，健康和疾病状态；不同的遗传学分布(disposition)等)、不同的生活情况(例如，独居、与宠物同住、与重要的他人同住、与儿童同住等)、不同的饮食习惯(例如，杂食、素食、绝对素食(vegan)、糖类消耗、酸消耗、咖啡因消耗等)、不同的行为倾向(例如，身体活动水平、药物使用、酒精使用等)、不同的运动水平(例如，与给定时间段内行进的距离有关的)、和/或任何其他合适的特征(例如，影响、相关于和/或以其他方式相关联于微生物组组成和/或功能的特征等)，诸如用于针对不同类型的用户比较扩增子相关联特征和微生物群落相关联特征(例如，其中扩增子相关联特征与微生物群落相关联特征可以基于衍生自组合测序文库的微生物序列数据集确定，该组合测序文库诸如用于同时扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序的归一化的组合测序文库)。在实施例中，随着用户数量的增加，在方法100的实施方式的部分中实施的过程的预测能力可以增加，如关于基于各种用户的微生物组对其进行表征(例如，针对用户的样品的不同收集位点等)。然而，方法100和/或系统200的实施方式的部分可以针对任何合适的一个或多个实体、以任何合适的方式执行和/或配置。
微生物群落可以包括、涉及任何合适类型的任何合适微生物(例如，细菌、古生菌、真菌、原生动物、藻类、病毒等)和/或分类群，和/或以其他方式与之相关联，包括以下至少一种或多种：
本文描述的数据(例如，与归一化过程相关联的数据；与扩增过程、如PCR过程相关联的数据；与本文描述的引物相关联的数据；与测序相关联的数据，如测序读段、微生物序列数据集和/或其他合适测序数据；微生物组特征；用户数据；补充数据；与微生物有关状况相关联的数据等)可以与任何合适的时间指示符(例如，秒、分钟、小时、天、周等)相关联，时间指示符包括以下一种或多种：指示何时收集(例如，指示何时收集样品的时间指示符等)、确定(例如，指示何时开始、完成样品处理操作的时间指示符等)、传输、接收和/或以其他方式处理数据的时间指示符；提供数据所描述的内容的上下文的时间指示符；时间指示符的变化(例如，样品处理操作的输出随时间的变化，如PCR周期内的产品变化等)；和/或与时间有关的任何其他合适指示符。本文描述的分子和/或任何合适生物成分可以包括任何合适尺寸(例如，序列长度等)。
额外地或替代地，参数、指标、输入、输出和/或其他合适数据可以与包括以下任何一个或多个的值类型相关联：分值、个体值、归并值(aggregate values)、二进制值、相对值、分类、置信水平、识别符、频谱上的值(value along a spectrum)和/或任何其他合适类型的值。本文描述的任何合适类型的数据、成分(例如，生物成分)、产物(样品处理操作的等)可以用作输入(例如，用于不同样品处理操作，如不同扩增过程；模型；混合物；测序技术等)、生成为输出(例如，不同模型、模块、样品处理操作的产物的输出等)、和/或针对与方法100和/或系统200的实施方式相关联的任何合适组件、以任何合适方式操纵。
本文描述的方法100和/或过程的实施方式的一个或多个实例和/或部分可以通过和/或使用本文描述的系统200、组件和/或实体的一个或多个实例而异步地(例如，顺序地)、同时地(例如，针对与扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序相关联的归一化的组合测序文库同时测序；复用(multiplexing)；在方法100的实施方式的部分中处理多个样品；与测序分析和/或方法100的实施方式的部分相关联的并行数据处理等)、与触发事件(例如，方法100的实施方式的部分的执行)时间相关地(例如，基本同时、响应于、串行(serially)、先于、随后等)、和/或以任何其他合适的顺序以任何合适的时间和频率执行。
本文描述的引物可以为任何合适尺寸(例如，以及序列长度)，可以包括本文描述的任何合适引物区域，和/或可以与本文描述的任何合适扩增过程一起使用。本文描述的任何合适数量和类型的引物包括本文描述的任何合适数量和类型的引物区域，和/或以其他方式与之相关联。引物区域可以包括任何合适的引物区域互补版本(complementaryversion)(例如，用于促进退火(anneal)、扩增等)。
额外地或替代地，方法100和/或系统200的实施方式的部分可以促进(例如，其中方法100和/或系统200的实施方式的部分可以随后用作输入等)以下文件中描述的部分、对其改进、与其结合使用(例如串行、并行等)、对其使用(例如，作为方法100和/或系统200的实施方式的部分的输入等)、与其具有任何合适时间关系、对其扩大、对其修改、包括其和/或可以以其他方式与其相关联：2016年8月18日提交的15/240,919号美国申请、2017年7月13日提交的15/649,497号美国申请、2018年7月27日提交的16/047,840号美国申请、2017年11月13日提交的15/811,544号美国申请、2017年9月18日提交的15/707,907号美国申请、和2018年6月20日提交的16/013,858号美国申请，其全部内容通过引用各自合并在此。
然而，方法100和/或系统200可以任何合适的方式配置。
2.1生成归一化的扩增子文库
如图1和4所示，方法100的实施方式可以包括生成一个或多个归一化的扩增子文库S110，其可以起到制备用于扩增子测序的归一化的文库的作用。生成一个或多个归一化的扩增子文库S110可以额外地或替代地包括以下一项或多项：基于第一扩增过程(例如，第一PCR过程等)生成扩增子靶标分子集合S112；基于第二扩增过程(例如，第二PCR过程等)、用扩增子靶标分子集合生成归一化的靶标分子集合S114；基于第三扩增过程(例如，第三PCR过程等)、用归一化的靶标分子集合生成测序就绪靶标分子集合(例如，适于NGS的归一化的测序就绪靶标分子等)S116(例如，使用包括测序衔接子区域的基于测序的引物集合，以使用下一代测序系统促进测序等)；和/或用于促进一个或多个归一化的扩增子文库的制备的其他合适过程。
生成归一化的扩增子文库S110的任何合适部分可以相对于彼此以任何合适顺序和频率执行。例如，生成扩增子靶标分子S112(和/或任何合适的扩增子)可以在任何合适的时间和频率下执行(例如，在生成归一化的靶标分子之前；在生成测序就绪靶标分子期间或之后，诸如在迭代的产品生成方法中；在处理用于生成微生物群落相关联文库和/或组合文库的微生物群落相关联片段之前、同时和/或之后；和/或在任何合适的时间和频率下)。然而，以方法100的实施例的任何适当顺序和/或频率的相对部分，和/或以任何适当时间和频率生成的任何适当的部分。
生成归一化的扩增子文库S110可以包括任何数量的扩增过程(例如，任何数量的PCR过程；多步骤PCR等)。
然而，生成归一化的扩增子文库S110可以以任何合适的方式执行。
2.1.A生成扩增子靶标分子集合
方法100的实施方式可以包括生成扩增子靶标分子集合(例如，从与一个或多个靶标相关联的一个或多个生物样品，诸如包括一个或多个靶标的生物样品等)S112，其可以起到获取扩增子靶标分子的作用，以促进下游归一化、其他样品处理和/或生物信息学分析。
扩增子靶标分子优选地包括与一个或多个扩增子生成引物的区域相关联(例如，与之附着(attached with)；连接至；与之耦合等)的靶标分子(例如，包括靶标的成分，诸如总核酸和/或包括靶标序列区域的核酸片段等)，但是可以额外地或替代地包括与一个或多个靶标相关联的任何合适成分，该靶标与任何合适分子相关联。生成扩增子靶标分子集合优选地基于(例如，使用；用其处理；用其执行扩增过程等)扩增子生成引物集合与一个或多个生物样品(例如，将一个或多个扩增子生成引物的区域添加到一个或多个生物样品的诸如核酸的一种或多种成分等)，但是可以额外地或替代地基于任何合适成分。
靶标(例如，感兴趣的靶标；已知或识别的靶标；未知或先前未识别的靶标等)可以包括以下任何一种或多种：生物标记物；基因(例如，基因表达标记物等)；序列区域(例如，遗传序列；识别基因、染色体、微生物有关状况、保守序列、突变、多态性的序列；氨基酸序列；核苷酸序列等)；核酸(例如，基因组DNA、染色体DNA、染色体外DNA、线粒体DNA、质体DNA、质粒DNA、粘粒DNA、噬菌粒DNA、合成DNA、从RNA获取的cDNA、单链和双链DNA等)细胞；小分子；蛋白质；肽；与一种或多种微生物有关状况相关联的靶标(例如，提供与一种或多种微生物有关状况相关联的诊断、预后、预测和/或疗法的信息的靶标等)；与微生物组成相关联的靶标(例如，表明存在于样品中微生物的分类学分类的靶标；表明任何合适分类群的微生物的存在、丰度和/或不存在的标记物等)和/或微生物功能相关联的靶标(例如，表明与微生物相关联的功能特征的靶标等)；脂类；总核酸；整体微生物；代谢物；碳水化合物；和/或任何合适类型的靶标。这些靶标分子可以对应于一个或多个靶标，例如其中靶标分子可以包括一个或多个靶标、是一种类型的一个或多个靶标、和/或以其他方式与一个或多个靶标相关联(例如，其中靶标核酸分子包括靶标序列区域等)。方法100的实施方式的部分可以促进改进的文库制备(例如，归一化的文库制备)，以促进改进的测序(例如，NGS)和/或任何合适分子的分析。
生成扩增子靶标分子集合优选地基于一个或多个扩增过程(例如，包括；使用来自一个或多个扩增过程的输出等)。扩增过程(例如，与生成扩增子靶标分子集合相关联的；与生成归一化的分子相关联的；与生成测序就绪分子相关联的；与方法100的实施方式的任何合适部分相关联的等)优选地包括一个或多个PCR过程(例如，固相PCR、RT-PCR、qPCR、多重PCR、降落式PCR(touchdown PCR)、纳米PCR、嵌套式PCR、热启动PCR等)，但是可以额外地或替代地包括以下一项或多项：解旋酶依赖扩增(helicase-dependent amplification,HDA)、环介导等温扩增(LAMP)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链式反应(LCR)和/或任何其他合适的扩增过程。
与生成扩增子靶标分子相关联的扩增过程优选地使用一种或多种扩增子生成引物。例如，生成扩增子靶标分子集合可以基于使用至少一个样品和扩增子生成引物集合的扩增过程(例如，用于促进制备归一化的文库的扩增过程集合的第一扩增过程)，扩增子生成引物集合与对应于来自至少一个样品的靶标分子的靶标集合相关联。扩增子生成引物可以包括以下任何一种或多种：外部定义序列区域；衔接子区域(例如，包括外部衔接子区域等)；间隔子区(spacer region)；靶标相关联区域；UMI区；和/或任何其他合适区域(例如，序列区域等)。
在特定实施例中，生成扩增子靶标分子集合可以基于使用扩增子生成引物集合的扩增过程，扩增子生成引物集合包括：第一引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(XXXXXXX)-外部衔接子-间隔子-靶标序列UPST-3'”的第一引物类型配置；和第二引物，其对应于包括“5'-外部定义的序列(YYYYYYY)-外部衔接子-间隔子-靶标序列DWNST-3'”的第二引物类型配置；诸如其中“外部定义序列”(和/或本文描述的任何合适引物的其他外部定义序列区域等)可以对应于独特的且与合并在靶向其他核酸序列的引物中的序列不同的定义外部序列(例如，在第一引物类型配置中由XXXXXXX表示，并在第二引物类型配置中由YYYYYYY表示等)，其中外部定义序列(和/或其他外部定义序列区域)可以为任何长度和任何定义序列，诸如只要其促进扩增子靶标分子集合的后续扩增；诸如其中“外部衔接子”(和/或本文描述的任何合适引物的其他衔接子区域等)可以对应于适于NGS文库和/或其他合适测序文库的构建和测序的任何衔接子序列，并且可以根据所用的测序技术而具有变化的长度；诸如其中“间隔子(SPACER)”(和/或本文描述的任何合适引物区域的任何其他合适间隔子区等)可以对应于其他区域之间的、并且与靶标分子序列区域在互补结合中不完全相互作用的序列区域的任何延伸；诸如其中“靶标序列”(和/或本文描述的任何合适引物的其他合适靶标相关联区域等)可以是将旁侧上游(unspream,UPST)和下游(DWNST)退火成互补靶标核酸序列、并且可允许聚合酶复制和扩增靶标核酸分子(例如，DNA；cDNA、诸如复制到DNA的RNA)、RNA和任何其他合适核酸分子的区域；诸如其中靶向具有不同“外部定义序列”区域的N个“靶标序列”区域的N个引物可以在单个PCR反应中进行组合。
在特定实施例中，靶标分子可以通过在常规热循环仪中使用扩增子生成引物的PCR扩增，诸如在热循环仪机器或类似设备中使用DNA聚合酶以及2至40个PCR循环，这可以生成具有添加的衔接子区域(例如，外部衔接子序列等)、外部定义序列区域和/或扩增子生成引物的其他合适区域的各靶标分子的多个副本(copy)。
扩增子生成引物(和/或其他合适分子、如引物和/或本文描述的其他分子)优选地包括一个或多个外部定义序列区域。外部定义序列区域可以包括手动定义序列、自动(例如，计算)定义序列和/或任何合适序列。外部定义序列区域可以具有任何合适的尺寸。相同、类似(例如，与之互补；可退火至；与之相关联等)和/或不同的外部定义序列区域可以针对扩增过程在引物集合(例如，扩增子生成引物集合)内、针对不同扩增过程在引物集合之间(例如，扩增子生成引物集合与基于归一化的引物集合之间等)、和/或跨任何合适的引物使用。然而，扩增子生成引物、其他合适引物、和/或任何合适分子的外部定义序列区域可以以任何合适的方式配置。
扩增子生成引物(和/或其他合适分子，如引物和/或本文描述的其他分子)优选地包括一个或多个靶标相关联区域。靶标相关联区域优选地包括序列区域(例如，遗传序列等)，但是可以额外地或替代地包括任何合适类型的成分(例如，与靶标相关联的任何合适成分，如可结合到靶标、可耦合到靶标、可连接到靶标、影响靶标、告知靶标、修改靶标和/或与靶标具有任何合适关系的任何合适成分等)。靶标相关联区域优选地与一个或多个靶标相关联(例如，与其具有序列互补性；靶向；用其可扩增的；用其可处理的等)(例如，诸如DNA、cDNA、RNA的核酸靶标分子的序列区域；核酸靶标的其他合适成分；其他合适序列等)。在实施例中，靶标相关联区域可以包括用互补靶标DNA序列(例如，核酸靶标的)可退火的DNA序列。靶标相关联区域优选地使聚合酶(例如，DNA聚合酶)能够复制和扩增核酸靶标和/或其他合适成分，但是靶标相关联区域可以包括任何合适功能。靶标序列区域可以包括用于促进退火至靶标核酸分子的上游版本(version)和下游版本。靶标相关联区域可以包括任何合适长度(例如，长度上至少15个碱基；任何合适数量的碱基等)。替代地，扩增子生成区域可以排除靶标相关联区域。然而，扩增子生成引物、其他合适引物、和/或任何合适分子的靶标相关联区域可以以任何合适的方式配置。
扩增子生成引物(和/或其他合适分子、诸如引物和/或本文描述的其他分子)可以包括一个或多个衔接子区域。衔接子区域优选地包括外部衔接子区域(例如，其中一个衔接子区域可以包括一个或多个外部衔接子区域等)，其可以包括配置为促进测序文库制备(例如，配置为促进NGS文库的构建和测序等)的序列区域(例如，序列等)，但是外部衔接子区域可以额外地或替代地包括用于促进测序的任何合适成分。外部衔接子区域可以包括任何合适长度(例如，序列长度；任何合适数量的碱基等)和/或任何合适序列区域(例如，碱基的任何合适组合等)，其可以基于测序类型(例如，所用测序技术的类型等)而确定。替代地，扩增子生成引物(和/或其他合适分子)可以排除衔接子区域。然而，衔接子区域可以以任何合适的方式配置。
在变体中，扩增子生成引物可以包括一个或多个UMI区域(例如，基于UMI的引物；其中扩增子生成引物可以包括单个UMI区域；其中扩增子生成引物可以包括多个UMI区域等)。在实施例中，UMI区域(例如，扩增子生成引物的UMI区域；本文描述的任何合适引物的UMI区域等)可以包括随机“N”碱基集合(例如，N个脱氧核苷酸碱基)，其中各随机“N”碱基选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任何一种。
在特定实施例中，生成扩增子靶标分子集合可以基于使用扩增子生成引物集合的扩增过程，扩增子生成引物集合包括：第一引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(XXXXXXX)-外部衔接子-独特分子识别符-靶标序列UPST-3'”的第一引物类型配置；和第二引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(YYYYYYY)-外部衔接子-独特分子识别符-靶标序列DWNST-3'”的第二引物类型配置；诸如其中“独特分子识别符”(和/或本文描述的任何合适引物的其他合适UMI区域等)可以包括“N”脱氧核苷酸碱基串(string)(例如，“N”是“A”、“C”、“T”和“G”核酸碱基之间的任意随机碱基等)，“N”脱氧核苷酸碱基串可以是连续的或者由定义碱基分离，并且可以根据期望被定量或区分(differentiated)的靶标分子和/或变体的量而具有在2到20个碱基之间的长度，诸如其中较长的UMI区域允许较大数量的随机碱基组合，并因此允许较大的独特识别符集合。在特定实施例中，扩增过程可以使用DNA聚合酶、包括UMI区域的扩增子生成引物、以及在热循环仪机器或类似设备中的两到三个PCR循环之间，其可以生成具有添加的UMI区域、衔接子区域(例如，外部衔接子序列等)、外部定义序列区域和/或扩增子生成引物的其他合适区域的各靶标分子的单个副本。
“N”碱基可以是连续的(例如，“N”碱基串等)、分离的(例如，通过定义碱基；通过任何合适序列区域等)、和/或位于引物和/或基于UMI的分子的任何合适序列区域。UMI区域可以包括任何合适的序列长度(例如，至少2个“N”碱基；少于21个“N”碱基；任何合适数量的“N”碱基等)。UMI区域序列长度可以基于待处理(例如，定量的、区分的(differentiated)等)的靶标的量和/或类型而确定，例如其中较长的UMI区域可以促进较大数量的随机碱基组合和较大的独特识别符集合(例如，以用于分析较大数量的待区分靶标的类型；以用于分析包括较大数量的模板和/或基因变体的样品等)。在实施例中，UMI区域可以包括4N个UMI区域(例如，包括4个“N”碱基的UMI区域等)。在特定实施例中，UMI区域可以包括8N个UMI区域，诸如用于16S基因的扩增过程。额外地或替代地，UMI区域和/或基于UMI的引物可以以在2018年6月20日提交的16/013,858号美国申请描述的和/或与之类似的任何合适方式配置，其全部内容通过引用合并于此。然而，UMI区域和基于UMI的引物可以以任何合适的方式配置。
然而，执行任何合适的PCR过程和/或其他扩增过程(例如，关于生成扩增子靶标分子集合；关于方法100的实施方式的任何合适部分等)可以以任何合适的方式执行。
在变体中，生成扩增子靶标分子集合可以包括执行一个或多个片段化过程、连接过程和/或其他合适过程(例如，除基于扩增的过程意外或替代基于扩增的过程地等)，诸如以将扩增子生成引物的一个或多个区域添加到如核酸靶标分子的一个或多个靶标分子(和/或一个或多个生物样品的其他合适成分等)。
在变体中，生成扩增子靶标分子集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以包括执行一个或多个纯化过程(例如，以纯化任何合适成分；以去除任何合适成分等)。在实施例中，基于扩增过程(例如，PCR过程)生成扩增子靶标分子集合可以包括用扩增过程的产物执行纯化过程，以从扩增过程的产物中去除扩增子生成引物集合(和/或去除其他合适成分等)。在实施例中，方法100可以包括针对从本文描述的任何合适扩增过程中获取的产物执行纯化过程。纯化过程可以包括以下任何一项或多项：基于二氧化硅的DNA结合小柱(silica-based DNA binding mini-columns)，固相可逆化固定(Solid Phase ReversibleImmobilization，SPRI)磁珠(例如，用于放大和自动化等)，来自生物样品的核酸的沉淀(例如，使用基于乙醇的沉淀方法)，基于液-液的纯化技术(例如，苯酚-氯仿提取)，基于色谱的纯化技术(例如，柱吸附(column adsorption))，涉及结合部分结合粒子(binding moiety-bound particles)(例如，磁珠、浮珠、具有尺寸分布的珠、超声响应的珠等)的使用的纯化技术、该结合部分结合粒子配置为结合核酸并配置为在洗脱环境(例如，具有洗脱溶液、提供pH值变化、提供温度变化等)的存在下释放核酸的，和/或任何合适的纯化过程。在特定实施例中，磁珠可以例如通过DNA与羧基包覆的珠的静电相互作用，实现PCR过程的少量产物的纯化。在特定实施例(例如，作为其替代方案等)中，用磁珠执行纯化过程可以包括使用1:1到1:0.6之间的样品与珠体积比(例如，其中不利于小DNA分子与珠的相互作用并且消除了尺寸优选为100bp及以下的非特异性产物等)和/或任何合适的比例。在特定实施例(例如，作为其替代方案等)中，用磁珠执行纯化过程可以包括使用5到100个单位之间的核酸外切酶I，和/或任何其他的单链DNA降解酶，诸如以添加到从任何合适PCR过程获取的产物，诸如以选择性地使扩增子生成引物和/或其他合适成分(例如，来自扩增过程)退化(degrade)。在特定实施例中，用磁珠执行纯化过程可以包括通过添加1到100个单位的DpnI限制酶和/或其他合适酶而补充该过程，诸如以使PCR模板DNA和/或其他合适成分退化。在特定实施例中，除了PCR产物清理方法之外或作为其替代方案，可以使用酶处理和/或其他合适过程的组合。额外地或替代地，纯化过程可以以任何合适的方式(例如，关于方法100的实施方式的任何合适部分等)执行。
然而，生成扩增子靶标分子可以以任何合适的方式执行。
2.1.B生成归一化的靶标分子
方法100的实施方式可以包括生成归一化的靶标分子集合(例如，从使用扩增子靶标分子的扩增过程中等)S114，其可以起到获取归一化的靶标分子，以促进归一化的测序文库的制备的作用，诸如用于测序文库中的不同靶标的归一化表示。在特定实施例中，生成归一化的靶标分子可以起到改进在样品中最初表示的不同类型靶标分子的量的均等化(equalization)(例如，改进不足表示的靶标的表示等)的作用。
归一化的靶标分子优选包括与基于归一化的引物的一个或多个区域相关联(例如，与之附着；与之连接；与之耦合等)的扩增子靶标分子(例如，基于第一扩增过程生成的等)，但是可以额外地或替代地包括任何合适成分。生成归一化的靶标分子集合优选基于(例如，使用；用之处理；用之执行扩增过程等)基于归一化的引物集合与扩增子靶标分子集合，但是可以额外地或替代地基于任何合适成分。
生成归一化的靶标分子集合优选基于(例如，包括；使用来自其的输出等)一个或多个扩增过程(例如，PCR过程；本文描述的其他合适类型的扩增过程等)，但是可以额外地或替代地基于任何合适类型的样品处理操作(例如，连接操作；纯化操作等)。
与生成归一化的靶标分子相关联的扩增过程优选地使用一种或多种基于归一化的引物。例如，生成归一化的靶标分子集合可以基于使用扩增子靶标分子集合与基于归一化的引物集合的扩增过程(例如，用于促进制备归一化的文库的扩增过程集合的第二扩增过程)。基于归一化的引物优选地包括外部定义序列区域(例如，包括关于外部定义序列区域的、本文描述的任何合适特征)，但是可以额外地或替代地包括任何其他合适的引物区域。
在特定实施例中，生成归一化的靶标分子集合可以基于使用基于归一化的引物集合(例如，扩增子靶标分子集合，诸如以与扩增过程和/或本文描述的其他合适扩增过程一起使用等)的扩增过程，基于归一化的引物集合包括：第一引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(XXXXXXX)-3'”的第一引物类型配置；和第二引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(YYYYYYY)-3'”的第二引物类型配置；诸如其中“外部定义序列”(和/或本文描述的任何合适引物的其他外部定义序列区域等)可以对应于定义外部序列(例如，在第一引物类型配置中由XXXXXXX表示，并在第二引物类型配置中由YYYYYYY表示等)，诸如扩增子生成引物的定义外部序列区域的序列，诸如其中“外部定义序列”(和/或其他外部定义序列区域)可以具有任何长度和任何定义序列。可以将定义数量的基于归一化的引物分子添加到一个或多个扩增过程，以生成归一化的靶标分子；和/或可以执行N个PCR循环数(和/或任何合适程度的扩增过程等)以确保所有添加的基于归一化的引物被完全使用(例如，与DNA聚合酶等)；诸如其中可以将特异于各靶标核酸序列(例如一个或多个靶标分子的靶标核酸序列等)的扩增子数量，限制为添加的基于归一化的引物分子的数量(例如，独立于用作一个或多个扩增过程的模板的扩增子靶标分子的数量，该靶标核酸序列可从一个或多个扩增过程中生成。在实施例中，基于归一化的引物的外部定义序列区域，可以退火至扩增子靶标分子的外部定义序列区域(例如，诸如基于第一扩增过程添加到靶标分子的外部定义序列区域等)，诸如其中基于归一化的引物的外部定义序列区域可以与扩增子靶标分子的外部定义序列区域相关联(例如，与之共享序列；与之互补；可退火至等)等)。在特定实施例中，扩增子生成引物集合可以包括第一外部定义序列区域，其中生成扩增子靶标分子集合可以包括基于第一扩增过程将第一外部定义序列区域添加到靶标分子；和/或其中基于归一化的引物集合可以包括与第一外部定义序列区域相关联(例如，与之共享序列；与之互补；可退火至等)的第二外部定义序列区域。在特定实施例中，扩增子生成引物集合可以包括靶标相关联区域，其用于退火至靶标分子的靶标序列区域；和/或其中针对第二扩增过程，生成归一化的靶标分子集合可以包括添加定义量的基于归一化的引物集合，用于在第一外部定义序列区域和第二外部定义序列区域之间退火。
在特定实施例中，在基于归一化的引物的情况下，即使给定的扩增子靶标分子(和/或样品的靶标)过表示或不足表示，诸如在生成归一化靶标分子之前，生成的归一化的靶标分子也可以诸如基于所使用的各特定引物类型(例如，对应于外部定义序列区域等)的量，而达到期望的量(例如，在完成相关联PCR过程后等)。
在变体中，生成归一化的靶标分子集合可以包括执行一个或多个片段化过程、连接过程和/或其他合适过程(例如，除基于以外或替代该扩增的过程地等)，诸如以将基于归一化的引物的一个或多个区域添加到如核酸靶标分子(和/或一个或多个生物样品的其他合适成分等)的一个或多个靶标分子。
在变体中，生成归一化的靶标分子集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以包括执行一个或多个纯化过程(例如，以纯化任何合适成分；以去除任何合适成分等)。在实施例中，基于扩增过程(例如，PCR过程)生成归一化的靶标分子集合可以包括用扩增过程的产物执行纯化过程，以从扩增过程的产物中去除基于归一化的引物集合(和/或去除其他合适成分等)。可以使用和/或以任何合适的方式被执行本文描述的任何合适的纯化过程。
然而，生成归一化的靶标分子可以以任何合适的方式执行。
2.1.C生成测序就绪靶标分子
方法100的实施方式可以包括生成测序就绪靶标分子集合(例如，NGS-就绪归一化靶标分子；以归一化靶标分子集合与基于测序的引物集合为基础等)S116，其可以起到处理靶标分子(例如，归一化靶标分子)的作用，以进行测序(例如，NGS等)制备。
制备用于测序的分子优选地包括制备用于测序的归一化靶标分子(例如，通过添加一个或多个衔接子区域和/或一个或多个索引区域(index region)等)，但是可以额外地或替代地包括制备用于测序的任何合适的分子。
生成测序就绪靶标分子集合优选地基于(例如，使用；用之处理；用之执行扩增过程等)归一化靶标分子集合与基于测序的引物集合(例如，用于将基于测序的引物和/或基于测序的引物的任何合适区域、与归一化靶标分子集合合并；用于将基于测序的引物的区域添加到归一化的靶标分子集合等)，但是可以额外地或替代地基于任何合适成分。在实施例中，扩增子生成引物可以包括(例如，与NGS相关联的等)第一外部衔接子区域，其中归一化靶标分子集合(例如，衍生自基于扩增子生成引物而生成的扩增子靶标分子等)包括第一外部衔接子区域；并且其中生成测序就绪靶标分子集合(例如，NGS就绪归一化靶标分子等)包括将基于测序的引物集合(例如，包括衔接子区域，该衔接子区域包括外部衔接子区域、诸如与第一外部衔接子区域互补的外部衔接子区域等)与归一化靶标分子在归一化靶标分子的外部衔接子区域(例如，其可以对所有归一化靶标分子是共同的、独立于靶标分子的初始核酸序列等)处退火。在实施例中，基于测序的引物可以包括一个或多个衔接子区域(例如，与测序、如NGS相关联的测序衔接子区域；可退火至归一化靶标分子的外部衔接子区域等)和配置为促进与NGS相关联的复用的一个或多个索引区域；并且其中生成测序就绪靶标分子集合包括：基于扩增过程(例如，第三PCR过程等)、用归一化靶标分子和基于测序的引物集合，将一个或多个索引区域和、一个或多个衔接子区域添加到归一化靶标分子集合。生成测序就绪靶标分子优选地将归一化的靶标分子的浓度增加到适于NGS和/或其他合适测序的量(例如，2pM以上的量和/或任何合适的期望的量等)，诸如其中测序就绪靶标分子处于期望的量(例如，归一化的量和对NGS合适的量等)。
在特定实施例中，执行PCR过程(例如，用于生成测序就绪靶标分子集合的第三PCR过程)可以包括使用介于0.02-0.08单位/μL之间和/或包括0.02-0.08单位/μL(和/或其他合适浓度)的聚合酶(例如，DNA聚合酶)，用于介于15-45个PCR循环之间和/或包括15-45个PCR循环(和/或任何合适数量的PCR循环)。在特定实施例中，执行PCR过程(例如，第三PCR过程等)可以实现扩增来自归一化靶标分子(例如，来自执行第二PCR过程的产物等)集合的清洁的、归一化的核酸产物，其可以将核酸靶标的浓度增加到适于测序的水平(例如，NGS；诸如至少2pM和/或任何合适的阈值量)。
在特定实施例中，生成测序就绪靶标分子集合可以基于用基于测序的引物集合的扩增过程(例如，和归一化的靶标分子集合，诸如以与扩增过程和/或本文描述的其他合适扩增过程一起使用等)，基于测序的引物集合对应于包括“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-3'”的引物类型配置；诸如其中“测序索引”(和/或本文描述的任何合适引物的其他索引区域等)可以对应于2到10个碱基长(和/或其他合适长度)之间的定义条形码序列，该定义的条形码序列可以允许组合标记(combinatorial tagging)将要进行测序的不同样品；诸如其中“测序衔接子”(和/或本文描述的任何合适引物的其他衔接子区域等)可以对应于任何特定序列，该任何特定序列为一种或多种NGS技术和/或其他合适测序技术所需和/或以其他方式与之相关联，诸如用于使测序能够发生。
在变体中，生成测序就绪靶标分子集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以额外地或替代地包括执行一个或多个补充扩增过程(例如，第四扩增过程；第四PCR过程；其可以起到增加测序就绪靶标分子的浓度、第三扩增过程的产物的浓度、和/或其他合适成分的浓度的作用等)。在实施例中，方法100可以包括：例如基于(例如，使用、用等)在通过PCR过程(例如，第二PCR过程等)和/或生成测序就绪靶标分子集合中使用的其他合适过程添加的测序衔接子区域退火的引物，执行补充PCR过程(例如，第四PCR过程，其中生成扩增子靶标分子包括执行第一PCR过程，生成归一化靶标分子包括执行第二PCR过程，并且其中生成测序就绪靶标分子集合包括执行第三PCR过程等)。在特定实施例中，扩增子生成引物集合可以包括与测序相关联的第一衔接子区域；其中生成扩增子靶标分子集合可以包括基于第一扩增过程(例如，第一PCR过程等)将第一衔接子区域添加到靶标分子；其中归一化的靶标分子集合可以包括添加的第一衔接子区域；和/或其中基于测序的引物集合可以包括第二衔接子区域，其用于退火至归一化的靶标分子集合的添加的第一衔接子区域。
额外地或替代地，退火可以在任何合适的引物区域处发生(例如，在任何合适的扩增过程中添加的测序衔接子区域处等)。在特定实施例中，执行补充PCR过程可以基于(例如，响应于；由其触发；以其为条件的等)满足阈值条件的浓度(例如，产物浓度；来自生成测序就绪靶标分子集合的产物的浓度；来自第三PCR过程的产物等)(例如，低于1pM的浓度等)。在变体中，生成测序就绪靶标分子集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以额外地或替代地包括基于结合到二氧化硅柱的样品和/或小体积洗脱，增加测序就绪靶标分子和/或其他合适分子的浓度。在特定实施例中，生成测序就绪靶标分子集合包括增加第三扩增过程(例如，用于生成测序就绪靶标分子等)的产物的浓度，其中增加第三扩增过程的产物的浓度包括以下至少一项：基于第三扩增过程的产物和用于退火至基于测序的引物的衔接子区域的额外引物，执行第四扩增过程；和用较小体积的洗脱来执行样品结合到二氧化硅柱。
基于测序的引物(和/或本文描述的其他合适分子)优选地包括一个或多个衔接子区域。基于测序的引物的衔接子区域优选地包括一个或多个测序衔接子区域，其优选地包括便于NGS(例如，用于执行测序的一种或多种NGS技术所需的序列区域；基于所用的NGS技术类型确定的序列区域；NGS技术的促进等)和/或其他合适测序技术的序列区域，但是测序衔接子区域可以以任何合适的方式配置。额外地或替代地，任何合适的衔接子区域可以包括测序衔接子区域。(例如，基于测序的引物的等)衔接子区域优选地包括一个或多个外部衔接子区域(例如，与诸如扩增子生成引物的衔接子区域其他衔接子区域的外部衔接子区域相同、相似、不同、互补等)，但是任何合适的衔接子区域可以包括一个或多个外部衔接子区域。基于测序的引物的衔接子区域优选地包括一个或多个索引区域(例如，测序索引区域等)，其优选地配置为促进不同样品(和/或样品的成分，待测序的成分)的复用、组合标记，和/或与NGS和/或其他测序相关联的其他合适功能。索引区域优选地包括定义的条形码序列(例如，包括至少2个碱基并少于11个碱基的长度；包括任何合适数量碱基的长度等)，但是可以额外地或替代地包括任何合适的包括任何合适长度的成分。在特定实施例中，基于测序的引物可以包括配置，该配置包括“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-3'”。衔接子区域可以包括与外部衔接子区域分离的、连续的、和/或以其他方式相对定位的测序衔接子区域，但是任何合适区域可以包括相对于其他区域的任何合适位置和/或任何合适位置。额外地或替代地，基于测序的引物可以包括任何合适区域(例如，本文关于引物所描述的等)和/或其他合适成分。然而，基于测序的引物可以以任何合适的方式配置。
在特定实施例中，测序就绪靶标分子(和/或归一化的扩增子文库的合适产物)可以包括配置，该配置包括：“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-间隔子-靶标序列-间隔子-外部衔接子-测序索引-测序衔接子-3'”。在特定实施例中，诸如其中使用包括UMI区域的扩增子生成引物(例如，在生成扩增子靶标分子中等)，测序就绪靶标分子(和/或归一化的扩增子文库的合适产物)可以包括配置，该配置包括“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-独特分子识别符-靶标序列-独特分子识别符-外部衔接子-测序索引-测序衔接子-3'”。
然而，制备基于测序的引物集合可以以任何合适的方式执行。
然而，生成测序就绪靶标分子集合可以以任何合适的方式执行。
2.2生成归一化的微生物群落相关联文库
如图1和5所示，方法100的实施方式可以包括生成一个或多个归一化的微生物群落相关联文库(例如，归一化的宏基因组相关联文库；归一化的宏转录组相关联文库等)S120；其可以起到制备用于宏基因组相关联测序和/或宏转录组相关联测序的一个或多个归一化的文库的作用。
生成一个或多个归一化的微生物群落相关联文库S120可以额外地或替代地包括以下一项或多项：从样品的总核酸中生成微生物群落相关联片段集合S122；基于连接过程、用微生物群落相关联片段集合，生成连接的微生物群落相关联片段集合S124；基于第一扩增过程、用连接的微生物群落相关联片段集合，生成归一化的微生物群落相关联片段集合S126；基于第二扩增过程、用归一化的微生物群落相关联片段集合，生成测序就绪微生物群落相关联片段集合(例如，适于NGS的归一化的测序就绪微生物群落相关联片段等)S128；和/或用于促进制备一个或多个归一化的微生物群落相关联文库的其他合适过程。然而，生成归一化的微生物群落相关联文库可以以任何合适的方式执行。
2.2.A生成微生物群落相关联片段集合
方法100的实施方式可以包括生成微生物群落相关联片段集合(例如，包括宏基因组相关联片段集合和/或宏转录组相关联片段集合的至少之一等)S122，其可以起到生成便于微生物群落相关联测序(例如，宏基因组相关联测序和/或宏转录组相关联测序等)的片段的作用。例如，生成微生物群落相关联片段集合可以基于处理来自一个或多个样品(例如，生物样品，诸如其中任何合适的生物样品可以在一个或多个身体位点处收集，身体位点包括皮肤位点、生殖器位点、鼻位点、肠位点、生殖器位点中的任何一个或多个等)的总核酸集合(和/或其他合适成分等)。
微生物群落相关联片段可以包括总核酸(例如，在一个或多个生物样品的总核酸上执行片段化过程的产物等)的原始片段(raw fragment)、总核酸的处理的片段(例如，用任何合适的样品处理操作处理的；预处理的总核酸的片段和/或其他合适成分；纯化的片段等)和/或总核酸的合适片段、和/或一个或多个样品的其他合适成分。
微生物群落相关联片段优选地与一个或多个微生物群落相关联。微生物群落优选地包括来自多个分类群(例如，包括界(kingdom)、门、纲、目、科、属、种、亚种、菌株和/或任何其他合适的微生物组等)的微生物(例如，共享共同的生存空间，诸如用户的生理区域、如用户的样品收集位点等)，但是可以替代地仅包括来自单个分类群的微生物。额外地或替代地，微生物群落可以包括微生物之间的相互作用、微生物之间相互作用的产物、微生物之间的关系、与微生物和/或微生物群落相关联的功能特征(例如，功能概况等)、与微生物和/或微生物群落相关联的组成特征(例如，分类学概况等)和/或与微生物和/或微生物群落相关联的任何其他合适的成分和/或特征。
生成微生物群落相关联片段集合优选地基于处理总核酸集合，但是可以额外地或替代地基于处理任何合适成分(例如，核酸片段、诸如核酸靶标的靶标、其他合适成分等)。
生成微生物群落相关联片段集合(例如，处理总核酸集合)优选地包括用来自总核酸集合的总核酸(例如，来自一个或多个样品的总核酸集合的全部或子集等)执行一个或多个片段化过程(例如，将其片段化；生成其片段等)，但是可以额外地或替代地包括用于促进微生物群落相关联片段生成的任何合适过程。片段化过程可以包括随机片段化(例如，以生成随机的微生物群落相关联片段集合)、半随机(semi-random)片段化和/或定向片段化(例如，用于生成期望的片段集合等)。执行一个或多个片段化过程(例如，关于生成微生物群落相关联片段集合；关于方法100的实施方式的任何合适部分等)可以包括以下任何一项或多项：酶促过程(例如，使用诸如脱氧核糖核苷酸酶I(DNAse I)的非序列特异性DNA核酸内切酶、使用DNA切口酶(nickase)、限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)的混合物(mix)、转座酶型酶(transposase-type enzyme)等)、机械过程(例如，超声处理、雾化、如流体动力学剪切(hydrodynamic shearing)的剪切等)、化学过程(例如，使用羟基-自由基形成试剂(hydroxyl-radical forming reagent)、如铁-乙二胺四乙酸(EDTA)和/或其他试剂的混合物等)和/或任何合适类型的片段化过程。然而，执行一个或多个片段化过程(例如，一个或多个酶促过程；一个或多个机械过程等)可以以任何合适的方式执行。
生成微生物群落相关联片段集合可以额外地或替代地包括处理总核酸集合和/或微生物群落相关联片段集合(例如，在执行一个或多个片段化过程之前、期间和/或之后；与执行片段化过程迭代地(interatively)等)。处理(例如，总核酸集合；片段；任何合适成分)可以包括以下任何一项或多项：转变核酸(例如，将mRNA转变为cDNA)、执行靶标捕获过程(例如，富集过程、排除过程等)、执行纯化过程、补充扩增过程和/或执行任何合适的处理过程。在实施例中，方法100可以包括以下至少一项(例如，在生成微生物群落相关联片段集合之前和/或之后等)：将来自样品的RNA(例如，微生物RNA)转变为cDNA(例如，用于促进测序用归一化的宏转录组相关联文库的制备等)；执行第一靶标捕获过程(和/或任何合适数量的靶标捕获过程等)以选择性地富集对应于样品的第一核酸的第一序列；和/或执行第二靶标捕获过程(和/或任何合适数量的靶标捕获过程等)以选择性地贫化(deplete)(例如，排除)对应于样品的第二核酸的第二序列。
转变核酸可以用于促进检测靶标基因和/或其他靶标(例如，一个或多个生物样品中的核酸靶标)的表达，和/或检测病毒(例如，具有基于RNA的基因组的病毒等)的存在和/或其他合适特征。在实施例中，处理可以包括，在片段化之前和/或之后，通过逆转录酶PCR(RT-PCR)将总核酸中的mRNA转变为cDNA(例如，其中可以使用随机引物来执行RT-PCR，诸如以将样品中的全部或基本全部的mRNA逆转录；使用逆转录酶；多聚T引物(poly-T primer)；多种靶标特异性引物；靶向感兴趣mRNA的引物；和/或其他合适成分等)和/或其他合适的转变过程，诸如用于促进片段化过程和微生物群落相关联文库中的内含物(inclusion)。执行靶标捕获过程可以包括富集或排除对应于靶标序列的核酸，和/或富集或排除(例如，贫化)合适类型的靶标(例如，在片段化过程之前等)，诸如其中靶标捕获过程可以包括基于寡核苷酸的过程(例如，使用固定或附着到珠服务(bead service)的寡核苷酸，其中寡核苷酸可以与诸如靶标DNA片段的靶标核酸中的序列杂合(hybridize)等)。在变体中，靶标核酸产物的富集和/或贫化可以在任何合适的时间和频率下执行，诸如关于方法100的实施方式的任何合适部分(例如，用来自用于生成测序就绪微生物群落相关联片段集合的扩增过程的产物执行等)。在实施例中，靶标核酸产物的富集和/或贫化可以基于靶向杂合探针(hybridization probe)(例如，在片段化之后、在生成归一化的微生物群落相关联片段之后等)。在实施例中，探针可以包括核酸串，该核酸串可以通过互补的化学键、诸如以序列特异性的方式与靶标核酸(例如靶标DNA)特异性地相互作用，并且可以额外地或替代地在任何位置处包括生物素标签(biotin tag)。在特定实施例中，设计单链DNA和/或RNA探针，诸如长度为20到500个碱基，并且与核酸靶标的序列互补。在特定实施例中，核酸(例如，在生成归一化的微生物群落相关联文库的任何合适部分处等)在60到99℃下、在合适的缓冲液中温育，以便使互补链变性(denature)并允许互补链的分离，其中如果使用单链核酸(例如，cDNA)，则该过程可以忽略。在特定实施例中，感兴趣的探针和核酸在Tm+/-10℃的温度(和/或其他合适的温度)下温育10min并多至5天(和/或其他合适的时间段)，其中Tm对应于探针的解链温度(melting temperature)，其中在其他非靶标的核酸不结合的情况下，这可以允许探针与感兴趣的靶标的结合。在特定实施例中，然后可以通过链霉亲和素蛋白(streptavidin protein)与探针中的生物素标签的特异性相互作用，来捕获核酸-探针杂合体(hybrid)；其中链霉亲和素可以被系链(tether)到任何类型的固定表面，固定表面包括但不限于磁珠、树脂或一次性实验室器具的表面。额外地或替代地，ssDNA或ssRNA探针(例如，20到500个核苷酸的)可以在杂合前共价地附着到磁珠，并且该复合物可以用于与靶标核酸一起温育；其中在捕获探针-核酸杂合体之后，上清液包括贫化馏分(depletedfraction)，且珠包括富集馏分；并且其中后续可以回收感兴趣馏分的核酸。
在变体中，处理可以包括清理微生物群落相关联片段集合，诸如以去除干扰下游处理的任何分子，和/或可以进行尺寸选择，以便限制期望被处理的片段尺寸的范围。在实施例中，可以使用二氧化硅-树脂柱、磁珠、允许纯化和/或任何其他合适的样品处理操作的其他类型核酸结合材料，来执行核酸清理和/或尺寸选择。
在变体中，处理可以包括，例如基于(例如，使用，用之处理等)一种或多种酶，修复微生物群落相关联片段(例如，片段化的DNA)，该一种或多种酶包括以下至少一种：DNA聚合酶、3'核酸外切酶、多核苷酸激酶和/或任何其他合适的酶。在实施例中，修复过程中使用的酶可以诸如通过本文描述的任何合适纯化过程而去除、灭活(例如，诸如如果所使用的酶不是热稳定的，则通过在高于60℃的温度下的温育)、和/或以其他方式处理。在特定实施例中，微生物群落相关联片段(例如，修复的微生物群落相关联片段)可以被3'-腺苷酸化(3'-adenylated)(例如，使用缺乏3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、和脱氧腺苷三磷酸(dATP)等)，其可以额外地或替代地跟随一个或多个纯化过程(例如，本文描述的等)。然而，修复过程可以以任何合适的方式执行(例如，在任何合适的时间和频率下、关于方法100的任何合适部分等)。
然而，除了和/或替代地将总核酸和/或其他合适成分片段化，除了和/或替代地生成微生物群落相关联片段集合的任何合适部分，处理总核酸集合可以在方法100的实施方式的任何合适部分中、在任何合适时间和频率下和/或以任何合适的方式执行。
然而，生成微生物群落相关联片段可以以任何合适的方式执行。
2.2.B生成连接的微生物群落相关联片段集合
方法100的实施方式可以包括基于连接过程生成连接的微生物群落相关联片段集合S124，该连接的微生物群落相关联片段集合可以起到获取用于促进下游归一化、其他样品处理和/或生物信息学分析的具有连接的分子(例如，连接的衔接子分子等)的片段的作用。
生成连接的微生物群落相关联片段集合优选地基于(例如，使用；用之处理；用之执行扩增过程等)微生物群落相关联片段集合(例如，修复的和3'-腺苷酸化的微生物群落相关联片段；任何合适的处理或未处理形式的微生物群落相关联片段等)和/或连接衔接子分子集合。
添加到(例如，诸如通过连接过程连接到等)片段化过程(例如，总核酸的微生物群落相关联片段等)的输出的区域(例如，序列)优选地包括衔接子区域(例如，使用连接的衔接子分子等)，诸如使得引物(例如，在下游扩增过程中等)和/或其他合适分子能够结合的衔接子区域，诸如在方法100的实施方式的后续部分中(例如，后续PCR过程；诸如关于生成测序就绪微生物群落相关联片段分子等)。然而，添加衔接子区域和/或其他合适成分(例如，连接分子的区域；与引物区域相关联的区域等)可以以任何合适的方式执行。
连接衔接子分子(例如，在连接过程中使用，以添加到微生物群落相关联片段等)可以包括以下任何一项或多项：外部定义序列区域(例如，包括关于外部定义序列区域的本文所描述的任何特征等)；衔接子区域(例如，包括不同的衔接子区域类型，不同的衔接子区域类型包括促进用于NGS和/或其他合适测序技术的文库的下游扩增的区别序列元件；测序与测序相关联的衔接子区域等)；桥接区域(bridge region)(例如，用于系链DNA链和/或其他核酸链的等)；结合区域(例如，腺嘌呤分子，诸如用于键合到片段的离子；诸如用于共价键合到片段的磷酸盐分子；和/或其他合适分子，诸如用于促进任何合适类型的到微生物群落相关联片段的结合等)；和/或任何合适的区域。连接衔接子分子可以是双链形式(例如，双链的DNA连接衔接子分子等)和/或任何合适的形式。在特定实施例中，生成连接的微生物群落相关联片段集合可以基于用连接衔接子分子集合的连接过程，连接衔接子分子集合包括：第一连接衔接子分子，其对应于包括“3'外部定义序列(XXXXXXX)-衔接子_A-桥-磷酸盐5'”的第一连接衔接子分子配置类型；和第二连接衔接子分子，其对应于包括“5'外部定义序列(YYYYYYY)-衔接子_B-桥-腺嘌呤3'”的第二连接衔接子分子配置类型；诸如其中“外部定义序列”可以对应于外部定义序列区域(例如，包括关于外部定义序列区域的本文所描述的任何特征；诸如具有任何长度和任何合适的定义序列，只要便于后续扩增过程即可等)；“衔接子_A”和“衔接子_B”(和/或本文描述的任何合适分子的任何合适衔接子区域等)可以对应于两个区别序列元素，该两个区别序列元素允许用于NGS和/或其他测序技术的文库的下游扩增的；其中“桥”(和/或本文描述的任何合适分子的其他合适桥区域等)可以对应于系链双链连接衔接子分子的两条链的互补区域；其中“腺嘌呤”和“磷酸盐”分子(和/或本文描述的任何合适分子的其他合适腺嘌呤和/或磷酸盐分子等)可以允许分别离子键合和共价键合到微生物群落相关联片段。
在特定实施例中，可以诸如通过添加连接酶(例如，DNA连接酶等)，将连接衔接子分子连接到微生物群落相关联片段的两端(例如，片段化的DNA的两端等)。在变体中，可以将连接酶和/或其他合适成分灭活，诸如在高于60℃的温度和/或其他合适温度中温育。在变体中，纯化过程可以在连接过程之后(例如，针对DNA纯化)、和/或在任何合适的时间和频率下执行。
在变体中，连接衔接子分子可以包括一个或多个UMI区域。例如，连接衔接子分子集合可以包括UMI区域，各UMI区域包括随机“N”碱基集合，其中各随机“N”碱基选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任何一种。在特定实施例中，连接衔接子分子(例如，双链DNA连接衔接子分子等)可以对应于包括“3'外部定义序列(XXXXXXX)-衔接子_A-桥-独特分子识别符-磷酸盐5'”和“5'外部定义序列(YYYYYYY)-衔接子_B-桥-独特分子识别符-腺嘌呤3'”的连接衔接子分子类型配置，诸如其中“独特分子识别符”可以对应于包括“N”脱氧核苷酸碱基串(例如，“N”是“A”、“C”、“T”和“G”核酸碱基之间的任意随机碱基等)的UMI区域，“N”脱氧核苷酸碱基串可以是连续的或通过定义碱基分离的，并且可以根据期望被定量或区分的分子和/或变体的量而具有在2到20个碱基之间的长度，诸如其中较长的UMI区域允许较大数量的随机碱基组合，并因此允许较大的独特识别符集合。然而，包括UMI区域的连接衔接子分子可以以任何合适的方式配置。
然而，连接衔接子分子可以包括以任何合适方式(例如，以任何合适顺序等)配置的任何合适区域。
然而，生成连接的微生物群落相关联片段可以以任何合适的方式执行。
2.2.C生成归一化的微生物群落相关联片段集合
方法100的实施方式可以包括生成归一化的微生物群落相关联片段集合(例如，归一化的宏基因组相关联片段；归一化的宏转录组相关联片段等)S126，其可以起到获取归一化的片段的作用，用于促进归一化的测序文库的制备，例如用于测序文库中的不同片段和/或其他合适分子的归一化表示。在特定实施例中，生成归一化的微生物群落相关联片段集合可以起到改进在样品中初始表示的不同类型分子的量的均等化(例如，改进与宏基因组和/或宏转录组相关联的不足表示的分子的表示等)的作用。
生成归一化的微生物群落相关联片段集合优选地基于用连接的微生物群落相关联片段集合和/或基于归一化的引物集合(例如，包括本文描述的任何特征等)的扩增过程(例如，PCR过程；第一扩增过程；本文描述的其他合适类型的扩增过程等)，但是可以基于任何合适的样品处理操作(例如，连接操作；纯化操作等)和/或其他合适成分。
归一化的微生物群落相关联片段优选地包括与基于归一化的引物的一个或多个区域相关联(例如，与之附着；与之连接；与之耦合等)的片段，但是可以额外地或替代地包括任何合适成分。
在特定实施例中，生成微生物群落相关联片段集合可以基于用基于归一化的引物集合(例如，与连接的微生物群落相关联分子集合，诸如以与扩增过程和/或本文描述的其他合适扩增过程一起使用等)的扩增过程，基于归一化的引物集合包括：第一引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(XXXXXXX)-3'”的第一引物类型配置；和第二引物，其对应于包括“5'-外部定义序列(YYYYYYY)-3'”的第二引物类型配置；诸如其中“外部定义序列”(和/或本文描述的任何合适引物的其他外部定义序列区域等)可以对应于定义的外部序列(例如，在第一引物类型配置中由XXXXXXX表示，并在第二引物类型配置中由YYYYYYY表示等)，诸如连接的微生物群落相关联片段的定义的外部序列区域序列，诸如其中“外部定义序列”(和/或其他外部定义序列区域)可以具有任何长度和任何定义的序列。可以将定义数量的基于归一化的引物分子添加到用于生成归一化的微生物群落相关联片段集合的一个或多个扩增过程；和/或可以执行N个数量的PCR循环(和/或任何合适程度的扩增过程等)以确保完全使用(例如，与DNA聚合酶等)所有添加的基于归一化的引物；诸如其中可以将可从一个或多个扩增过程中生成的分子的数量限制为添加的基于归一化的引物分子的数量(例如，独立于用作一个或多个扩增过程的模板的分子的数量)。在实施例中，基于归一化的引物的外部定义序列区域可以退火至连接的微生物群落相关联片段的外部定义序列区域(例如，诸如基于连接过程添加到微生物群落相关联片段的外部定义序列区域等)，诸如其中基于归一化的引物的外部定义序列区域，可以与连接的微生物群落相关联片段的外部定义序列区域相关联(例如，与之共享序列；与之互补；可退火至等)。在特定实施例中，连接衔接子分子集合可以包括与测序相关联的第一衔接子区域，其中生成连接衔接子分子集合可以包括基于连接过程、将第一衔接子区域添加到微生物群落相关联片段集合，其中归一化的微生物群落相关联片段集合可以包括添加的第一衔接子区域，和/或其中基于测序的引物集合可以包括第二衔接子区域，其用于退火至归一化的靶标分子集合的添加的第一衔接子区域。
在变体中，生成归一化的微生物群落相关联片段集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以包括执行一个或多个纯化过程(例如，以纯化任何合适成分；以去除任何合适成分等)。在实施例中，基于扩增过程(例如，PCR过程)生成归一化的微生物群落相关联片段集合可以包括用扩增过程的产物执行纯化过程，以从扩增过程的产物中去除基于归一化的引物集合(和/或其他合适成分等)。本文描述的任何合适的纯化过程可以被使用，和/或以任何合适的方式执行。
额外地或替代地，基于一个或多个扩增过程、用基于归一化的引物(例如，用于将任何合适的分子归一化)生成归一化的微生物群落相关联分子可以以与本文描述的扩增过程类似的任何合适方式、用基于归一化的引物来执行。
然而，生成归一化的微生物群落相关联片段可以以任何合适的方式执行。
2.2.D生成测序就绪微生物群落相关联片段集合
生成测序就绪微生物群落相关联片段集合(例如，测序就绪宏基因组相关联片段；测序就绪宏转录组相关联片段等)S128，其可以起到处理微生物群落相关联片段(例如，归一化的微生物群落相关联片段)用于针对测序(例如，NGS等)进行制备。
制备用于测序的分子优选地包括，例如基于扩增过程(例如，第二扩增过程；第二PCR过程等)，制备测序用归一化的微生物群落相关联片段(例如，通过添加一个或多个衔接子区域和/或一个或多个索引区域等)，但是可以额外地或替代地包括制备测序用任何合适分子。
生成测序就绪微生物群落相关联片段集合优选地基于(例如，使用；用之处理；用之执行扩增过程等)归一化的微生物群落相关联片段集合和/或基于测序的引物集合(例如，用于将基于测序的引物和/或基于测序的引物的任何合适区域与归一化的微生物群落相关联片段集合合并；用于将基于测序的引物的区域添加到归一化的微生物群落相关联片段集合等)，但是可以额外地或替代地基于任何合适成分。在实施例中，连接衔接子分子可以包括第一外部衔接子区域(例如，与NGS相关联的等)，其中归一化的微生物群落相关联片段集合(例如，衍生自基于连接衔接子分子生成的连接的微生物群落相关联片段等)包括第一外部衔接子区域；并且其中生成测序就绪微生物群落相关联片段集合(例如，NGS就绪归一化的微生物群落相关联片段等)包括将基于测序的引物集合(例如，包括衔接子区域，该衔接子区域包括外部衔接子区域、诸如与第一外部衔接子区域互补的外部衔接子区域等)与归一化的微生物群落相关联片段在归一化的微生物群落相关联片段的外部衔接子区域处退火。
生成测序就绪靶标分子优选地将归一化的微生物群落相关联片段的浓度增加到适于NGS和/或其他合适测序的量(例如，增加至2pM以上的量和/或任何合适的期望的量等)，诸如其中测序就绪微生物群落相关联片段处于期望的量(例如，归一化的量和对NGS合适的量等)。
在特定实施例中，执行PCR过程(例如，用于生成测序就绪微生物群落相关联片段集合的第二PCR过程)可以包括使用介于5-45个之间和/或包括5-45个PCR循环(和/或任何合适数量的PCR循环)。
在特定实施例中，生成测序就绪微生物群落相关联片段集合可以基于用基于测序的引物集合的扩增过程(例如，和归一化的微生物群落相关联片段集合，诸如以与扩增过程和/或本文描述的其他合适扩增过程一起使用等)，基于测序的引物集合包括：第一基于测序的引物，其对应于包括“5'-测序衔接子-测序索引-衔接子_A-3'”的第一引物类型配置；和第二基于测序的引物，其对应于包括“5'-测序衔接子-测序索引-衔接子_B-3'”的第二引物类型配置；诸如其中“测序索引”(和/或本文描述的任何合适引物的其他索引区域等)可以对应于(任何合适长度)的定义的条形码序列，该条形码序列可允许组合标记将要进行测序的不同样品；诸如其中“测序衔接子”(和/或本文描述的任何合适引物的其他衔接子区域等)可以对应于一种或多种NGS技术和/或其他合适测序技术所需的和/或以其他方式与其相关联的任何特定序列，诸如用于使测序能够发生；诸如其中“衔接子_A”和“衔接子_B”可以包括本文描述的“衔接子_A”和/或“衔接子_B”、和/或任何合适的衔接子区域的任何合适特征。
在变体中，生成测序就绪微生物群落相关联片段集合(和/或方法100的实施方式的合适部分)可以额外地或替代地包括执行一个或多个补充扩增过程(例如，本文描述的等)和/或用于增加测序文库用(例如，本文描述的等)分子浓度的其他合适过程。
在特定实施例中，测序就绪微生物群落相关联片段(和/或归一化的扩增子文库的合适产物)可以包括配置，该配置包括：“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-靶标序列-外部衔接子-测序索引-测序衔接子-3'”。在特定实施例中，诸如其中使用包括UMI区域的连接衔接子分子(例如，在生成连接的微生物群落相关联片段中等)，测序就绪微生物群落相关联片段(和/或归一化的扩增子文库的合适产物)可以包括配置，该配置包括“5'-测序衔接子-测序索引-外部衔接子-独特分子识别符-靶标_序列-独特_分子_识别符-外部衔接子-测序索引-测序衔接子-3'”。
额外地或替代地，基于用基于测序的引物(例如，包括本文所描述的关于基于测序的引物的任何合适特征等)的一个或多个扩增过程生成测序就绪微生物群落相关联片段可以以与本文描述的扩增过程类似的任何合适方式、用基于测序的引物来执行。
然而，生成测序就绪微生物群落相关联片段集合可以以任何合适的方式执行。
2.3生成组合测序文库
如图1-2所示，方法100的实施方式可以包括与扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序(例如，宏基因组相关联测序和/或宏转录组相关联测序等)相关联的组合文库S150，其可以起到促进与扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序相关联的组合测序的作用。在实施例中，方法100的实施方式的部分可以包括，基于衍生自归一化的组合测序文库的测序的微生物序列数据集，从微生物群落中识别特定微生物(和/或关于微生物组组成、功能和/或合适的微生物有关方面，执行合适的微生物组表征)(例如，确定一个或多个微生物分类群的丰度、存在、不存在等)。
额外地或替代地，生成组合文库S150可以包括：诸如用扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合，基于执行归一化过程(例如，第二扩增过程、如第二PCR过程，诸如其中第一扩增过程可以用于生成扩增子靶标分子等)生成归一化的混合物S156；基于归一化的混合物(例如，用归一化的混合物基于第三扩增过程；用归一化的混合物与基于测序的引物集合基于第三PCR过程等)生成归一化的组合文库(例如，包括测序就绪靶标分子集合等)S158；和/或其他合适过程。
额外地或替代地，生成组合测序文库S150可以包括方法100的实施方式的任何合适部分，方法100的实施方式的任何合适部分包括生成归一化的扩增子文库S110(例如，生成扩增子靶标分子集合S112等)、生成归一化的微生物群落相关联文库S120(例如，生成微生物群落相关联片段集合S122；生成连接的微生物群落相关联片段集合S124等)、和/或关于促进生成归一化的组合测序文库的方法100的实施方式的其他合适部分。
组合序列文库优选地包括与扩增子相关联测序(例如，包括扩增子的成分；处理的扩增子、诸如用于针对测序进行制备，诸如关于微生物群落相关联成分处理的，诸如关于平衡扩增子相关联成分和微生物群落相关联成分之间的浓度比而处理的；与扩增子生成和/或处理相关联的输出等)和微生物群落相关联测序(例如，包括总核酸的片段的成分；处理的片段，诸如用于促进测序；总核酸本身等)相关联的成分(例如，可测序成分、归一化的分子、靶标分子、总核酸的片段、扩增子相关联成分、微生物群落相关联成分等)，但是可以额外地或替代地包括任何合适成分。组合测序文库(例如，归一化的组合测序文库等)优选地包括与靶标集合(例如，与扩增子相关联测序相关联的等)相关联的测序就绪分子集合、和微生物群落(例如，与微生物群落相关联测序相关联的等)。
扩增子相关联测序优选地包括与单个或小数量靶标(例如，基因区域)的分析相关联的测序，该单个或小数量靶标(例如，基因区域)的分析诸如用于识别生物样品中一个或多个微生物分类群，但是可以包括与扩增子相关联的任何合适测序。微生物群落相关联测序优选地包括与单个基因扩增子的分析相对的、诸如包括DNA(例如，和/或转录为cDNA的RNA等)的整个群落的微生物群落和/或其他合适生态群落(例如，存在于一个或多个生物样品)的分析相关联的测序，但是可以额外地或替代地包括与微生物群落(例如，关于组成有关分析；功能有关分析等)、生态群落、微生物的组、宏转录组有关方面和/或宏基因组有关方面相关联的任何合适的测序。
组合测序文库可以额外地或替代地包括一个或多个归并测序文库(分离的混合物；诸如在多重测序中不同区室(compartment)中使用的分离的子文库等)。
制备组合测序文库的部分可以用与方法100的实施方式的部分的任何合适关系(例如，时间关系，如之前、之后、期间、串行、并行；关于用作输入和/或作为输出生成的成分的关系等)来执行。
在变体中，制备一个或多个组合测序文库的部分可以包括关于生成一个或多个归一化的扩增子文库S110、生成一个或多个归一化的微生物群落相关联文库S120的任何合适部分和/或方法100的实施方式的其他合适部分所描述的任何合适过程(和/或类似过程)。然而，制备组合测序文库S150可以以任何合适的方式执行。
2.3.A生成归一化的混合物
方法的实施方式可以包括，基于执行归一化过程(例如，第二扩增过程，如第二PCR过程等)、用扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合，生成归一化的混合物S156，其可以起到组合(例如，归并)与先前处理过程相关联的产物(例如，扩增子靶标分子、如连接的微生物群落相关联片段的微生物群落相关联片段等)的作用，以促进扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序。
生成归一化的混合物优选地基于(例如，包括)执行一个或多个归一化过程，归一化过程优选地包括扩增过程(例如，包括第二PCR过程的第二扩增过程，诸如其中生成扩增子靶标分子包括第一扩增过程，第一扩增过程包括第一PCR过程；包括平衡扩增子靶标分子、微生物群落相关联片段和/或其他合适成分之间浓度比的扩增过程等)，但是归一化过程可以包括用于促进一个或多个归一化的混合物的生成的任何合适过程(例如，预处理过程等)。在实施例中，执行归一化过程可以包括用扩增子靶标分子集合、连接的微生物群落相关联片段集合和基于归一化的引物集合，执行PCR过程(例如，第二PCR过程)(例如，其中基于归一化的引物集合包括与扩增子靶标分子集合和微生物群落相关联片段集合相关联、诸如与扩增子靶标分子集合和微生物群落相关联片段集合的成分互补的引物等)。在实施例中，基于归一化的引物集合(和/或基于测序的引物和/或可用于生成组合测序文库的其他合适引物等)可以包括：与扩增子靶标分子相关联(例如，包括与其序列区域互补的序列区域等)的扩增子相关联引物集合；以及与微生物群落相关联片段(例如，连接的微生物群落相关联片段等)相关联(例如，包括与其序列区域互补的序列区域等)的微生物群落相关联引物集合。在特定实施例中，扩增子相关联引物集合可以包括扩增子相关联引物的第一子集，其中第一子集的各扩增子相关联引物包括与NGS和扩增子生成引物的第一子集相关联的第一衔接子区域(例如，其中第一衔接子区域互补于、可结合至、可耦合至、和/或以其他方式相关联于扩增子生成引物的第一子集的扩增子生成衔接子区域等)；和扩增子相关联引物的第二子集，其中第二子集的各扩增子相关联引物包括与NGS和扩增子生成引物的第二子集相关联的第二衔接子区域(例如，其中第二衔接子区域互补于、可结合至、可耦合至、和/或以其他方式相关联于扩增子生成引物的第二子集的扩增子生成衔接子区域等)，并且其中微生物群落相关联引物集合的微生物群落相关联引物可以包括微生物群落相关联衔接子区域，该微生物群落相关联衔接子区域与NGS和连接的微生物群落相关联片段集合的添加的衔接子相关联(例如，其中微生物群落相关联衔接子区域互补于、可结合至、可耦合至、和/或以其他方式相关联于，连接的微生物群落相关联片段集合的添加的衔接子区域、如添加的衔接子等)。在特定实施例中，基于归一化的引物集合可以包括引物，该引物包括配置，该配置包括“5'-外部衔接子-衔接子A1-3'”+“5'-外部衔接子-衔接子A2-3'”(例如，第一类型的引物对等)和/或“5'-外部衔接子-衔接子M1-3'”+“5'-外部衔接子-衔接子M2-3'”(例如，第二类型的引物对等)，诸如其中“衔接子-A1”和“衔接子-A2”区域可以实现扩增子靶标分子的扩增(例如，扩增子DNA的扩增等)，“衔接子-M1”和“衔接子-M2”可以实现微生物群落相关联片段(例如，宏基因组DNA；宏基因组相关联片段；宏转录组相关联片段等)的扩增，和/或基于归一化的引物集合可以包括引物，该引物包括任何合适配置。在特定实施例中，生成归一化的混合物可以基于第二扩增过程、用扩增子靶标分子集合(例如，其中生成扩增子靶标可以基于第一扩增过程等)、微生物群落相关联片段集合以及包括外部定义序列区域的基于归一化的引物集合，该外部定义序列区域用于退火至扩增子靶标分子集合和微生物群落相关联片段集合。然而，扩增子相关联引物、微生物群落相关联引物和/或可用于生成组合测序文库的其他合适引物可以以任何合适的方式配置。
生成归一化的混合物可以包括修改扩增子靶标分子和微生物群落相关联片段之间、和/或任何合适成分之间的浓度比例。修改浓度比例可以包括以限制量添加基于归一化的引物(例如，基于归一化的引物对、诸如第一扩增子相关联引物对和第二微生物群落相关联引物对；诸如包括本文描述的配置的引物对等)，用于将浓度比例调整到期望的浓度比例(例如，关于与扩增子靶标分子相关联的读段和与微生物群落相关联片段相关联的读段等)。在变体中，修改浓度比例可以包括独立于PCR过程的修改浓度比例。在实施例中，修改浓度比例可以包括清洁样品(例如，包括扩增子靶标分子的样品；包括微生物群落相关联片段的样品；包括扩增子靶标分子和微生物群落相关联片段的混合物样品等)；用荧光法、分光光度法和/或其他合适的浓度测量过程，测量相关联的核酸(例如，相关联的DNA等)；和基于扩增子相关联读段和微生物群落相关联测序读段的期望比例，修改浓度比例。在实施例中，生成归一化的混合物包括基于扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合之间的浓度比例的调整，执行归一化过程，并且其中基于测序的引物集合(例如，用于生成测序就绪靶标分子集合等)可以包括与NGS相关联的衔接子区域，扩增子生成引物集合的扩增子相关联衔接子区域、和微生物群落相关联片段集合的添加的衔接子区域(例如，添加的衔接子；微生物群落相关联片段生成引物等)。在特定实施例中，生成归一化的混合物包括基于扩增子相关联测序读段与微生物群落相关联测序读段的期望比例，调整扩增子靶标分子集合与微生物群落相关联片段集合(例如，连接的微生物群落相关联片段等)之间的浓度比例。额外地或替代地，修改浓度比例可以以任何合适的方式执行。
然而，生成一个或多个归一化的混合物可以以任何合适的方式执行。
2.3.C生成归一化的组合文库
方法100的实施方式可以包括，生成包括测序就绪(例如，NGS就绪)分子集合(例如，测序就绪靶标分子；测序就绪微生物群落相关联片段等)的归一化的组合文库S158，其可以起到处理一个或多个扩增子靶标分子和/或微生物群落相关联片段(例如，连接的微生物群落相关联片段等)和/或用于针对测序(例如，NGS；包括同时的扩增子相关联测序和微生物群落相关联测序的测序等)进行制备的其他合适混合物(例如，扩增子相关联成分和微生物群落相关联成分的等)的作用。在实施例中，生成包括测序就绪分子的归一化的组合文库可以基于扩增子靶标分子集合、微生物群落相关联片段集合(例如，连接的微生物群落相关联片段等)和基于测序的引物集合。
测序就绪分子优选地与一个或多个靶标(例如，与扩增子相关联的)和微生物群落(例如，与微生物群落相关联片段相关联的；其中靶标可以包括总核酸；其中靶标可以与多个微生物分类群相关联等)相关联，但是可以额外地或替代地与独立于微生物群落的一个或多个靶标相关联、与独立于一个或多个靶标的微生物群落相关联和/或与任何其他合适的感兴趣靶标相关联。生成测序就绪分子优选地基于(例如，包括)例如用扩增子靶标分子集合、微生物群落相关联片段集合和基于测序的引物集合的扩增过程(例如，包括第三PCR过程的第三扩增过程，其中生成扩增子靶标分子可以包括第一扩增过程，该第一扩增过程包括第一PCR过程；其中生成归一化的混合物可以包括第二扩增过程，该第二扩增过程包括第二PCR过程等)。PCR过程优选地包括有限循环(例如，比阈值量少等)，但是可以包括任何合适数量的循环等。执行扩增过程(例如，用于生成测序就绪分子等)优选地包括将一个或多个衔接子区域和/或一个或多个索引区域(例如，通过扩增过程)添加到诸如包括扩增子靶标分子和/或微生物群落相关联片段的成分(例如，混合物的成分)，但是衔接子区域、索引区域和/或其他合适区域(例如，本文描述的引物区域等)可以以任何合适的方式(例如，连接过程等)添加。在实施例中，基于测序的引物可以包括配置为促进与测序(例如，NGS等)相关联的复用的索引区域(例如，包括测序索引区域等)、与测序(例如，NGS等)相关联的衔接子区域、以及一个或多个引物和/或衔接子区域(例如，在生成扩增子靶标分子、如引物的衔接子区域中使用的引物；扩增子靶标分子的衔接子区域；微生物群落相关联片段的衔接子区域；其中基于测序的引物可以包括互补于、可退火至、和/或以其他方式相关联于扩增子靶标分子的衔接子区域和/或微生物群落相关联片段的衔接子区域的衔接子区域等)。在变体中，基于测序的引物可以包括配置为与扩增子靶标分子和/或微生物群落相关联片段的衔接子区域(例如，扩增子相关联衔接子区域；微生物群落相关联衔接子区域等)一起退火的区域(例如，衔接子区域等)，和/或其他合适的成分(例如，包括在包括扩增子靶标分子和连接的微生物群落相关联片段的混合物中的等)。在实施例中，基于测序的引物可以包括配置为与扩增子生成引物衔接子区域和/或其他合适的衔接子区域(例如，微生物群落相关联片段的微生物群落相关联衔接子区域等)一起退火的区域。在实施例中，生成归一化的组合文库包括基于第三扩增过程、用归一化的混合物和基于测序的引物集合，生成归一化的组合文库，该基于测序的引物集合包括与测序相关联的衔接子区域。额外地或替代地，与S158相关联的基于测序的引物可以与本文关于基于测序的引物所描述的任何合适特征相同、类似、不同和/或包括本文关于基于测序的引物所描述的任何合适特征。然而，基于测序的引物可以以任何合适的方式配置，并且执行关于生成测序就绪分子的扩增过程(例如，PCR过程)可以以任何合适的方式执行。
在变体中，生成测序就绪分子可以包括执行一个或多个预处理过程和/或后处理过程。在实施例中，生成测序就绪分子可以包括：用扩增子靶标分子、微生物群落相关联片段和基于测序的引物集合，执行PCR过程；以及用扩增过程的产物，清理、尺寸选择、执行补充扩增过程、纯化、富集、排除和/或执行任何合适过程(例如，用于制备适于任何合适测序技术的测序就绪靶标分子等)。
然而，生成包括测序就绪分子的归一化的组合文库可以以任何合适的方式执行。
2.4基于磁性的归一化过程
方法100的实施方式可以额外地或替代地包括执行一个或多个基于磁性的归一化过程S160，其可以起到执行额外的或替代的归一化过程，以补充和/或代替方法100的实施方式的任何合适部分的作用。基于磁性的归一化过程可以额外地或替代地起到通过使用磁场，直接从任何合适溶液(例如，本文关于方法100的实施方式的任何合适部分所描述的等)中拉取感兴趣的磁性粒子的作用，该磁场可使磁性粒子处理过程独立于尖端(tip)的使用和更换移液头工具(pipetting head tool)。基于磁性的归一化过程可以额外地或替代地起到促进归一化(例如，通过降低样品的成分之间的分散；用于平衡在测序期间生成的读段的数量等)、降低周转(turnaround)时间和/或成本、改进自动化和/或向多个板(plate)的可扩展性等)的作用。
执行基于磁性的归一化过程可以包括以下任何一项或多项：将磁珠稀释(例如，至期望比例等)；例如基于使磁珠和合适分子的结合过程，生成珠-分子复合物集合(例如，包括结合到诸如靶标分子、片段的一个或多个分子的磁珠的复合物等)；将珠-分子复合物集合附着到磁场系统的界面板；从界面板分离珠-分子复合物集合；和/或与基于磁性的归一化相关联的其他合适过程。在实施例(例如，与生成归一化的组合文库相关联的实施例等)中，对测序就绪分子集合执行额外的归一化过程可以包括：将磁珠稀释到期望比例；基于将磁珠和测序就绪分子集合的结合过程，生成珠-分子复合物集合；将珠-分子复合物集合附着到磁场系统的界面板；和/或从界面板分离珠-分子复合物集合。在实施例(例如，与生成归一化的扩增子文库相关联的实施例等)中，对测序就绪靶标分子集合执行额外的归一化过程可以包括：将磁珠稀释到期望比例；基于将磁珠和测序就绪靶标分子集合的结合过程，生成珠-靶标分子集合；将珠-靶标分子集合附着到磁场系统的界面板；和/或从界面板分离珠-靶标分子集合。在实施例(例如，与生成归一化的微生物群落相关联文库相关联的实施例等)中，对测序就绪微生物群落相关联片段集合执行额外的归一化过程可以包括：将磁珠稀释到期望比例；基于将磁珠和测序就绪微生物群落相关联片段集合的结合过程，生成珠-片段集合；将珠-片段集合附着到磁场系统的界面板；和/或从界面板分离珠-片段集合。
在特定实施例中，将磁珠稀释在适当的缓冲液(例如，聚乙二醇20％2M NaCl)中到期望比例(例如，1:10、1:20、1:40、其他合适比例等)；其中通过将珠稀释，以受控的方式限制用于核酸结合的可用位点的数量，允许减少和归一化样品之间分子的数量；其中在比珠表面上结合位点具有数量更多的核酸分子的样品中，未结合部分可以在额外的或替代的洗涤步骤期间被去除；其中稀释的珠可以被添加到样品(例如，核酸、PCR扩增子、靶标分子；微生物群落相关联片段等)并被允许温育可变时间；其中由底部中的板(例如，新的96孔聚苯乙烯板等)覆盖的磁性工具(例如，其中板可以充当磁场系统和样品之间的清洁界面)可以被浸入到包括样品和珠的板中；其中在温育之后，珠可以附着到界面板的表面，该界面板可以被提升以从样品的剩余部分中去除磁珠和附着的核酸和/或其他合适的分子；其中可以将附着的珠两次浸入包括洗涤溶液(例如，乙醇80％)的新板中，进一步清洁核酸分子；其中然后可以允许珠干燥几分钟；和/或其中将珠浸入水或任何合适溶液中以释放核酸，其可以在方法的实施方式的任何合适部分中直接使用(例如，用于多个下游应用，如PCR、RT-PCR、文库制备、限制酶分析、连接、测序等)。
执行基于磁性的归一化过程可以在任何合适的时间和频率下，使用任何合适的输入(例如，向任何合适的扩增过程和/或其他合适的样品处理操作中的任何合适输入或其产物等)而执行。
然而，执行一个或多个基于磁性的归一化过程可以以任何合适的方式执行。
3.实施例
在归一化的扩增子文库生成的实施例中：构建了包括可变量的细菌DNA和HPV病毒DNA的平衡NGS文库，然后通过qPCR测量各靶标的浓度；使用每个混合物中靶标DNA浓度的宽变化、和等量的基于归一化的引物对文库进行了测试；其中如图6所示，当使用等量的基于归一化的引物时，在浓度低于1010引物副本/反应的情况下，允许完整地或部分地归一化，该细菌和HPV靶标副本数不同之处在于在初始输入(模板混合物B和D)中1:100的比例(例如，如图6所示，其示出了通过qPCR的定量，其中在各反应中使用了相同浓度的HPV和16S引物，并且也测试了不同浓度的条件(基于归一化的引物的108、109、1010和1011个分子)；其中模板包括HPV 18+31的合成模板，并且在不同数量的副本(A、B、C、D和E)处使用了gDNA细菌混合物(绿脓杆菌(P.aeuruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和粪肠球菌(E.faecalis))。在类似实施例中，使用1:10比例的基于归一化的引物以更好地归一化HPV的扩增子副本数：如图7所示，在初始输入中包含1:100差异的混合物被完全归一化(混合物B和C)，而在初始输入中包含1:10000差异的样品被部分地归一化(混合物A和D)；其中图7示出了通过qPCR的定量，示出了所测试的不同浓度的HPV和16S引物，其中相对于16S引物，已经以较高的浓度添加了HPV引物；并且测试了引物分子数量的一阶(order)或二阶之间的差异；其中所测试的不同浓度的HPV/16S分子为：10^7/10^6、10^7/10^5、10^6/10^5和10^6/10^4；并且在模板包括HPV 18+31的合成模板的情况下，在不同数量的副本(例如，A、B、C和D)处使用了gDNA细菌混合物(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌)。
在实施例中，方法100的实施方式的部分可以包括从人类粪便生物样品中制备组合测序文库，但是组合序列文库可以额外地或替代地从任何合适的生物样品(例如，来自任何合适的用户；来自任何合适的收集位点等)中制备。在特定实施例中，组合序列文库可以从来自单个用户的粪便样品中构建；来自多个(例如，几百等)测序运行的样品的细菌分类群分析可以示出统计学上显著的可再现多样性(例如，表明稳健性和一致性等)。在特定实施例中，组合测序文库可以导致表明包含在组合测序文库的扩增子相关联成分中表示的所有种(和/或其他合适的分类群)、以及当仅使用聚焦扩增子的方法时显示为不足表示的细菌分类群(例如，柔膜菌门(Tenericutes phylum)等)的较高表示的结果。在特定实施例中，可以通过使用扩增子相关联过程以识别给定微生物(例如，包括和/或基于16S区域、18S区域、ITS等)的存在或不存在，并且通过使用微生物群落相关联过程以识别感兴趣的核酸靶标(例如，抗生素抗性基因、毒力因子、分泌系统(secretion system)等)和/或其他合适的靶标，将与制备组合测序文库相关联的过程用于识别不同生物体和感兴趣的特定核酸靶标。
在实施例中，方法100和/或系统200可以赋予常规方法之上的改进。方法100和/或系统200的特定实施例可以为至少与常规方法相关联的挑战赋予以技术为根基的解决方案。在实施例中，该技术可以将实体(例如，生物样品、如核酸靶标的靶标、引物、用户等)转变为不同的状态或事物。在特定实施例中，靶标分子可以转变为测序就绪靶标分子，和/或微生物群落相关联核酸可以转变为诸如适合于改进的测序(例如，与降低的偏差、如改进定量的改进的分析相关联的改进的测序等)的测序就绪微生物群落相关联片段。在特定实施例中，可以制备改进的测序文库，从而产生改进的微生物组表征，例如用于促进与一种或多种微生物有关状况相关联的改进的诊断和/或疗法，从而转变一个或多个用户。然而，在实施例中，该技术可以以任何合适的方式转变实体。
在实施例中，该技术可以改进至少测序文库制备、样品处理、基因组学、分子生物学、微生物学、诊断学、治疗学、数字医疗、建模的技术领域和/或其他合适的技术领域。然而，在特定实施例中，该技术可以例如通过执行方法100和/或系统200的实施方式的部分，提供任何其他合适的改进。
3.A基于磁性的归一化实施例
在实施例中，基于磁性的归一化可以在PCR之后执行，用于16S基因归一化：从口和肠样品中提取的DNA用作模板以扩增30个循环的PCR扩增16S基因；PCR之后，各反应取3μl，并通过使用磁珠在样品之间归一化DNA的量。定量归一化之前和之后的反应(例如，如图8所示，其包括比较归一化前后16S PCR浓度的盒型图(box plot)，其中各点表示个体样品，盒示出了中位数(median)和95％置信区间等)；其中归一化的样品具有比未归一化的样品更低的浓度，平均值从43.18ng/μl减至1.11ng/μl；其中这表明珠归一化可以有效地降低DNA浓度；并且其中归一化后，样品的分布明显减少。
在实施例中，可以在PCR之后可以关于ITS基因归一化执行基于磁性的归一化：将从肠和生殖器样品中提取的DNA用作模板来扩增ITS基因；在珠归一化前后对PCR产物进行定量；揭示归一化降低了DNA浓度，也平衡了样品中的浓度(例如，如图9所示，其包括比较归一化前后ITS PCR浓度的盒型图，其中各点表示个体反应物，并且盒示出了中位数和95％置信区间等)，诸如平均浓度从10.29ng/μl降至1.19ng/μl；并且其中归一化后，样品的分布也明显减少。
在测序运行中归一化作用的实施例中：将等量的ITS PCR整合(consolidate)到一个文库中，通过qPCR进行定量并加载到测序仪中；其中，图10可以包括每个样品的总读段数、以及与归一化前后的DNA浓度的比较(例如，其中某些线(certain line)示出了归一化之前各样品的浓度(ng/μl DNA)，某些线示出了归一化之后的浓度，而条(bar)示出了各样品的总读段，其中根据用于PCR的ITS引物排序样品等)。
在微生物群落相关联文库(例如，宏基因组文库等)的归一化的实施例中：使用1:40比例的珠:PEG和5μl的DNA，从先前未归一化的和珠归一化的宏基因组文库中制作系列稀释液(未稀释的、1:2、1:4、1:10、1:100)；通过(例如，如图11所示，包括稀释的宏基因组文库(1:2、1:4、1:10和1:100)的可视化和定量，在使用或不使用基于磁性的归一化(例如，基于珠的归一化)的情况下；等)对文库进行定量和分析；其中结果表明了在发达的(developed)宏基因组文库构建上使用基于磁性的归一化过程进行的浓度文库的归一化。在实施例中，对于使用基于珠的归一化的样品的宏基因组序列运行(seq run)：通过测序运行对归一化的文库和未归一化的文库进行了测试，目的是查看我们的新的基于珠的方法是否可以将每个样品的读段数归一化(例如，口样品、肠样品等)；其中使用1:40的珠:PEG比例将样品归一化，将其整合并加载到Miseq测序仪中；其中图12包括每个样品的总读段数，并且该线示出了来自测序的样品的读段的平均值；其中结果表明读段数均一，平均值为每个样品157.728.9个读段(例如，如图11-12所示)。
4.其他
然而，方法100的实施方式可以包括配置成促进来自受试者的生物样品的接收、处理来自受试者的生物样品、分析衍生自生物样品的数据、以及根据受试者特定微生物组组成和/或功能特征生成可用于提供定制化诊断和/或基于益生菌治疗的模型的任何其他合适的框或步骤。
方法100和/或系统200的实施方式可以包括各种系统组件和各种方法过程的每一种组合和排列，各种系统组件和各种方法过程包括任何变体(例如，实施方式、变体、实施例、特定实施例、附图等)，其中方法100和/或本文描述的过程的实施方式的部分可以通过和/或利用系统200和/或本文描述的其他实体的一个或多个实例、元素、组件和/或其他方面异步地(例如，顺序地)、同时地(例如，并行地)、或以任何其他适合的顺序执行。
任何本文描述的变体(例如，实施方式、变体、实施例、特定实施例、附图等)和/或本文描述的变体的任何部分可以额外地或替代地组合、归并、排除、使用、串行进行、并行进行、和/或以其他方式应用。
方法100和/或系统200的实施方式的部分可以至少部分地呈现和/或实施为机器，所述机器配置成接收存储计算机可读指令的计算机可读介质。该指令可以由可与系统整合的计算机可执行组件来执行。计算机可读介质可以存储，在任何合适的计算机可读介质上例如RAM、ROM、闪速存储器、电可擦除只读存储器(EEPROM)、光学设备(CD或DVD)、硬盘、软盘驱动器、或任何合适的设备。计算机可执行组件可以是通用的或专用的处理器，但是任何合适的专用硬件或硬件/固件组合设备可以替代地或额外地执行指令。
如本领域技术人员将从先前的详细描述以及从附图和权利要求中认识到的，可以在不背离权利要求中限定的范围的情况下，对方法100、系统200和/或变体的实施方式进行修改和变化。
