一种基于Illumina用的技术测序平台
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，具体为一种基于Illumina用的技术测序平台。
背景技术
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，其中测序仪Hiseq2000和Hiseq2500具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究以及功能基因组学研究，Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。
虽然高通量测序的数据量大，单位数据量的成本低，但其读长与桑格测序相比短，Illumina目前提供的Miseq和Hiseq最长读长分别是2x300bp和2x150bp，短读长使得从头测序的组装变得困难，特别是对于含有大量重复序列的复杂基因组，通过构建具有较大跨度的双末端配对文库和利用illumina平台的双端测序特点可以得到较大跨度片段两端的部分序列，在对于illumina测序进行的时候，需要将很长的DNA进行环化，环化的接口处连接识别序列，然后打断，富集含有识别序列的DNA，再进行双向测序，导致双向测序的插入片段长度变得很长，检测基因信息相对速率较慢。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于Illumina用的技术测序平台，解决了在对于illumina测序进行的时候，需要将很长的DNA进行环化，环化的接口处连接识别序列，然后打断，富集含有识别序列的DNA，再进行双向测序，导致双向测序的插入片段长度变得很长，检测基因信息相对速率较慢的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于Illumina用的技术测序平台，具体包括以下步骤：
S1、构建序列文库：利用转座子对双链DNA进行剪切，同时在双链DNA的两端完成接头的连接，在接头连接成功后，使用热稳定DNA聚合酶(5U/pl)0.25、10×缓冲液5pl、引物1(20mol/L)lul、dNTP混合液(2.5mmol/L)pl引物2(20gmol/L)lul、双链DNA1pg和灭菌蒸馏水补齐至50pg进行反应；
S2、引物的添加：利用热稳定DNA聚合酶对接头处进行修饰，分别在两端添加测序引物结合位点、index1、index2以及P5寡核苷酸序列和P7寡核苷酸序列；
S3、引物的结合：将测序引物结合到靠近P5的测序引物结合位点1上，在系统中加入dNTP和DNA聚合酶，在聚合酶的作用下，与Forward-strand相应位置碱基配对的dNTP结合到新合成的链上；
S4、新链的生成：将模板链切断并洗下，使Reverse-strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，通过DNA聚合酶生成杂交片段的互补片段，然后加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链被Flowcell中的液体洗去，P5’与链的连接被选择性切断，生成新链；
S5、新链的测序：用水将新链上剩余的dNTP和酶冲掉，对Flowcell进行扫描，扫描出来荧光对应碱基的配对碱基即是新链上的碱基，重复循环检测，直至所有新链的碱基序列被检测出。
优选的，所述步骤S1中，反应条件为完全COLD-PCR94摄氏度5分钟，94摄氏度30秒,55摄氏度30秒,72摄氏度3分钟,30循环，94摄氏度30秒,70摄氏度6分钟,T3s,55摄氏度30秒,72摄氏度3分钟,30循环。
优选的，所述步骤S2中，与P5寡核苷酸序列互补的接头为P5'，与P7寡核苷酸序列互补的接头为P7'，另外P5寡核苷酸序列与index2连接，P7寡核苷酸序列与index1连接。
优选的，所述步骤S3中，dNTP和DNA聚合酶上均带有荧光基团标记，并且每个dNTP和DNA聚合酶上的荧光基团标记均不相同，位于3’的末端连有一个叠氮基。
优选的，所述步骤S4中，合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸，解链，重复35个循环。
优选的，所述步骤S4中，留下与Flowcell上P7连接的链，同时游离的3’端被阻断，防止不必要的DNA延伸。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于Illumina用的技术测序平台。与现有技术相比具备以下有益效果：
该基于Illumina用的技术测序平台，通过构建序列文库：利用转座子对双链DNA进行剪切，同时在双链DNA的两端完成接头的连接，在接头连接成功后，使用热稳定DNA聚合酶(5U/pl)0.25、10×缓冲液5pl、引物1(20mol/L)lul、dNTP混合液(2.5mmol/L)pl引物2(20gmol/L)lul、双链DNA1pg和灭菌蒸馏水补齐至50pg进行反应，引物的添加：利用热稳定DNA聚合酶对接头处进行修饰，分别在两端添加测序引物结合位点、index1、index2以及P5寡核苷酸序列和P7寡核苷酸序列，引物的结合：将测序引物结合到靠近P5的测序引物结合位点1上，在系统中加入dNTP和DNA聚合酶，在聚合酶的作用下，与Forward-strand相应位置碱基配对的dNTP结合到新合成的链上，新链的生成：将模板链切断并洗下，使Reverse-strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，通过DNA聚合酶生成杂交片段的互补片段，然后加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链被Flowcell中的液体洗去，P5’与链的连接被选择性切断，生成新链，新链的测序：用水将新链上剩余的dNTP和酶冲掉，对Flowcell进行扫描，扫描出来荧光对应碱基的配对碱基即是新链上的碱基，重复循环检测，直至所有新链的碱基序列被检测出，有效地缩短双向测序时插入片段的长度，同时利用寡核苷酸序列可以有效地检测相应位置杂交探针，实现基因信息的快速检测，使用起来较为方便。
附图说明
图1为本发明技术测序平台结构的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：一种基于Illumina用的技术测序平台，具体包括以下步骤：
S1、构建序列文库：利用转座子对双链DNA进行剪切，同时在双链DNA的两端完成接头的连接，在接头连接成功后，使用热稳定DNA聚合酶(5U/pl)0.25、10×缓冲液5pl、引物1(20mol/L)lul、dNTP混合液(2.5mmol/L)pl引物2(20gmol/L)lul、双链DNA1pg和灭菌蒸馏水补齐至50pg进行反应；
S2、引物的添加：利用热稳定DNA聚合酶对接头处进行修饰，分别在两端添加测序引物结合位点、index1、index2以及P5寡核苷酸序列和P7寡核苷酸序列；
S3、引物的结合：将测序引物结合到靠近P5的测序引物结合位点1上，在系统中加入dNTP和DNA聚合酶，在聚合酶的作用下，与Forward-strand相应位置碱基配对的dNTP结合到新合成的链上；
S4、新链的生成：将模板链切断并洗下，使Reverse-strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，通过DNA聚合酶生成杂交片段的互补片段，然后加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链被Flowcell中的液体洗去，P5’与链的连接被选择性切断，生成新链；
S5、新链的测序：用水将新链上剩余的dNTP和酶冲掉，对Flowcell进行扫描，扫描出来荧光对应碱基的配对碱基即是新链上的碱基，重复循环检测，直至所有新链的碱基序列被检测出。
本发明中，步骤S1中，反应条件为完全COLD-PCR94摄氏度5分钟，94摄氏度30秒,55摄氏度30秒,72摄氏度3分钟,30循环，94摄氏度30秒,70摄氏度6分钟,T3s,55摄氏度30秒,72摄氏度3分钟,30循环。
本发明中，步骤S2中，与P5寡核苷酸序列互补的接头为P5'，与P7寡核苷酸序列互补的接头为P7'，另外P5寡核苷酸序列与index2连接，P7寡核苷酸序列与index1连接。
本发明中，步骤S3中，dNTP和DNA聚合酶上均带有荧光基团标记，并且每个dNTP和DNA聚合酶上的荧光基团标记均不相同，位于3’的末端连有一个叠氮基。
本发明中，步骤S4中，合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸，解链，重复35个循环。
本发明中，步骤S4中，留下与Flowcell上P7连接的链，同时游离的3’端被阻断，防止不必要的DNA延伸。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
