一种微生物样品的快速检测方法及系统
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种微生物样品的快速检测方法及系统。
背景技术
随着社会的不断进步，使得对于工厂的排水、食品以及药品中的微生物的检测十分必要；目前对微生物的检测基本采用平板菌落计数法对微生物进行检测；
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。采用平板菌落计数法检测微生物检测需要耗费48-72小时，使得耗费较长的检测时间，并不能实现对微生物的快速检测。
因此，提出一种微生物样品的快速检测方法及系统。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种微生物样品的快速检测方法及系统，用以实现对微生物样品的快速检测。
本发明实施例中提供了一种微生物样品的快速检测方法，所述方法包括：
步骤1：获取微生物样品；
步骤2：提取所述微生物样品中的核酸；
步骤3：采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；
步骤4：利用二代测序平台对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；
步骤5：根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果。
在一个实施例中，所述步骤2：提取所述微生物样品中的核酸，包括如下步骤：
将胺基引入目标对象中以对所述目标对象进行改性，所述目标对象包括薄膜装置、磁珠、环形谐振器或纳米颗粒中的至少一种；
将DTBP和经过所述裂解处理所述微生物样品所得到的核酸注入到经改性的所述目标对象上，以生成所述DTBP和所述核酸的复合物；
采用洗脱缓冲液处理所述DTBP和所述核酸的复合物，以提取所述微生物样品中的核酸。
在一个实施例中，所述步骤2：提取所述微生物样品中的核酸，包括如下步骤：
将所述微生物样品进行裂解处理，以释放所述微生物样品中的核酸，将所述微生物样品进行裂解处理，包括：机械法、反复冻融法、高温煮沸法、酶降解法、胍盐裂解法、碱裂解法、CTAB裂解法、酚裂解法中的一种或多种；
将经过所述裂解处理的所述微生物样品进行纯化处理，以去除所述微生物样品中的杂质，将经过所述裂解处理的所述微生物样品进行纯化处理，包括：有机溶剂-乙醇沉淀法、硅膜吸附法、磁珠法、阴离子交换法、核酸自动化提取法中的一种或多种。
在一个实施例中，所述步骤3中采用病原微生物检测试剂盒构建基因组DNA测序文库执行以下步骤：
获取病原微生物检测试剂盒，所述病原微生物检测试剂盒包括识别四个碱基的限制性内切酶混合液、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、连接促进剂、dNTP、ATP、接头、高保真DNA聚合酶以及二硫苏糖醇；
采用病原微生物检测试剂盒构建基因组DNA测序文库，对样本DNA进行酶切法片段化，得到片段化DNA；对所述片段化DNA直接进行末端修复和加dA尾，得到末端修复和加dA尾的DNA；将所述末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，得到带有barcode的接头连接产物；对带有barcode的接头连接产物进行PCR扩增，得到所述基因组DNA测序文库。
在一个实施例中，采用第二代测序技术对所提取的所述微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息包括如下步骤：
根据待检测的所述微生物样本的属性构建不同的文库，所述文库包括全基因组建库、目标区段捕获建库或转录组建库；
采用第二代测序仪对所提取的所述微生物样品中的核酸进行测序，记录碱基信号，所述测序包括边合成边测序或边连接边测序；
对所述碱基信号进行数据处理，所述数据处理包括序列比对、局部比对或碱基质量校正。
在一个实施例中，所述步骤5：根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果，包括如下步骤：
构建微生物基因组数据库；
将所述核酸序列信息与微生物基因组数据库进行对比分析，以确定所述微生物样品中的微生物种类及含量。
在一个实施例中，在所述步骤2中，提取所述微生物样品中的核酸，还包括如下步骤：
步骤A201、根据所述微生物样品，确定所述微生物样品的位置信息，根据所述微生物样品的位置信息，确定所述微生物样品的总核能；
其中，P为所述微生物样品的总核能，N为所述微生物样品中含有的微生物种群数量，First为第一预设值，di,j为所述微生物样品中第i个种群与第j个种群之间的距离，Second为第二预设值，Qi为所述微生物样品中第i个种群的原子电荷数，Qj为所述微生物样品中第j个种群的原子电荷数，i＝1、2、3…N，j＝1、2、3...N；
步骤A202、确定所述微生物样品的相互作用能；
其中，Energy为所述相互作用能，Fm为预设矫正系数，T为当前温度，
步骤A203、控制提取所述微生物样品中的核酸时的加工温度；
其中，TJ为所述加工温度；
步骤A204、控制提取所述微生物样品中的核酸时的温度为所述加工温度。
本发明实施例提供的一种微生物样品的快速检测方法，具有以下有益效果：不需要对微生物样品进行培养，只需对微生物样品进行提取处理后，对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，根据核酸序列信息便可获取微生物样品的检测结果，大大缩短了检测所耗费的时间，从而实现了对微生物样品的快速检测。
本发明还提供一种微生物样品的快速检测系统，所述系统包括：
微生物获取模块，用于获取微生物样品；
核酸提取模块，用于提取所述微生物样品中的核酸；
测序文库构建模块，用于采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；
测序模块，用于利用二代测序对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；
检测结果获取模块，用于根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果。
本发明实施例提供的一种微生物样品的快速检测系统，具有以下有益效果：不需要对微生物样品进行培养，只需对微生物样品进行提取处理后，对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，根据核酸序列信息便可获取微生物样品的检测结果，大大缩短了检测所耗费的时间，从而实现了对微生物样品的快速检测。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明所提供一种微生物样品的快速检测方法的示意图；
图2为本发明所提供一种微生物样品的快速检测系统的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种微生物样品的快速检测方法，如图1所示，所述方法包括：
步骤1：获取微生物样品；
步骤2：提取所述微生物样品中的核酸；
步骤3：采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；
步骤4：利用二代测序对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；
步骤5：根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果。
上述方法的工作原理在于：获取微生物样品；提取微生物样品中的核酸；采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；利用二代测序对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；根据核酸序列信息，获取微生物样品的检测结果。
在所述步骤4中，采用第二代测序技术对所提取的所述微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，借助于第二代测序技术，可以实现高通量测序。
上述方法的有益效果在于：通过提取微生物样品中的核酸，对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；利利用二代测序对所构建文库进行测序获取核酸序列信息；根据核酸序列信息，获取微生物样品的检测结果；与传统技术相比，上述方法不需要对微生物样品进行培养，只需对微生物样品进行提取处理后，对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，根据核酸序列信息便可获取微生物样品的检测结果，大大缩短了检测所耗费的时间，从而实现了对微生物样品的快速检测。
在一个实施例中，所述步骤2：提取所述微生物样品中的核酸，包括如下步骤：
将胺基引入目标对象中以对所述目标对象进行改性，所述目标对象包括薄膜装置、磁珠、环形谐振器或纳米颗粒中的至少一种；
将DTBP和经过所述裂解处理所述微生物样品所得到的核酸注入到经改性的所述目标对象上，以生成所述DTBP和所述核酸的复合物；
采用洗脱缓冲液处理所述DTBP和所述核酸的复合物，以提取所述微生物样品中的核酸。
上述方法的工作原理在于：由于DTBP(3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯)可形成可逆交联结构，因此被用作细胞、蛋白质以及核酸的氨基反应性交联剂。通过DTBP和核酸之间快速且强烈的相互偶联，不同于DTBP和蛋白质之间的相互作用，可以快速地从微生物样品中提取核酸。
上述方法的有益效果在于：提供了提取微生物样品中的核酸的具体步骤，可以快速地从微生物样品中提取核酸。
在一个实施例中，所述步骤2：提取所述微生物样品中的核酸，包括如下步骤：
将所述微生物样品进行裂解处理，以释放所述微生物样品中的核酸，将所述微生物样品进行裂解处理，包括：机械法、反复冻融法、高温煮沸法、酶降解法、胍盐裂解法、碱裂解法、CTAB裂解法、酚裂解法中的一种或多种；
将经过所述裂解处理的所述微生物样品进行纯化处理，以去除所述微生物样品中的杂质，将经过所述裂解处理的所述微生物样品进行纯化处理，包括：有机溶剂-乙醇沉淀法、硅膜吸附法、磁珠法、阴离子交换法、核酸自动化提取法中的一种或多种。
上述方法的工作原理在于：裂解处理主要是通过物理、化学或生物的方式对微生物样品进行处理，达到释放核酸的目的，其中机械法通过机械力破坏微生物的结构；反复冻融法将微生物反复冻融三次以上，使微生物结构溶胀并最终破裂释放核酸；高温煮沸法将微生物样品直接加入到纯水中煮沸，高速离心沉淀杂质，释放出的核酸位于上清液中；酶降解法通过将溶菌酶或蛋白酶加入微生物样品中，破坏微生物样品的结构，降解染色体中的蛋白质，促进核酸的分离；胍盐裂解法采用异硫氰酸胍、肌酸胍、盐酸胍之类的胍盐裂解微生物样品，并使核酸酶失活，阻止核酸被核酸酶降解；碱裂解法采用十二烷基硫酸钠(SDS)之类的强碱物质在低离子强度溶液中沉淀酸性多糖和核酸；酚提取法是采用苯酚等蛋白强变性剂提取核酸。
纯化处理是利用核酸分子的生物特征，用化学或物理的方法消除微生物样品裂解后的杂质，以达到纯化核酸的过程，有机溶剂-乙醇沉淀法是将核酸在乙醇溶液中析出沉淀，用有机溶剂除去蛋白质等杂质，并用预冷的乙醇或异丙醇沉淀核酸；硅膜吸附法是利用带负电荷的核酸骨架与带正电荷的二氧化硅的高亲和力，在高盐酸性环境下通过钠离子发挥纽带作用使核酸与硅膜紧密结合，通过洗涤除杂后在低盐中性或弱碱性环境下洗脱核酸；磁珠法是采用表面包覆有可逆吸附核酸特性的活性基团的生物磁珠，在一定的离子强度和pH下吸附核酸，通过外磁场的作用达到固液相的结合与分离，然后通过洗脱而得到高纯度的核酸；阴离子交换法利用阴离子交换树脂表面携带的正电荷和核酸骨架上携带的负电荷，在低盐碱性下结合核酸，在高盐酸下洗脱核酸；核酸自动化提取法采用磁珠法或硅膜法的原理实现高通量，节省了时间成本和人力成本。
上述方法的有益效果在于：提供了微生物样品中的核酸的具体方法。
在一个实施例中，所述步骤3中采用病原微生物检测试剂盒构建基因组DNA测序文库执行以下步骤：
获取病原微生物检测试剂盒，所述病原微生物检测试剂盒包括识别四个碱基的限制性内切酶混合液、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、连接促进剂、dNTP、ATP、接头、高保真DNA聚合酶以及二硫苏糖醇；
采用病原微生物检测试剂盒构建基因组DNA测序文库，对样本DNA进行酶切法片段化，得到片段化DNA；对所述片段化DNA直接进行末端修复和加dA尾，得到末端修复和加dA尾的DNA；将所述末端修复和加dA尾的DNA与接头进行连接，得到带有barcode的接头连接产物；对带有barcode的接头连接产物进行PCR扩增，得到所述基因组DNA测序文库。
上述方法的工作原理在于：所述限制性内切酶混合液为MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII中的多种酶的组合，所述连接促进剂由由聚乙二醇6000、牛血清白蛋白和曲拉通X-100所组成。
上述方法的有益效果在于：采用病原微生物检测试剂盒构建基因组DNA测序文库，可以加快测序文库构建的速度，进一步缩短了检测微生物样品所耗费的时间。
在一个实施例中，采用第二代测序技术对所提取的所述微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息包括如下步骤：
根据待检测的所述微生物样本的属性构建不同的文库，所述文库包括全基因组建库、目标区段捕获建库或转录组建库；
采用第二代测序仪对所提取的所述微生物样品中的核酸进行测序，记录碱基信号，所述测序包括边合成边测序或边连接边测序；
对所述碱基信号进行数据处理，所述数据处理包括序列比对、局部比对或碱基质量校正
上述方法的工作原理在于：以Illumina平台为例，Illumina平台拥有从低通量的Mini-Seq到超高通量的HiSeq X Ten的众多系列，Illumina平台的测序技术基于可逆终止子的边合成边测序技术，其测序流程主要分为三部分：建库、桥式扩增成簇反应和SBS过程。
建库包括将模板剪切到测序平台要求的片段长度，在片段化的模板两端添加测序平台特有的测序引物、标签序列和簇生成引物；利用簇生成引物进行文库富集完成建库。不同的检测样本，如基因组DNA、转录组mRNA和小RNA，或者不同测序目的，如全基因组测序、全外显子测序、单细胞基因组测序和染色质免疫共沉淀测序都会构建不同的文库。
成簇反应在专用的微流体cluster station或cBot仪器内进行，构建的文库经碱性变性成单链后引入玻璃制流动池内，流动池表面有与接头上桥式扩增引物完全互补的序列，通过加热和降温的过程，单链文库随机与玻璃制流动池表面上的锚定序列杂交。
SBS过程类似于sanger测序，添加了dNTPs，可阻止后续的碱基延伸，在测序反应时，测序引物与玻璃制流动池上的单链模板杂交，同时添加4中携带特定荧光的dNTP，在DNA聚合酶和可逆终止子的作用下，每一循环都是单碱基延伸，产物会添加上4中携带特定荧光的dNTP中的一种，未结合的dNTPs会被洗脱，通过采集荧光基团产生的信号确定添加的碱基类型，随后通过化学作用去除荧光基团和终止基团，使链末端的碱基变为可延伸的状态，重复进行碱基延伸过程和信号收集的过程
上述方法的有益效果在于：采用第二代测序技术对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，提升了测序通量，同时也降低了测序成本。
在一个实施例中，所述微生物样品包括食品、土壤、动物的体液或组织，所述微生物包括病毒或细菌。
上述方法的工作原理在于：所述微生物样品来源于哺乳动物，例如人类。另外，所述微生物样品可以来源于脊椎动物。
所述微生物样品包括：尿液、血液、皮肤、血浆、血清、唾液、创伤组织、创伤渗出物、活组织检查物、粪便、实体组织等。所述待检测样品来源于：呼吸道、泌尿生殖道、生殖道、中枢神经系统等。
需要说明的是，所述微生物样品可以来源于植物、食物。并且所述待检测样品还可通过从环境中的土壤或空气或水，或与环境接触的表面获得。
微生物包括病毒或细菌，例如可以是沙门菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌、巨细胞病毒、人多瘤病毒、人疱疹病毒、、黄曲霉、灰绿曲霉、黑曲霉、总状毛霉A、总状毛霉B、乳卵孢霉、扩展青霉、娄地青霉、指状青霉、黑根霉等。
上述方法的有益效果在于：提供了微生物样品的来源，本发明的微生物样品的快速检测方法可以实现不同来源的多种微生物的检测。
在一个实施例中，所述步骤5：根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果，包括如下步骤：
构建微生物基因组数据库；
将所述核酸序列信息与微生物基因组数据库进行对比分析，以确定所述微生物样品中的微生物种类及含量。
上述方法的工作原理在于：基因组数据库是集合所有已知核酸的核苷酸序列，单核苷酸多态性、结构、性质以及相关描述，包括它们的科学命名、来源物种分类名称、参考文献等信息的资料库。
上述方法的有益效果在于：通过将核酸序列信息与微生物基因组数据库进行对比分析，可以确定微生物样品中的微生物种类及含量。
在一个实施例中，在所述步骤2中，提取所述微生物样品中的核酸，还包括如下步骤：
步骤A201、根据所述微生物样品，确定所述微生物样品的位置信息，根据所述微生物样品的位置信息，确定所述微生物样品的总核能；
其中，P为所述微生物样品的总核能，N为所述微生物样品中含有的微生物种群数量，First为第一预设值，di,j为所述微生物样品中第i个种群与第j个种群之间的距离，Second为第二预设值，Qi为所述微生物样品中第i个种群的原子电荷数，Qj为所述微生物样品中第j个种群的原子电荷数，i＝1、2、3...N，j＝1、2、3...N；
其中First预设值为1到5之间的值，Second预设值为1到10之间的值，且Second大于First；
步骤A202、确定所述微生物样品的相互作用能；
其中，Energy为所述相互作用能，Fm为预设矫正系数，T为当前温度，
其中，Fm预设值为0.5到1之间的值，Δr预设值为0.2*First；
步骤A203、控制提取所述微生物样品中的核酸时的加工温度；
其中，TJ为所述加工温度；
步骤A204、控制提取所述微生物样品中的核酸时的温度为所述加工温度。
上述技术方案的有益效果为：利用上述技术，可以在提取微生物样品中的核酸的过程中，根据微生物样品的实际情况以及环境信息，控制加工温度，从而使提取微生物样品中的核酸的过程能够保证加工温度与充分提取时所需的温度更加匹配，使得在该温度下能够高效的进行提取，同时又不会因为温度过高对微生物样品中的核酸造成较大的损坏，从而实现对微生物的快速检测。
本发明还提供一种微生物样品的快速检测系统，如图2所示，所述快速检测系统包括：
微生物获取模块201，用于获取微生物样品；
核酸提取模块202，用于提取所述微生物样品中的核酸；
测序文库构建模块203，用于采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；
测序模块204，用于利用二代测序对所构建的文库进行测序，获取核酸序列信息；
检测结果获取模块205，用于根据所述核酸序列信息，获取所述微生物样品的检测结果。
上述系统的工作原理在于：微生物获取模块201获取微生物样品；核酸提取模块202提取微生物样品中的核酸；测序文库构建模块203采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库；测序模块204对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；检测结果获取模块205根据核酸序列信息，获取微生物样品的检测结果。
所述测序模块204采用第二代测序技术对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，借助于第二代测序技术，可以实现高通量测序。
上述方法的有益效果在于：通过核酸提取模块提取微生物样品中的核酸，通过测序文库构建模块采用病原微生物检测试剂盒构建测序文库，通过测序模块对所构建文库进行测序，获取核酸序列信息；检测结果获取模块根据核酸序列信息，获取微生物样品的检测结果；与传统技术相比，上述系统不需要对微生物样品进行培养，只需对微生物样品进行提取处理后，对所提取的微生物样品中的核酸进行测序，获取核酸序列信息，根据核酸序列信息便可获取微生物样品的检测结果，大大缩短了检测所耗费的时间，从而实现了对微生物样品的快速检测。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
