一种评估无参物种酵母双杂交文库质量的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种评估无参物种酵母双杂交文库质量的方法。
背景技术
酵母双杂交技术作为目前研究蛋白质相互作用的主要方法和手段,在寻找蛋白质相互作用区域时具有显著优势，目前已经得到了很大发展和越来越广泛的应用。
酵母双杂交系统作为研究蛋白间相互作用的最常用技术手段，最早是由Fields和Song在研究真核基因转录调控中建立的，其原理是：诱饵蛋白(bait)与BD(DNA BindingDomain，DNA结合结构域)，猎物蛋白(pery)与AD(DNAActivation Domain，转录激活结构域)分别形成融合蛋白，然后通过杂交使两种融合蛋白进入同一酵母细胞，如果诱饵蛋白和猎物蛋白之间存在互作，就能使BD和AD在空间上相互靠近，使转录因子同时具有识别报告基因上的特异序列以及作用于转录复合体的其他成分的功能，从而形成有活性的转录因子，激活下游报告基因的表达。
酵母双杂交技术因具有高效、灵敏等优点，故被广泛应用于蛋白组学的研究，但其也有假阳/阴性高、操作复杂等缺点。其中，文库质量对酵母双杂交结果影响尤为显著。
传统的酵母双杂交文库质量评估一般分为如下几步：
1、取转化后细菌原液10μL，1:1000稀释，取50μL涂布LB平板(含相应抗性)，37℃培养过夜第二天计数，用于库容量鉴定。
CFU/mL＝平板上的克隆数/50μL×1000倍×1×103μL
文库总CFU＝CFU/mL×文库菌液总体积(mL)
2、从上述LB板上随机挑取数十个克隆进行PCR扩增、电泳检测，用于重组率和插入片段长度的鉴定。
运用上述传统的酵母双杂交文库质量评估方法存在随机性，片面性；而且对于文库中存在多少插入基因数量、基因丰度等关键性指标均无法评估，以此不能有效地评估文库的质量。
综上所述，酵母双杂交技术对应无参考基因组的植物蛋白功能的研究十分重要，现有的文库评估方法并不适合无参物种的酵母双杂交文库评估，因此亟待探索一种能够体现插入基因数量、基因丰度等关键性指标的酵母双杂交文库质量评估方法。
发明内容
本发明的内容是提供一种新的评估由无参考基因组的植物构建的酵母双杂交文库质量的方法，本方法不但能够准确全面评估由无参考基因组的植物构建的酵母双杂交文库的质量，还能获得无参考基因组的植物基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。
本发明技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种评估无参考基因组物种酵母双杂交文库质量的方法，该方法包括下列步骤：
(1)文库扩增：将无参考基因组物种酵母双杂交文库稀释成1ng/μL的文库模版，按如下PCR体系和程序进行文库扩增；
PCR体系：
PCR程序：
所述AD引物对序列如下：
上游引物AD-F：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′(SEQ ID NO.1)，
下游引物AD-R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′(SEQ ID NO.2)；
(2)回收步骤(1)扩增得到的无参考基因组物种酵母双杂交文库PCR产物：
在某一特殊的实施例中，步骤(2)所述回收PCR产物的具体操作为：参照MiniBESTDNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法进行PCR产物回收：向PCR反应液中加入3倍量的Buffer DC，混合均匀加入离心吸附柱中，过柱1200rpm离心1分钟弃滤液，在吸附柱中加入700μL Buffer WB 1200rpm离心30秒弃滤液，重复清洗一次，1200rpm空离1分钟后换一个新的1.5mL离心管，加入30μL 60℃预热的ElutionBuffer于吸附柱中1200rpm离心1分钟洗脱DNA，之后测量回收产物浓度并储存与-20℃冰箱。
(3)电泳：取步骤(2)回收得到的无参考基因组物种酵母双杂交文库PCR产物5μL加入1μL核酸染料和1μL上样缓冲液(Loading Buffer)混合均匀后跑电泳观察条带；以确认PCR已扩增插入基因片段，并初步判断插入基因片段的平均长度。
(4)高通量测序：构建步骤(2)所得到PCR回收产物的测序文库，采用第二代测序仪进行高通量测序，测序模式为PE150，测序量不少于6G，得到原始reads；
(5)获取无参考基因组物种的基因集序列和/或无参考基因组物种酵母双杂交文库中插入基因数量和/或文库基因丰度数据：
对步骤(4)测序所得的原始reads进行从头组装，获得无参考基因组物种的基因集，所述从头组装采用Trinity-v2.4.0软件包，组装参数为--min_glue 2--min_kmer_cov4；
由上述获得的无参考基因组物种的基因集序列，得到无参考基因组物种酵母双杂交文库中插入基因数量；
以上述获得的无参考基因组物种的基因集序列作为参考，文库基因丰度采用trinity软件包自带程序align_and_estimate_abundance.pl，参数为--est_methodRSEM--aln_method bowtie2--trinity_mode--prep_reference。
进一步的，步骤(1)所述循环次数为15次。
本发明的第二个目的是提供前述评估无参考基因组物种酵母双杂交文库质量的方法在评价由无参考基因组物种建立的酵母双杂交文库质量中的应用。
进一步的，所述无参考基因组物种为无参考基因组植物、无参考基因组动物、无参考基因组微生物等，在某一个特殊的实施例中，所述无参考基因组植物为菊花。
进一步的，所述评估无参考基因组物种酵母双杂交文库质量包括获得无参考基因组物种的基因集序列和/或评估无参考基因组物种酵母双杂交文库中插入基因数量和/或评估文库基因丰度。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
本发明公开了一种新的评估酵母双杂交文库质量的方法，检测所需文库量小，仅为10ng(1ng/μL，10μL)，可用于评价由无参考基因组物种建立的酵母双杂交文库质量，该方法能够体现文库中插入基因数量、基因丰度等关键性指标，解决了传统的无参考基因组物种建立的酵母双杂交文库质量评估方法的片面性，适合一般的实验室进行准确的文库评估。该方法通过文库12～15轮循环数的PCR扩增、产物回收之后的浓度测定和电泳情况初步判断，之后将回收产物进行高通量测序、de novo组装后详细分析，获得文库的插入基因数量、基因丰度等关键性指标，完成酵母双杂交文库质量的准确评估。同时，还能获得无参考基因组物种基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。
附图说明
图1为实施例3中PCR产物胶图(DL2000 DNAMarker Takara 3427Q),
其中M：Marker；12C：循环12次；15C：循环15次；18C：循环18次。
图2为实施例5中12、15、18轮循环基因表达情况分析图，
其中12C：循环12次；15C：循环15次；18C：循环18次。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.文库扩增
本实施例采用由菊花分枝建立的酵母双杂交文库，所述由菊花分枝建立的酵母双杂交文库实际插入基因数量为58492，丰度分布如图2所示。
将由菊花分枝建立的酵母双杂交文库稀释成1ng/μL的文库模版，按照如下PCR体系和程序进行文库扩增，每一循环数文库模版PCR样品扩增4份。
PCR体系：
PCR程序：
其中AD引物对序列如下：
上游引物AD-F 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′(SEQ ID NO.1)，
下游引物AD-R 5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′(SEQ ID NO.2)；
实施例2.PCR产物回收
参照MiniBEST DNAFragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法对实施例1中3种循环次数分别扩增得到的的酵母双杂交文库进行PCR产物回收：向PCR反应液中加入3倍量的Buffer DC，混合均匀加入离心吸附柱中，过柱1200rpm离心1分钟弃滤液，在吸附柱中加入700μL Buffer WB 1200rpm离心30秒弃滤液，重复清洗一次，1200rpm空离1分钟后换一个新的1.5mL离心管，加入30μL 60℃预热的Elution Buffer于吸附柱中1200rpm离心1分钟洗脱DNA，将相同循环数的PCR回收产物混合成一份，之后测量回收产物浓度并储存与-20℃冰箱。
胶回收Qubit浓度如下：12轮循环3.74 ngμL-1
15轮循环27.40 ngμL-1
18轮循环5.16 ngμL-1。
实施例3.电泳
取实施例2得到的3种循环次数的酵母双杂交文库PCR回收产物各5μL加入1μL核酸染料和1μL上样缓冲液(Loading Buffer)混合均匀后跑电泳观察条带(图1)，结果显示：PCR循环次数为12和15的回收产物条带在2000bp附近，而PCR循环次数为18的回收产物条带在750bp左右。PCR循环次数为15的回收产物条带最亮，循环次数为18的条带最暗。
实施例4.高通量测序
构建实施例2所得到PCR回收产物的测序文库，采用第二代测序仪进行高通量测序，测序模式为PE150，本实施例测序量如下：12轮循环6.19G
15轮循环8.26G
18轮循环7.90G
所述高通量测序的具体操作为：
a、建库：将步骤(2)所得到PCR回收产物打断成300-500bp长度，将3’端用T4连接酶补齐成平末端，在3’端用Taq DNA聚合酶加上一个特异的碱基A，之后利用互补配对原则加上接头(adapter)，最后进行PCR扩增，构建得到步骤(2)所得到PCR回收产物的测序文库；
b、桥式PCR：以测序文库为模板，将上述步骤a中所得测序文库加入到流动池(Flowcell)中，加入dNTP和聚合酶，聚合酶会沿着模版合成一条全新的DNA链，之后加入NaOH溶液破坏DNA双链并洗脱，加入缓冲液，进行互补杂交，接下来加入dNP和聚合酶进行下一轮PCR，如此循环，得到一个具有完全相同序列的簇(cluster)；
c、正式测序：先通过化学反应，将步骤b中所得簇变为可以测序的DNA单链。加入带荧光标记的dNTP和聚合酶，dNTP的3’末端加入了叠氮基团，保证每次只能够在序列上添加1个碱基，合成之后，用水把多余的dNTP和聚合酶冲掉，在显微镜下进行激光扫描，根据发出的荧光颜色判断新合成上的碱基类型。之后再加入新的dNTP和聚合酶，重复这个过程，直至读出所有碱基，得到原始reads；
实施例5.基因集序列及基因丰度数据的获取
实施例4测序所得的原始reads经过组装后，获得无参考基因组物种的基因集，所述从头组装(de novo组装)采用Trinity-v2.4.0软件包，组装参数为--min_glue 2--min_kmer_cov 4；
基因丰度采用trinity软件包自带程序align_and_estimate_abundance.pl，参数为--est_method RSEM--aln_method bowtie2--trinity_mode--prep_reference数据的统计分析。
5.1组装基因数
表1. 12、15、18轮循环PCR产物回收Trinity组装结果
结果显示，在12和15轮循环时，测得基因数量与实施例1采用的酵母双杂交文库实际插入基因数量相近，表明经过PCR扩增，插入片段没有明显的改变，而18轮循环的结果则不能很好的反映文库的真实情况。
5.2表达情况分析基因丰度与均匀度
结果显示，在12和15轮循环时，PCR扩增没有出现显著的偏离率(bias)，而18轮循环时出现了，这与胶图结果一致，以此结合胶回收产物得率，最终确定12至15轮循环时准确评估文库质量，15轮循环为评估菊花文库质量的最佳方案(图2)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种评估无参物种酵母双杂交文库质量的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctattcgatg atgaagatac cccaccaaac cc 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaacttgc ggggtttttc agtatctacg att 33
