一种用于病原微生物检测的测序文库构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于病原微生物检测的测序文库构建方法和 试剂盒。
背景技术
病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体 中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物包含朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。
由病原微生物引起的传染和感染性疾病是临床面临的最常见的疾病之一，占人类疾病 的50％，并且随着人群结构变化、环境污染以及药物滥用等因素的影响，以及病原体本 身存在高度变异性，病原微生物呈现多样化和复杂化的趋势，严重威胁人类健康。病原微 生物导致的传染感染疾病，往往病程发展较快，并且存在未知病原，给诊断和检测带来极 大困难。快速准确的诊断，对病情进行监控具有重大意义，可帮助提供有效治疗，控制疾病的蔓延。目前常用的病原微生物检测方法包括涂片镜检、生化反应、免疫检测、培养法、常规PCR法、qPCR、基因芯片技术、高通量测序(NGS)、质谱等技术。
NGS技术具有不依赖已知核酸序列，可全面掌握所有相关微生物信息、可发现未知病原、可检测变异、灵敏度最高、通量最高等优势，以及相对于传统检测方法的快速和相 对于PCR等一般分子检测方法的准确性，已逐步应用于感染性疾病的诊断、治疗和监测， 成为病原检测的金标准方法之一。
高通量测序用于病原微生物检测主要包括以下流程：1.样本的收集和运输；2.核酸 提取；3.宿主核糖体RNA去除；4.DNA打断(包括物理打断法和酶打断法)；5.RNA 打断；6.RNA逆转录一链合成；7.cDNA二链合成；8.二链cDNA纯化；9.片段化DNA 和二链cDNA混合；10.双链DNA末端修复；11.3’末端加A尾；12.连接与测序平台匹 配的接头；13.PCR文库扩增；14.文库磁珠纯化。整个过程大约需要10-11个小时。该 方案建库流程较长，较为复杂，对样本起始量要求较高，无法满足快速发展的检测市场和 患者对检测结果报告急迫的需求。所以如果能改进现有方案，缩短建库流程，将极大推进 高通量测序在病原微生物检测方面的研究和临床应用，为患者提供更快更准的检测结果。
高通量测序用于病原微生物检测，一般主要包括以下流程(如图1所示)：1.样本的收集和运输；将样本存于样本保存管中或-70℃保存和运输；2.核酸提取；由于存在RNA 病毒，并且有时需要知道病原体的特定基因表达量以及耐药基因检测，因此通常需要共同 提取样本中的DNA和RNA。可使用柱式提取法或磁珠法提取，磁珠法提取适用于自动 化提取仪器，可大幅提高提取通量。3.宿主核糖体RNA去除；由于提取样本中绝大多数 是宿主的DNA和RNA，而宿主RNA中rRNA占比超过90％，因此去除宿主rRNA有利 于更多有效数据检出。目前的方法有基于DNA探针的Rnase H法和磁珠抓取法。Rnase H 法去除效率高、特异性好，但流程较长；磁珠抓取法操作相对简单，时间短，但去除效率 较低；4.DNA打断(包括物理打断法，如使用Covaris仪器或Biorupter的超声打断；和 基于酶的打断方法)；5.RNA打断(RNA为单链，在高浓度金属离子中易被打断)；6.RNA 逆转录一链合成，使用逆转录酶进行；7.cDNA二链合成，使用DNA聚合酶进行；8.二 链cDNA纯化，使用DNA纯化磁珠；9.片段化DNA和二链cDNA混合；10.双链DNA 末端修复，一般通过T4 DNA聚合酶、T4 PNK等酶进行末端补平和磷酸化；11.3’末端加 A尾，通过Taq DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶；12.连接与测序平台匹配的接头， 如Illumina测序平台、MGI测序平台和Ion Torrent测序平台；13.PCR文库扩增，使用基 于耐热DNA聚合酶的PCR反应和测序平台适配的引物进行扩增；14.文库磁珠纯化。整 个过程大约需要10-11个小时。病原微生物检测造成的传染和感染性疾病往往发病较快， 病原微生物在患者体内生长繁殖速度极快，因此需要更快的检测速度，该方案建库流程较 长，较为复杂，使得建库效率低下，检测时间过长，无法满足患者和医护人员对报告及时 性的要求；且现有技术对样本起始量要求较高。现有技术对样本起始量一般要求大于100 ng，极端情况可以做到10ng。由于患者样本来自于脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、血液 等较为复杂样本，样本保存不好容易导致核酸降解，提取质量不高、微生物含量较低，往往较难达到检测起始量要求；此外，DNA和RNA分开操作，流程长，易出错，DNA和 RNA同时建库的关键步骤是转座酶打断步骤，Tn5转座酶对cDNA杂合链的打断效率较 低，终止反应时转座酶失活不彻底，转座酶粘在DNA上，影响后续的扩增，都会对建库 的质量和速度产生较大的影响。建库中的错误会导致所得到的的文库不完整，信息不完全， 最终导致病原检出效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于病原微生物检测的快速简便的测序文库构建方法和试 剂盒。整个过程可以将原先耗时10-11个小时、需要14个步骤的病原微生物检测文库构 建过程，缩短至仅需6-7个步骤，仅需3.5-5个小时，大大减少了建库步骤，缩短了建库时间，降低了对样本起始量的要求，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多病原微生物信息，帮助患者和医护人员快速得到检测结果。
本发明还提供一种样本保存液，可以使得样本中的核酸不易降解。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
本发明目的之一在于提供一种用于病原微生物检测的测序文库构建方法，包括以下步 骤：
(1)将提取的样本放入样本保存液，然后进行DNA/RNA共提取，并对宿主rRNA 进行去除；
(2)将步骤(1)样本中加入逆转录酶使其中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合 双链；
(3)在步骤(2)获得的逆转录产物cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物中 直接加入突变型Tn5转座酶及打断缓冲液进行片段化，片段化结束后用终止反应液5× TS-plus进行终止反应，使突变型Tn5转座酶失活；
(3)链置换和文库扩增：步骤(2)所得产物中加入扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物，进行PCR扩增；
(4)磁珠纯化即可得到原始DNA/RNA的可测序文库。
本发明所述方法步骤(1)中使用样本保存液对样本进行保存和运输，本发明所述的 样本保存液包含：Tris-HCl 10mM-2M，PH＝7.0-9.0，盐酸胍0.1M-8M，氯化钴0.5-10mM，EDTA.2Na 0.1M-2M，Triton X-100 0.1％-5％，脱氧胆酸钠0.1mM-4M；优选的，包含： Tris-HCl 50mM-200mM，PH＝7.0-9.0，盐酸胍1M-5M，氯化钴1-4mM，EDTA.2Na 0.1M-0.5M，TritonX-100 0.5％-2％，脱氧胆酸钠0.5mM-2M；进一步优选的，包含Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M，Triton X-100 1％，脱氧 胆酸钠1mM。采用本发明所述的保存液，在56℃保存1小时后，可以使RNA不降解， 而在此温度下，很多含有病毒的样品可以加温到56℃灭菌之后再做后面的实验，有利于 保护实验人员。
本发明步骤(1)的样本可以为本领域常用的采集种类和方法获得的样本，例如人鼻 咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液、粪 便等样本。样本采集方法可以采用本领域常用的方法进行采集，采集后，立即采用本发明 所述的样本保存液进行收集、保存和运输样本，样本保存液具有灭活功能，保障安全使用， 同时保护核酸，适宜于短期常温运输。
优选的，样本放入样本保存液后50-56℃加温0.5-1小时，最优选的样本放入样本保 存液后56℃加温0.5-1小时。
本发明步骤(1)对样本进行DNA/RNA共提取的方法可以为本领域的常规方法，例如磁 珠法或柱式法。在本发明的一种实施例中，本发明提供一种DNA/RNA共提取的方法：400-800 μl含有样品的样本保存液加入200-400μl乙醇后，直接使用柱式提取上柱，或直接加入核酸 化磁珠，经过2-3轮漂洗，即可获得纯化后的包含DNA和RNA的核酸。
本发明步骤(1)对宿主rRNA进行去除可以为本领域的常规方法，例如使用Rnase H法或磁珠法对宿主rRNA进行去除；经过设计的DNA探针可与rRNA特异配对，Rnase H 可识别DNA/RNA杂合链，并切割其中的RNA链，随后用Dnase去除DNA探针，即可 将宿主rRNA去除；磁珠法是使用在链霉亲和素磁珠抓取带有生物素标记的rRNA互补序 列，通过互补配对后，将未配对的溶液吸出，rRNA即留在链霉素亲和磁珠上，与其他 RNA分开。
本发明步骤(2)将反应底物中的RNA逆转录形成RNA/cDNA复合双链可以采用本领域的常规逆转录方法进行逆转录。
在本发明的一种实施例中，本发明步骤(3)中突变型Tn5转座酶的突变位点是：D24E、D97E、K160R和E326D同时突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其基因 序列如SEQID NO.2所示。本发明所述的突变型Tn5转座酶cDNA杂合链打断效率较高。
本发明步骤(3)突变型Tn5转座酶混入打断体系之后终浓度可为1-50ng/ul，优选的， 为1-20ng/ul，进一步优选的，为1-10ng/ul，在一种具体的实施方式中，突变型Tn5转座酶 混入打断体系之后终浓度为5ng/ul。
本发明步骤(3)突变型Tn5转座酶打断的同时可以在双链的5’端按照常规加上部分 接头序列。
本发明步骤(3)中所用的终止反应液5×TS-plus，包含：0.1％-5％BSA，0.05％-2％ Tween-20，0.1-1％SDS，1mM-50mM DTT；优选的，包含：2％-3％BSA，0.05％-1.5％Tween-20，0.1-1％SDS，20mM-30mM DTT；在一种具体的实施方式中，包含2.5％BSA， 1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT。
本发明步骤(3)使突变型Tn5转座酶失活之后可进行磁珠纯化，也可以不进行纯化直 接进入下一步的反应，由于本发明步骤(3)中所用的终止反应液5×TS-plus，可以使Tn5转座酶很好的失活，且不会粘在DNA上，对后续实验影响较小，因此即使不进行纯化也可 以进行后续步骤。
在一些实施例中，本发明步骤(3)中的cDNA/RNA复合双链和DNA双链的混合物为0.1ng-1μg。发明人发现在进行建库过程中，在本范围的混合物，可以很好的实现本发明 所述的共建库的方案。
本发明步骤(3)中的突变型Tn5转座酶可以按照常规方法预先和部分测序接头形成复 合物，所包埋的接头可适用于Illumina测序平台、Ion Torrent测序平台和华大智造MGI测序 平台。
本发明步骤(3)中的突变型Tn5转座酶可以结合于链霉亲和素磁珠上。
本发明步骤(3)所用的打断缓冲液、步骤(4)所用的扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物可以为本领域常规的打断缓冲液、扩增缓冲液、链置换和扩增酶混合物。
在本发明一种实施例中，使用磁珠法或柱式法进行DNA/RNA共提取；使用Rnase H法或 磁珠法对宿主rRNA进行去除；使用逆转录酶进行RNA逆转录合成cDNA一链；然后对DNA和RNA 的混合物使用Tn5转座酶(cDNA杂合链打断效率较高的Tn5转座酶)进行片段化同时连接部 分接头，用本发明特殊的5×TS-plus进行终止反应，使突变型Tn5转座酶失活；片段化后 的产物经过链置换和PCR文库扩增后，形成完整文库。
本发明所述的病原微生物检测的测序文库构建方法，流程图可以如图2所示，耗时约 3.5-5小时，相比于图1所示的耗时10-11小时的病原微生物DNA/RNA共建库流程大大缩短 了建库时间。
本发明目的之二在于提供一种用于病原微生物检测的测序文库构建的试剂盒，所述试 剂盒包含以下成分：
(1)样本保存液；
(2)rRNA去除组分；
(3)逆转录反应组分：包含逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物；
(4)突变型Tn5转座酶片段化组分：包含突变型Tn5转座酶、打断缓冲液、终止反应液5×TS-plus；
(5)链置换和文库扩增组分：包含链置换和扩增酶混合物、扩增缓冲液。
本发明所述试剂盒中的样本保存液包含：Tris-HCl 10mM-2M，PH＝7.0-9.0，盐酸胍 0.1M-8M，氯化钴0.5-10mM，EDTA.2Na 0.1M-2M，Triton X-100 0.1％-5％，脱氧胆酸钠0.1mM-4M；优选的，包含：Tris-HCl 50mM-200mM，PH＝7.0-9.0，盐酸胍1M-5M，氯化钴1-4mM，EDTA.2Na 0.1M-0.5M，Triton X-100 0.5％-2％，脱氧胆酸钠0.5mM-2M；进一步优选的， 包含Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M，Triton X-100 1％，脱氧胆酸钠1mM。
本发明所述试剂盒中的rRNA去除组分可以为本领域常规的组分，例如：包含rRNAProbe(H/M/R)、Probe Buffer、Rnase H Buffer、RNase H、DNase I Buffer、DNase I、Nuclease-free水等，还可以包含链霉亲和素磁珠、磁珠清洗缓冲液、杂交探针、杂交缓冲液等；或者rRNA去除组分直接使用南京诺唯赞生物科技有限公司Ribo-off rRNADepletion Kit(Human/Mouse/Rat)(货号N406)或使用基于链霉亲和素磁珠包被的rRNA探针抓取试剂 盒。
本发明所述试剂盒中的突变型Tn5转座酶和终止反应液5×TS-plus如前所述。
本发明所述试剂盒还可以包含纯化组分，所述纯化组分包含RNA纯化磁珠、DNA纯化磁珠、无核酸酶水。
本发明所述试剂盒中的(5)链置换和文库扩增组分中，还可以包含扩增引物。
本发明的逆转录酶可以为本领域常用的商业化逆转录酶，例如为南京诺唯赞生物科技 有限公司HiScript Reverse Transcriptase或HiScript II ReverseTranscriptase或HiScript III Reverse Transcriptase(货号R101或R201或R302)。
本发明的逆转录反应缓冲液可以为本领域常用的逆转录反应缓冲液，例如为南京诺唯 赞生物科技有限公司HiScript Reverse Transcriptase或HiScript II ReverseTranscriptase或 HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液，主要成分包括：100-500mM Tris-HCl(pH 8.3),100-500mM KCl,1-50mM MgCl2,1-500mM DTT。
本发明的逆转录引物为Oligo(dT)和随机引物的混合物，或Oligo(dT)，或随机引物。
本发明的打断缓冲液可以为本领域常用的商品化Tn5转座酶配套缓冲液，例如为南京 诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组 分，即TruePrep Tagment Buffer L。
本发明的RNA纯化磁珠可以为本领域常用的商品化RNA纯化磁珠，例如为南京诺唯赞 生物科技有限公司RNA纯化磁珠VAHTS RNA clean beads。
本发明的DNA纯化磁珠可以为本领域常用的商品化DNA纯化磁珠，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads。
本发明的无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌的双蒸水。
本发明的链置换和扩增酶混合物为有链置换活性的酶和DNA聚合酶的混合物，其中有 链置换活性的酶，可以如大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow片段、Bst DNA聚合酶、Phi29DNA 聚合酶、逆转录酶、Tth DNA聚合酶等；DNA聚合酶可以如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚 合酶、KOD DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶(如南京诺唯赞生物科技有限公司， 货号P505)或VAHTS HiFi DNA聚合酶(如南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616) 或TruePrepAmplify Enzyme(如南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2for Illumina试剂盒中的TAE组分)，或其他等效产品的混合物。
本发明的扩增缓冲液为大肠杆菌DNA聚合酶I、klenow片段、Bst DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA 聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)或VAHTS HiFi DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616)所适配的缓冲溶液，或 TruePrep AmplifyEnzyme南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的5×TAB组分，即TruePrep Amplify Buffer。主要成分包括10-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl，0.1-100mM醋酸钾、0.1-100mM硫酸铵的混合物，另外包含 BSA、Triton X-100等成分，pH在7.5-9.0之间。
本发明的扩增引物可以为本领常规的扩增引物，例如为南京诺唯赞生物科技有限公司 TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒。
本发明所述试剂盒中的逆转录酶、逆转录缓冲溶液、逆转录引物可以混合为一个或2 个混合物。
本发明所述试剂盒中的链置换和扩增酶混合物、扩增缓冲液、扩增引物可以混合为一 个或2个混合物。
本发明构建的文库可以进行质控，质控方法为Qubit或同等原理检测仪器和试剂检测 文库浓度，并使用Agilent 2100仪器检测文库峰型。
本发明还提供一种样本保存液，包含：Tris-HCl 10mM-2M，PH＝7.0-9.0，盐酸胍0.1M-8M，氯化钴0.5-10mM，EDTA.2Na 0.1M-2M，Triton X-100 0.1％-5％，脱氧胆酸钠0.1mM-4M；优选的，包含：Tris-HCl 50mM-200mM，PH＝7.0-9.0，盐酸胍1M-5M，氯化 钴1-4mM，EDTA.2Na 0.1M-0.5M，Triton X-100 0.5％-2％，脱氧胆酸钠0.5mM-2M；进 一步优选的，包含Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M， Triton X-1001％，脱氧胆酸钠1mM。本发明所述的保存液，在56℃保存1小时后，可 以使RNA不降解，而在此温度下，很多含有病毒的样品可以加温到56℃灭菌之后再做后 面的实验，有利于保护实验人员。
本发明还提供所述的样品保存液在含病原微生物样品保存中的应用。
本发明相对于现有技术的优势：
(1)本发明将图1所示的传统的耗时10-11个小时的病原微生物DNA/RNA共建库，缩短至仅需3.5-5个小时，大大缩短了建库时间，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多真实信息。
(2)本发明所述的保存液，在56℃保存1小时后，可以使RNA不降解，而在此温度下，很多含有病毒的样品可以加温到56℃灭菌之后再做后面的实验，有利于保护实验人员。
(3)本发明中运用的突变型Tn5转座酶(D24E、D97E、K160R和E326D同时突变) 具有较高的cDNA杂合链打断效率，打断终止缓冲液5×TS-plus可以让转座酶彻底失活，有 效防止转座酶粘在DNA上，有利于文库扩增，得到高产量的文库。
(4)所用的终止反应液5×TS-plus，可以使Tn5转座酶很好的失活，且不会粘在DNA上，对后续实验影响较小，因此即使不进行纯化也可以进行后续步骤，因此可以在突变型Tn5转座酶失活之后可进行磁珠纯化，也可以不进行纯化直接进入下一步的反应，本发明实施例可见，无论是否纯化都能实现很好的建库效果。
本发明中的部分定义：
高通量测序技术：又称为第二代测序技术、下一代测序技术，可简写为NGS。是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。
转座酶：执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把 转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。Tn5转座酶 是转座酶中的一种，具有随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，是应用于分子 遗传和基因测序的高效工具。
附图说明
图1为本方案的病原微生物检测DNA/RNA共建库流程；
图2为传统的病原微生物检测DNA/RNA共建库流程；
图3为实施例2中样本于两种保存液中4℃存放24h的电泳图；
图4为实施例2中样本于两种保存液中56℃存放1h的电泳图；
图5为实施例3用TS-plus进行终止反应(实验组二)的Agilent 2100文库峰型；
图6为实施例3用TS组分进行终止反应(对照组二)的Agilent 2100文库峰型；
图7为实施例3TTE-plus Tn5转座酶打断(实验组一)和TTE Tn5转座酶打断(对 照组一)的文库电泳图；
图8为实施例4中的Agilent 2100文库峰型；
图9为实施例5中的Agilent 2100文库峰型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改 进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领 域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店 购买得到的。
本发明的核心是用于对病原微生物的快速简便建库，优势在于样本保存液可以更好的 防止核酸降解；另外，因突变型的Tn5转座酶对cDNA杂合链具有很好的打断效率，打断终 止缓冲液能使转座酶彻底失活，建库流程短，建库所需操作时间短，降低了对样本起始量 的要求，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多病原微生物信息，帮助患者和医护 人员快速得到检测结果。
实施例1：突变型Tn5转座酶的获取
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变型Tn5转座酶的制备方法，包括如下步骤：利用基因合成的方法，合成包含了需要突变的位点和替换过的碱基的引物序列如下：
D24-f：CGGCGCTGGGTGAGCCTCGCCGTA
D24-r：TACGGCGAGGCTCACCCAGCGCCG
A97-f：GCCATTGAGGAAACCACCT；
A97-r：AGGTGGTTTCCTCAATGGC；
K160-f：TGCGGATGAAAGGGAGAGTGGCAA
K160-r：TTGCCACTCTCCCTTTCATCCGC
C326-f：CGGATCGACGAGTTCCATA；
C326-r：TATGGAACTCGTCGATCCG；
以Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产， Vazyme，货号P505)为DNA聚合酶。扩增条件为95℃30s；95℃15s；60℃15s；72℃30s-3min；72℃5min；共30个循环。扩增结束后，在50μl反应体系中直接加入1μl DpnI， 37℃恒温孵育2小时，消化原始质粒模板。以1％-1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳，得到目 的条带后切胶回收。将回收产物利用Mut
取20μl冷却反应液，加入到100μl Bl21感受态细胞(Vazyme)中，轻弹管壁数下 混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入500μl LB培养基， 37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有氨苄青霉 素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，测序验证。测序结果 表明：本发明合成的突变型Tn5转座酶的基因序列如SEQ NO.2所示，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
实施例2：检测样本保存液稳定性
本发明中的样本保存液，包含：Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M，Triton X-100 1％,脱氧胆酸钠1mM。
正常人咽拭子标本放入本发明中的样本保存液和市面售卖的样本保存液中，一组在 4℃存放24小时，一组在56℃存放1小时，后用常规实验方法提取RNA，得到如图3和 图4所示结果，图3是4℃存放24小时，前3孔是放在本发明的样本保存液中，后3孔 是放在市面售卖的样本保存液中；图4是56℃存放1小时，前2孔是放在本发明的样本 保存液中，后3孔是放在市面售卖的样本保存液中。
4℃保存24小时，市售样本保存液核酸开始降解，mRNA三条带开始弥散，而本发 明的样本保存液条带完整；56℃1小时，市售样本保存液核酸严重降解，而本发明的样 本保存液条带完整。说明本发明所述的样品保存液在56℃保存1小时后，可以使RNA不 降解，而在此温度下，很多含有病毒的样品可以加温到56℃灭菌之后再做后面的实验， 有利于保护实验人员。
实施例3：基于突变型Tn5转座酶的DNA/RNA快速共同建库
本实施例的核心在于DNA/RNA的快速共同建库，本实施例中使用的逆转录酶为南京 诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase(货号R302)；使用的逆转录反 应缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III ReverseTranscriptase所附带缓冲溶 液；使用的逆转录引物为Oligo(dT)20VN和随机引物的混合物；Tn5转座酶为D24E、D97E、 K160R和E326D同时突变的突变体，即：TTE-plus。打断缓冲液为南京诺唯赞生物科技有 限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep Tagment Buffer L；打断终止缓冲液5×TS-plus，包含：2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS， 25mM DTT；RNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科技有限公司RNA纯化磁珠VAHTS RNA clean beads；DNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads；无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌的双蒸水；链置换和扩增酶混合物为Bst DNA聚合酶和Phanta高保真DNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)的 混合物；扩增缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNAlibrary Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的5×TAB组分，即TruePrep AmplifyBuffer。扩增引物为南京诺唯赞生物 科技有限公司TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒，货号TD202。本实施例以100ng人源 HEK293细胞所提取的DNA和RNA混合物作为反应模板，具体建库流程如下：
1、逆转录反应
(1)RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下表1混合液：
【表1】
65℃加热5min打开RNA的二级结构，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
(2)配制逆转录反应体系如表2：
【表2】
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)逆转录反应条件如表3：
【表3】
2.Tn5转座酶片段化反应 (1)配制片段化反应体系如表4： 【表4-1】实验组一混样体系
【表4-2】对照组一混样体系
注：TTE-plus是D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul；
TTE是D97E和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul， 取自专利“一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用”，申请号：201611196754.4。
本步骤中实验组一用TTE-plus打断，对照组一用TTE打断，进行平行实验，比较打断 效率。
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
(2)片段化反应条件如表5
【表5】
实验组二：反应完成后立即向实验组一(TTE-plus打断)的产物中加入5μl 5×TS-plus (2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT)，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
对照组二：反应完成后立即向实验组一(TTE-plus打断)的产物中加入普通的打断终 止缓冲液，如南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 forIllumina 试剂盒中的TS组分，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
3.产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS RNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠 上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入25μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取23μl上清至新的灭菌PCR管中。
4、链置换和文库扩增
(1)配制链置换和文库扩增反应体系如表6
【表6】
使用移液器轻轻吹打混匀。
(2)链置换和文库扩增反应条件
在PCR仪中运行如下表7程序，热盖设置为105℃。
【表7】
5.扩增产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠 上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中。
6.Qubit检测文库浓度
使用Qubit对所得文库进行浓度测定，计算文库产出表8为TS-plus终止和TS终止所得 出的文库产量，可见TS-plus终止效果更好，得到的产量更多。
【表8】
7、实验组一TTE-plus Tn5转座酶打断和对照组一TTE Tn5转座酶打断的文库用2％的电 泳胶跑胶，得到图7所示结果，图中4m是实验组一TTE-plus Tn5转座酶打断的文库，2m是 对照组一TTE Tn5转座酶打断的文库，可见，TTE-plus Tn5转座酶(D24E、D97E、K160R和 E326D同时突变)比TTE Tn5转座酶(D97E和E326D同时突变)片段打断的更小，对cDNA 杂合链打断效果更好。
8、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析， 得到下图5、图6所示结果，图5是用TS-plus进行终止反应(实验组二)的文库Agilent 2100 文库峰型，图6是TS组分进行终止反应(对照组二)的Agilent 2100文库峰型。根据2100 图和所得文库产量(表8)可见，使用本方案进行DNA和RNA的共同建库，所得文库产量 较高，2100峰型与传统建库所得文库一致。
9、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到下表9数据。
【表9】具体的测序数据情况
由表9中数据可知，从Reads数、GC含量、Q20、Q30、Clean Rate、Mapping Rate、Duplication Rate、Average sequencing depth、Coverage、表达基因数等信息来看，DNA/RNA 共建库流程得到的文库质量高，数据均一度好。
本实施例步骤3产物纯化此步可以没有，不会对结果产生重要影响。
实施例4：一种用于病原微生物检测的快速简便的测序文库构建方法
本实施例中使用的样本保存液，包含：Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M，Triton X-100 1％,脱氧胆酸钠1mM；使用的核酸提取试剂为 南京诺唯赞生物科技有限公司磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂，货号RM101；使用的rRNA 去除试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat) (货号N406)；使用的逆转录酶为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III ReverseTranscriptase(货号R302)；使用的逆转录反应缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液；使用的逆转录引物为Oligo(dT)20VN和随 机引物的混合物；Tn5转座酶为D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变体，即：TTE-plus。打断缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep KitV2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep Tagment Buffer L；打断终止缓冲液5× TS-plus，包含：2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT；RNA纯化磁珠为南京 诺唯赞生物科技有限公司RNA纯化磁珠VAHTS RNA clean beads；DNA纯化磁珠为南京诺 唯赞生物科技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads；无核酸酶水为经过DEPC 处理后灭菌的双蒸水；链置换和扩增酶混合物为Bst DNA聚合酶和Phanta高保真DNA聚合 酶(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P505)的混合物；扩增缓冲液为南京诺唯赞生物 科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的5×TAB组分，即TruePrep Amplify Buffer。扩增引物为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep IndexKit for Illumina试剂盒，货号TD202。
本实施例以1份正常人咽拭子标本作为病原微生物检测的样本，具体建库流程如下：
1、样本采集和保存：
在咽峡深部(悬雍垂及扁桃体两侧)利用拭子反复刮取获得样本；
将拭子头浸没到样本保存液中，折断尾部并弃去，旋紧管盖，装于一次性自封袋中， 便于运输和保存；
2.核酸提取：
预先分装20μL蛋白酶K至新的1.5mL无核酸酶EP管中，再加入600μL上述样本 保存液和300μL无水乙醇，轻微涡旋或上下颠倒混匀后加入20μL磁珠，涡旋混匀15 sec，室温孵育5min，期间上下颠倒混匀2次。瞬时离心后将EP管置于磁力架上，静 置1min后弃上清。之后按照RM101提取试剂盒说明书操作，使用700μL洗涤液和 700μL漂洗液分别清洗后，使用洗脱液回收核酸至新的1.5mL无核酸酶离心管中。
3.rRNA去除：
(1)将一部分核酸取出备用。
(2)在一个Nuclease-free PCR管中，用Nuclease-free水将100ng总核酸稀释至11μl， 冰上放置备用。
(3)配制杂交反应液如表10,经过设计的DNA探针可与rRNA特异配对。
【表10】
(4)杂交反应，条件如表11
【表11】
(5)消化反应，具体如表12，Rnase H可识别DNA/RNA杂合链，并切割其中的RNA链。
【表12】
37℃反应30min。
(6)DNase I消化反应，如表13，Dnase I去除DNA探针。
【表13】
37℃反应30min。
(7)使用
7.1.涡旋振荡混匀
7.2.冰上静置15分钟，使RNA结合到磁珠上。
7.3.将样品置于磁力架5分钟，待溶液澄清后，小心移除上清。
7.4.保持样品始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(注意不要 吹散磁珠)，室温孵育30秒，小心移除上清。
7.5.重复上一步骤，总计漂洗2次。
7.6.保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10分钟。
7.7.将样品从磁力架上取出，加入10.5μl Nuclease-free水，用移液器吹打6次以充分 混匀，室温静置2分钟。在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取8μl上清至一个 新的Nuclease-free PCR管中。
4.逆转录反应
(1)RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下表14混合液：
【表14】
65℃加热5min打开RNA的二级结构，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
(2)配制逆转录反应体系如表15
【表15】
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)逆转录反应条件如表16
【表16】
5.Tn5转座酶片段化反应
(1)配制片段化反应体系如表17
【表17】
注：TTE-plus是D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul。
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
(2)片段化反应条件如表18
【表18】
反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS-plus(2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS， 25mM DTT)，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
6.产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS RNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打 断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入25μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹 打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min) 小心吸取23μl上清至新的灭菌PCR管中。
7、链置换和文库扩增
(1)配制链置换和文库扩增反应体系如表19
【表19】
使用移液器轻轻吹打混匀。
(2)链置换和文库扩增反应条件
在PCR仪中运行如下表20程序，热盖设置为105℃。
【表20】
8.扩增产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(1.2×)加入到上一步打 断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹 打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min) 小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中。
9.Qubit检测文库浓度
使用Qubit对所得文库进行浓度测定，计算文库产出，所得文库浓度为52ng/μl，文库 总产量1040ng。
10、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行 分析，得到下图8所示结果。
根据2100图和所得文库浓度可见，使用本方案进行病原微生物的DNA和RNA的共同建库，所得文库浓度较高，2100峰型与传统建库所得文库一致。
11、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到下表21和表22数据。
表21：具体的测序数据情况
【表22】
表21是测序得到的数据和人的已知数据的比对，得到的结果；表22是将测序得到的数 据与各种病原微生物的已知数据进行比对的结果，表中Reads数不为零，说明在样本中检 测到了这些病原微生物的基因序列。由表21和表22中数据可知，从Reads数、GC含量、Q20、 Q30、Clean Rate、Mapping Rate、Duplication Rate和检测到的物种数，以及其中病原微生 物的reads数等信息来看，本病原微生物建库检测流程得到的文库质量高，病原检出率高。
实施例5：一种用于病原微生物检测的快速简便的测序文库构建方法
本实施例中使用的样本保存液，包含：Tris-HCl 100mM，PH＝8.0，盐酸胍3M，氯化钴2mM，EDTA.2Na 0.2M，Triton X-100 1％,脱氧胆酸钠1mM；使用的核酸提取试剂为 南京诺唯赞生物科技有限公司柱式法病毒DNA/RNA提取试剂，货号RC311；使用的rRNA 去除试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司Ribo-off Beads rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)(货号N416)；使用的逆转录酶为南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript III ReverseTranscriptase(货号R302)；使用的逆转录反应缓冲液为南京诺唯赞生物科技 有限公司HiScript III Reverse Transcriptase所附带缓冲溶液；使用的逆转录引物为Oligo(dT)20VN；Tn5转座酶为D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变体，即：TTE-plus； 打断缓冲液为南京诺唯赞生物科技有限公司TruePrep DNA library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒中的TTBL组分，即TruePrep Tagment Buffer L；打断终止缓冲液5×TS-plus，包含：2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS，25mM DTT；DNA纯化磁珠为南京诺唯赞生物科 技有限公司DNA纯化磁珠VAHTS DNA clean beads；无核酸酶水为经过DEPC处理后灭菌 的双蒸水；链置换和扩增酶混合物为Bst DNA聚合酶和VAHTS HiFi高保真DNA聚合酶(南 京诺唯赞生物科技有限公司，货号N616)的混合物。扩增引物为南京诺唯赞生物科技有限 公司TruePrep Index Kit for Illumina试剂盒，货号TD203。
本实施例以1份人痰液标本作为病原微生物检测的样本，具体建库流程如下：
1、样本采集和保存：
深咳后将痰液直接咳入含样本保存液的50ml离心管中，旋紧管盖后轻轻混匀，装于 一次性自封袋中，便于运输和保存；
2.核酸提取：
预先分装200μL无水乙醇至新的1.5mL无核酸酶EP管中，再加入500μL上 述样本保存液，上下颠倒混匀后，将全部混合液加入到吸附柱中(吸附柱置于2mL收集 管内)，盖好管盖，12,000×g离心1min；弃滤液后按照提取试剂盒说明书操作，使用600 μL漂洗液漂洗2次，使用洗脱液回收核酸至1.5mL收集管(试剂盒提供)中。
3.rRNA去除：
3.1磁珠清洗：涡旋振荡混匀Magnetic Beads，吸取225μL至1.5ml RNase-Free无菌 离心管。将磁珠置于磁力架上1min，待溶液澄清后，用移液器小心移除上清。再加入225μL Resuspension Solution清洗磁珠，轻轻吸打数次。将磁珠置于磁力架上1min，待溶液澄清后，用移液器小心移除上清。重复清洗一次后，加入65μL Resuspension Solution混匀磁珠，并加入1μL RNase Inhibitor混匀后室温待用。
3.2探针与rRNA杂交：配制如下表23体系
【表23】
用移液枪轻轻吹打10次混匀后，瞬时离心，68℃反应10min，25℃反应5min。
3.3rRNA去除：将上述40μl RNA-Probe反应液转至65μl已清洗的Magnetic Beads中，用移液枪吸吹混匀10次。室温25℃，孵育5min后，50℃孵育10min。期间多次轻 弹混匀，避免磁珠沉降。立刻放置磁力架上，打开管口，1min后液体澄清。吸取90-100 μl含有RNA的上清液至新管，置冰上。
3.4RNA纯化
(1)涡旋振荡混匀VAHTS RNA Clean Beads，吸取220μl(约2.2倍体积)至上 一步的100μl RNA产物，用移液器吸吹混匀10次。
(2)冰上放置15min，使RNA充分结合到磁珠上。
(3)将样品置于磁力架上2min，待溶液澄清后，用移液器小心移除上清。
(4)保持样品始终处于磁力架上，加入400μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室 温孵育30sec，小心移除上清。
(5)重复步骤4进行漂洗。
(6)将样品放回磁力架，用移液器小心弃去所有液体。
(7)保持样品始终处于磁力架上，开盖晾干磁珠3～5min
(8)将样品从磁力架上取出，加入10μl Rnase-free ddH2O，用移液器吹打10次混匀磁珠，室温静置2min。
(9)在磁力架上静置2min，待溶液澄清后，不要触动磁珠，小心吸取8μl上清进 入下一步骤。
4.逆转录反应：
(1)RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下表24混合液：
【表24】
65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
(2)配制逆转录反应体系，如表25
【表25】
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)逆转录反应条件如表26
【表26】
5.Tn5转座酶片段化反应
(1)配制片段化反应体系，如表27
【表27】
TTE-plus是D24E、D97E、K160R和E326D同时突变的突变型Tn5转座酶，在反应体系中的终浓度为5ng/ul；
使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
(2)片段化反应条件如表28
【表28】
反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS-plus(2.5％BSA，1％Tween-20，0.5％SDS， 25mM DTT)，使用移液器轻轻吹打充分混匀。
6、链置换和文库扩增
(1)配制如表29链置换和文库扩增反应体系
【表29】
使用移液器轻轻吹打混匀。
(2)链置换和文库扩增反应条件
在PCR仪中运行如下表30程序，热盖设置为105℃。
【表30】
7.扩增产物纯化
(1)涡旋振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取120μl(1.2×)加入到上一步 打断产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。室温孵育5min，使核酸结合到磁珠上。
(2)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(3)保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵 育30sec，小心移除上清。
(4)重复步骤(3)，总计漂洗两次。
(5)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
(6)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
(7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min) 小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中。
8.Qubit检测文库浓度
使用Qubit对所得文库进行浓度测定，计算文库产出，所得文库浓度为93ng/μl，文库 总产量1860ng。
9、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行 分析，得到下图9所示结果。
根据2100图和所得文库浓度可见，使用本方案进行DNA和RNA的共同建库，所得文库浓度较高，2100峰型与传统建库所得文库一致。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司
<120> 一种用于病原微生物检测的测序文库构建方法和试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Thr Ser Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val
1 5 1015
Phe Ser Ser Ala Ala Leu Gly Glu Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val
202530
Asn Val Ala Ala Gln Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile
354045
Ser Ser Glu Gly Ser Glu Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Tyr
505560
Arg Asn Pro Asn Val Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met
65707580
Gln Thr Val Lys Leu Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu
859095
Glu Thr Thr Ser Leu Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly
100 105 110
Lys Leu Gly Ser Ile Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser
115 120 125
Val Leu Leu Leu Glu Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His
130 135 140
Gln Glu Trp Trp Met Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Arg
145 150 155 160
Glu Ser Gly Lys Trp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met
165 170 175
Gly Ser Met Met Ser Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp
180 185 190
Ile His Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val
195 200 205
Val Arg Ser Lys His Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu
210 215 220
Ile Asp His Leu Lys Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser
225 230 235 240
Ile Pro Gln Lys Gly Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg
245 250 255
Pro Ala Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu
260 265 270
Lys Gln Gly Asn Ile Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn
275 280 285
Pro Pro Lys Gly Glu Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Gly Glu
290 295 300
Pro Val Glu Ser Leu Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr
305 310 315 320
His Arg Trp Arg Ile Asp Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Glu Arg Gln Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met
340 345 350
Val Ser Ile Leu Ser Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu
355 360 365
Ser Phe Thr Pro Pro Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu
370 375 380
Ala Glu His Val Glu Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp
385 390 395 400
Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys
405 410 415
Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu
420 425 430
Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala
435 440 445
Leu Trp Gly Trp Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala
450 455 460
Ala Lys Asp Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
465 470 475
<210> 2
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgataactt ctgctcttca tcgtgcggcc gactgggcta aatctgtgtt ctcttcggcg 60
gcgctgggtg agcctcgccg tactgcccgc ttggttaacg tcgccgccca attggcaaaa 120
tattctggta aatcaataac catctcatca gagggtagtg aagccatgca ggaaggcgct 180
taccgatttt accgcaatcc caacgtttct gccgaggcga tcagaaaggc tggcgccatg 240
caaacagtca agttggctca ggagtttccc gaactgctgg ccattgagga aaccacctct 300
ttgagttatc gccaccaggt cgccgaagag cttggcaagc tgggctctat tcaggataaa 360
tcccgcggat ggtgggttca ctccgttctc ttgctcgagg ccaccacatt ccgcaccgta 420
ggattactgc atcaggagtg gtggatgcgc ccggatgacc ctgccgatgc ggatgaaagg 480
gagagtggca aatggctggc agcggccgca actagccggt tacgcatggg cagcatgatg 540
agcaacgtga ttgcggtctg tgaccgcgaa gccgatattc atgcttatct gcaggacagg 600
ctggcgcata acgagcgctt cgtggtgcgc tccaagcacc cacgcaagga cgtagagtct 660
gggttgtatc tgatcgacca tctgaagaac caaccggagt tgggtggcta tcagatcagc 720
attccgcaaa agggcgtggt ggataaacgc ggtaaacgta aaaatcgacc agcccgcaag 780
gcgagcttga gcctgcgcag tgggcgcatc acgctaaaac aggggaatat cacgctcaac 840
gcggtgctgg ccgaggagat taacccgccc aagggtgaga ccccgttgaa atggttgttg 900
ctgaccggcg aaccggtcga gtcgctagcc caagccttgc gcgtcatcga catttatacc 960
catcgctggc ggatcgacga gttccataag gcatggaaaa ccggagcagg agccgagagg 1020
caacgcatgg aggagccgga taatctggag cggatggtct cgatcctctc gtttgttgcg 1080
gtcaggctgt tacagctcag agaaagcttc acgccgccgc aagcactcag ggcgcaaggg 1140
ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 1200
gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 1260
agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga 1320
accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 1380
gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatct 1429
