一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用
技术领域
本发明属于癌症诊断技术领域，具体涉及一种胰腺癌成瘤基因的筛选方法及筛选获得基因的应用。
背景技术
胰腺癌恶性程度高，诊断和治疗难，其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率小于1％，是预后最差的恶性肿瘤之一，有“癌中之王“的称呼。胰腺癌早期很难诊断，发现时候已属于晚期，失去了手术机会，而又没有特效化疗药物，导致治愈率很低。胰腺癌发病呈快速上升趋势。2017年美国癌症协会发布的数据显示，美国胰腺癌新发病例数男性列第11 位、女性列第8位，居恶性肿瘤死亡率第4位。胰腺癌位列中国城市男性恶性肿瘤发病率的第8位，居大城市(北京、上海)人群恶性肿瘤死亡率的第5位。人类面临癌症最主要的三大问题是癌症发生、癌症转移和治疗中的化疗耐药，也是导致癌症患者死亡的最主要原因。绝大多数病人在诊断时已发生转移，由于手术治疗已不适合，化学药物治疗成为治疗癌症患者的最主要手段。然而，在化疗过程中癌细胞化疗耐药导致的化疗药物治疗效果差甚至无效。因此，研究癌症发生机理，尤其是分子机制是解决这一难题的重要突破口。
肿瘤的发病机制较为复杂，过去认为单一物理因素、化学因素、病毒感染导致突变致癌, 目前理论认为癌症的发生是一个多步骤、多因素综合作用。以美国霍普金斯大学Vogelstein 教授对结肠癌的研究为例，癌症在发生过程中经过增生、良性腺瘤、原位癌和浸润癌等多个步骤。早起由于APC基因的缺失或者Wnt信号通路的作用，导致正常的表皮出现增生，随后KRAS基因突变引起逐渐增大的良性腺瘤，在后续SMAD4、CDC4、TP53等系列基因突变导致了恶性腺瘤的发生。从腺瘤到癌的演变过程中有多种基因发挥不同的功能，因此，癌症的发生是一个多基因参与的多步骤过程。筛选和鉴定控制癌症发生的关键基因、进而研究癌症发生的分子机理是研究癌症发生的一个重要突破口，也是开发新型癌症预防、诊断和治疗产品的关键步骤。
随着分子生物学、遗传学、基因组学、转录组学和蛋白质组学的发展，很多方法都被用来筛选癌症发生的相关基因，包括基因芯片、microRNA芯片、小分子RNA干扰(siRNAs)、化学诱变DNA、高通量测序和逆转录病毒插入突变等技术。大体上可将这些技术为正向遗传学和反向遗传学技术，前者从恶性肿瘤细胞入手，研究基因变化,包括基于DNA测序的基因突变分析、基因表达谱分析和全基因组关联研究等；后者从基因变化反向研究癌症发生,包括cDNA文库技术、RNAi文库技术、反义RNA技术、转基因技术和插入突变技术等。高通量基因组测序和表达谱分析是通过比较肿瘤细胞和正常细胞的基因、蛋白质或者 MicroRNA的差异，可获得大量差异分子，然后该方法最大的缺陷在于基因、蛋白或 MicroRNA分子的时空表达差异性，癌症发生是一种动态过程，比较的是两种或几种静止的状态，无法再现生物学过程，筛选到的性状相关分子同表型之间无因果关系,后续需要大量的验证工作。另外，这些技术产生的数据量巨大，如何从中挖掘出有意义的信息也是后续分析中的核心问题。cDNA文库、RNAi文库、反义RNA等技术可从正常细胞入手，研究癌症的发生，甚至再现癌症发生过程，然而该技术需要提前获知靶基因的序列，这样会缩小基因筛选的范围，往往会漏掉一些未知基因。因此，为鉴定出胰腺癌发生的基因，亟需一种研究方法能鉴定出同癌症发生具有因果关系的关键基因。
随机基因突变调控技术(Controlled Random Gene Perturbation Technology，CRGP)是基于整合转座子插入突变技术、反义RNA技术和真核基因表达调控技术发明的一种功能基因组学技术。CRGP能产生全基因组纯合基因突变；提供全基因组基因筛选和基因功能分析；同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系；系统性基因功能定位和分析其在遗传和生化通路中的功能特点；快速分离与疾病有关基因和变阻器式基因表达调控。利用随机基因突变调控的方法筛选控制胰腺癌成瘤的关键基因，为开发新型胰腺癌预防、诊断和治疗产品奠定基础。
发明内容
针对如何检测患者体内胰腺癌发生的技术问题，本发明提供了一种胰腺癌成瘤基因及其用途，具体技术方案如下：
本发明的目的在于提供了一种胰腺癌成瘤相关基因的筛选方法，步骤如下：
1)用CAT-tTA质粒转染人肿瘤细胞株，获得稳定表达转录激活因子的Tet-off细胞株；
2)将基因搜寻载体和有效表达转座酶MPB的质粒，按照各50ng/105个细胞的转染量，转染步骤1)获得的Tet-off细胞株，转染24h后加入终浓度为600μg/ml的G418筛选，建立全基因组随机基因突变文库；
3)筛选高成瘤能力的胰腺癌细胞株：使用下层琼脂终质量浓度为0.6％琼脂，含有细胞的上层琼脂终质量浓度为0.3％，细胞数量为6×104/10cm细胞培养板，向上层琼脂上加入2ml 的培养液，14-21天后挑取单个克隆并扩大培养、传代和冻存，获得单克隆细胞株；
4)候选克隆细胞株成瘤能力的检测：使用下层琼脂终质量浓度为0.6％琼脂，含有细胞的上层琼脂终质量浓度为0.3％，细胞数量为6×104/10cm细胞培养板，向上层琼脂上加入500μl 的培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养；实验设置强力霉素实验组与不加强力霉素对照组，分别记为+DOX和-DOX组，每组设立三个复孔，14～21天后进行统计学分析，筛选受强力霉素调控且具有较高成瘤能力的候选突变克隆；
5)胰腺癌成瘤相关候选基因的克隆：提取步骤4)筛选获得的候选突变克隆，提取基因组DNA，经Sau3A1限制性内切酶后连接接头DNA，利用Splinkette PCR和测序获得GSV插入两端的DNA序列，获得胰腺癌成瘤相关候选基因；
所述基因搜寻载体包含四环素反应元件、piggybac转座子、新霉素抗性基因和质粒复制起点，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到；所述有效表达转座酶MPB的质粒为mpb；所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌Aspc-1细胞株。
进一步地限定，所述胰腺癌成瘤的相关基因为人BRE基因。
本发明还提供了人BRE基因在制备胰腺癌诊断或筛查的试剂盒中的应用。
本发明还提供了人BRE基因在制备确定胰腺癌肿瘤存在的试剂盒中的应用。
本发明还提供了人BRE基因在制备胰腺癌患者预后判断的试剂盒中的应用。
本发明还提供了人BRE基因在制备确定胰腺癌患者的手术、放疗或者化疗治疗后是否有效的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测或辅助诊断胰腺癌的试剂盒，所述试剂盒含有BRE基因试剂，所述BRE基因作为胰腺癌成瘤检测的标志物。
有益效果
本发明通过随机基因突变调控技术筛选到了一种与胰腺癌相关的基因BRE，并证实了 BRE基因的表达增加可作为胰腺癌发生检测、筛查或胰腺癌患者预后判断的指标。利用BRE 基因在胰腺癌高危人群中进行检测，能够快速有效的做到胰腺癌的早期诊断，而且为预测诊断胰腺癌的发生发展提供治疗靶点和重要依据，可应用于胰腺癌的诊断、治疗、监测及预后。
附图说明
图1筛选的具有高成瘤能力的候选突变克隆A2；
图2候选突变克隆A2对DOX的调控反应，其中2D2代表Tet-off-#2D2细胞株，纵坐标为克隆形成的数量；
图3BRE基因在候选克隆A2中的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。其中：
限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，引物、测序、Taq聚合酶均购自Invitrogen 公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，Aspc-1细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，胎牛血清、DMEM培养基、PBS购自Hyclone公司，FugenHD购自Roche公司，各种细胞培养耗材均购自Corning公司，嘌呤霉素(puromycin)、Luciferin底物购自Invivo公司，新霉素(neomyicn，G418)购自Merck公司。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，按照常规条件如Sambrook 等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明所述的BRE基因，全称为：大脑再生表达基因(The brain andreproductive expression)，又称BABAM2基因，该基因是在本发明之前的已知基因，Genbank登录号： NM_004899，来源于人类基因组。
CAG-tTA质粒、Luciferase报告基因-pUHC13-3质粒、基于PiggyBac的基因搜寻载体GSV、转座酶(MPB)的质粒记载在已公开的专利CN102747096A《基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途》中。本发明的BRE基因的核苷酸全长序列可以用PCR扩增法、或人工合成的方法获得。本发明通过随机基因突变调控技术经研究分析确定了BRE基因具有促进胰腺癌发生的作用。
实施例1.胰腺癌成瘤基因BRE筛选及其功能研究。
在筛选目的基因之前，本发明先对高成瘤能力胰腺癌细胞株筛选条件进行了摸索，方法如下：
将终浓度为0.6％琼脂铺入6孔板中(2ml/孔)，其中含1×DMEM和10％FBS，室温冷却待其凝固,作底层琼脂用，置CO2温箱中备用；培养Asp-1细胞至对数生长期，消化、离心、收集细胞，重悬并计数细胞；利用六孔板按104/孔的细胞浓度依次混合在不同琼脂浓度的培养基中(含1×DMEM和10％FBS)，琼脂终浓度依次设置为0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％和0.1％，向上层琼脂上缓慢轻轻加入500μl的培养液，每隔3-4天换一次培养液，14-21天后观察结果，拍照记录并统计数据。结果提示0.3％浓度下，大部分细胞死亡，不能成瘤，因此，将上层琼脂浓度0.3％设置为筛选浓度。
胰腺癌成瘤的相关基因BRE基因的筛选：
(一)建立随机基因突变文库：用CAG-tTA质粒转染人肿瘤细胞株，获得稳定表达转录激活因子的Tet-off细胞株；具体方法如下：
1)将线性CAG-tTA质粒转染Aspc-1细胞，利用荧光素酶报告基因技术筛选高效表达的 Tet-off细胞株。按照罗氏FugeneHD说明书，在转染前一天接种5×105Aspc-1细胞至60mm 细胞培养皿，待细胞长至约80％时，用无血清无抗生素的DMEM培养基将CAG-tTA质粒稀释成0.02μg/μl，取250μl，向其中加入15μl FugeneHD，轻轻混匀，常温孵育15min后，慢慢滴入已准备好的细胞中，轻轻混匀，放置37℃的CO2培养箱中继续培养；24h后消化细胞，平均分至3个10cm培养皿中，加入含嘌呤霉素(puromycin，2μg/ml)的培养基中继续培养，每隔2天换一次液继续筛选；2周后形成肉眼能够观察到的克隆。
2)荧光素酶报告基因筛选稳定表达的Tet-off的Aspc-1细胞株，将经嘌呤霉素筛选后的克隆挑取并扩大培养，消化并接种104细胞于96孔板，每个克隆接种6个平行孔，置于5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜，待细胞密度达到80％时，按FuGeneHD说明书用前述相同方法向细胞内转染Luciferase报告基因-pUHC13-3质粒，每孔加质粒DNA0.05μg，FuGeneHD∶DNA按3∶1转染，然后在每个克隆的一半孔中加强力霉素(Doxycycline，DOX) 溶液(0.2μg/孔)；置于培养箱中培养，48小时后用冰冷的PBS洗涤细胞，弃去上清，利用Harvest Buffer裂解细胞(4℃，30min)，将裂解液混合均匀之后每孔取50μl至96孔酶标板中，按照ATP∶Luciferin Buffer＝1∶3.6的比例配制适当反应液，然后在生物发光检测仪上读取吸光度值，根据结果计算加了DOX各孔与未加DOX各孔相比荧光素酶表达强度的下调倍数；在所挑选的克隆中，有3个克隆荧光强度相对较高(克隆编号为2B6、2D2、5A3)且加入DOX后，其相对光单位能大幅度下降，加入DOX前后的差异能达到几百到几千倍，本发明选择荧光强度相对较高的2D2克隆，记为Tet-off-#2D2细胞株。
(二)根据FugeneHD说明书将基于PiggyBac的基因搜寻载体GSV转染至ASPC-1Tet-off-#2D2细胞株，按每105共转染50ng GSV和50ng转座酶(MPB)，转染24h后将细胞转入10cm培养皿中，加入终浓度为600μg/ml的G418筛选，每2-3天更换一次培养液，建立全基因组随机基因突变文库，根据G418抗性克隆估算突变文库大小，共获得大于10万个突变细胞克隆。
(三)筛选高成瘤能力的胰腺癌细胞株：下层继续使用(终质量浓度)0.6％琼脂，上层 (含细胞)的琼脂终质量浓度为0.3％，细胞数量为6×104/10cm细胞培养板，向上层琼脂上缓慢轻轻加入2ml的培养液，每隔3-4天换一次培养液，14-21天后大部分细胞死亡，可见少量的克隆形成，挑取单个克隆并扩大培养、传代和冻存，共获得5株克隆，依次命名为A1、A2、A3、A4和A5，其中候选A2如图1。
(四)候选克隆细胞株成瘤能力的检测：按以上摸索好的琼脂克隆形成能力检测方法，下层继续使用(终质量浓度)0.6％琼脂，上层(含细胞)的琼脂终质量浓度为0.3％，利用六孔板细胞数量为104/孔，板，向上层琼脂上缓慢轻轻加入500μl的培养液，需要添加DOX组提前配制好含有DOX的DMEM培养基(DOX在培养基中的终浓度均为1ug/ml)，放置37℃， 5％CO2培养箱中培养；每隔3-4天换一次培养液，实验设置+DOX和-DOX组，每组设立三个复孔，14～21天后观察结果，拍照记录并统计数据，结果如图2所示，**代表P<0.01，ns 代表没有统计学意义，可见候选克隆A2+DOX和A2-DOX组存在统计学差异，表明DOX对突变克隆A2具有调控性，A2克隆中GSV所突变的基因同肿瘤细胞株的成瘤能力具有明确的因果关系。
(五)胰腺癌成瘤相关候选基因的克隆：利用天根公司基因组提取试剂盒提取A2细胞株基因组，按照NEB公司Sau3A1限制性内切酶说明书酶切1ug基因组DNA后，按照T4DNA 连接酶说明书同接头(5μl 100μm SPL和5μl 100μm SPR，加入90μl水，加热至100℃反应10min后，缓慢冷却至常温)常温下连接过夜，具体反应体系包括为Sau3AI单切后基因组DNA 5μl、Adaptor 1μl、10×T4连接Buffer 1μl、ATP(0.01M)0.1μl、T4连接酶0.5μl及加入去离子水至总体积10μl。利用Splinkette PCR和测序获得GSV插入两端的DNA序列，插入位点选择在piggyBac转座子常见的整合位点TTAA处，见图3(接头和Splinkette PCR所用的引物的序列均记载在已公开的专利CN102747096A《基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途》中)。
将测序后所得的序列通过UCSC基因组的Blat比对定位插入位点，GSV插入位点位于基因BRE的第三个内含子，具体位置在2号染色体的27931921位点(Chr2：27931921)，生成反义RNA，干扰了该基因mRNA的转录和翻译，从而调控该基因的表达水平。
(六)BRE基因在候选克隆A2中的表达情况：实验分候选克隆A2(+DOX)、A2(-DOX)、对照ASPC-1-2D2(+DOX)和ASPC-1-2D2(-DOX)四组，所述ASPC-1-2D2即为前述的 Tet-off-#2D2细胞株，图中所示Actin为对照β-Actin(β-Actin是一种细胞骨架蛋白，表达固定，进行Western Blot检测时，常作为内参。)培养细胞至对数生长期，消化、离心、收集并计数细胞，接种5×105细胞至60mm培养皿内，置37℃、5％CO2培养箱培养。待细胞铺满后，加入200μl裂解液在冰上裂解细胞15min，其中每隔3-5min不断拍打培养皿，使裂解液分布均匀；将裂解后产物转移至1.5ml EP管内，至4℃ 12000g离心10min；转移上清至一新的离心管内，放置冰上。利用Thermofisher公司的BCA试剂盒测定蛋白样品的浓度，取50μg 总蛋白，利用5×蛋白上样Buffer稀释样品，100℃加热3min使蛋白样品变性，制备出用于上样的蛋白样品；经过电泳和转膜后，利用5％脱脂奶粉(5g脱脂奶粉，100ml TBS-T)37℃封闭1h，TBS-T冲洗3次，每次3min；利用5％脱脂奶粉稀释的抗BRE抗体4℃杂交过夜，第二天利用TBS-T洗3次，每次3min；利用二抗杂交1h后，TBS-T洗3次，每次3min；用ThermoWB显色试剂盒(A液、B液各数滴等量混匀)，采用压片暗盒进行压片，压片结束后使用X光片自动洗片机洗片，可见候选克隆A2中BRE基因表达上调，而加入DOX后基因的表达受调控降低，表明BRE基因的上调导致了肿瘤细胞株成瘤能力的增加，即可促进肿瘤细胞的发生和生长。
