细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞膜包封纳米颗粒的技术领域，尤其是指一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法及应用。
背景技术
化学修饰功能性生物蛋白于材料的拓扑结构表面，用于制备抓捕细菌，高效监测的平台。如Xiaodong Chen等(Yong-Qiang Li，Bowen Zhu，Yuangang Li，Wan Ru Leow，Rubayn Goh,Bing Ma，Eileen Fong,Mark Tang，and Xiaodong Chen；A SynergisticCapture Strategy for Enhanced Detection and Elimination ofBacteria.Angewandte Chemie.2014，5947)将溶菌酶或伴刀豆球蛋白A修饰到硅纳米线阵列表面，实现高效的抓捕细菌并杀灭细菌。
上述虽然可以高效的抓捕细菌并杀灭细菌，但是使用的是化学键连的方式将蛋白修饰到材料表面，需要复杂的修饰流程且不能很好的保证所修饰蛋白具有最理想的空间形态；另外，存在材料制备困难，操作复杂费时，应用面有限等缺点。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中制备困难，操作复杂费时，应用面有限的问题，从而提供一种制备及操作简单，应用面有限的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明的一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法，包括如下步骤：对巨噬细胞进行刺激形成受刺激的巨噬细胞，提取受刺激的巨噬细胞膜；同时，对基板进行加工形成带有纳米线的基板，对所述带有纳米线的基板进行处理形成带有正电荷的纳米线基板；将受刺激的巨噬细胞膜与所述带有正电荷的纳米线基板相结合，得到巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列，所述纳米拓扑结构阵列被包覆后，膜表面的功能性蛋白保留原有的生物空间结构、生物活性和生物功能。
在本发明的一个实施例中，提取受刺激的巨噬细胞膜的方法为：将受刺激的巨噬细胞进行反复冻融，将融化好后的液体，放入离心机进行高速离心，收集沉淀并加入新的缓冲溶液，收集后的沉淀即为细胞膜悬液。
在本发明的一个实施例中，将受刺激的巨噬细胞进行融化时，待液体融化开，再次移入液氮，反复操作多次后，将融化好后的液体放入离心机。
在本发明的一个实施例中，对所述带有纳米线的基板进行处理形成带有正电荷的纳米线基板的方法为：在所述带有纳米线的基板上布设硅烷偶联剂。
在本发明的一个实施例中，在所述带有纳米线的基板上布设硅烷偶联剂之前，将所述基板依次浸泡在氢氟酸的水溶液、硝酸银和氢氟酸的溶液、硝酸溶液中，然后将所述基板使用去离子水清洗干净并用氮气吹干。
在本发明的一个实施例中，在所述带有纳米线的基板上布设硅烷偶联剂的方法为：将带有纳米线的基板使用氧等离子体清洗机在高功率下处理设定时间，并在指定时间内，将其浸泡到含有指定浓度的APTES的无水乙醇溶液中。
本发明还提供了一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，根据所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取的巨噬细胞膜修饰的硅纳米拓扑结构阵列，以所述巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列作为基底，用作医用敷料扣覆在含有菌落的培养板上或伤口感染部位。
在本发明还提供了一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，包括：制造微流控芯片，在所述微流控芯片内设置芯片通道；将所述微流控芯片与所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取的巨噬细胞膜修饰的硅纳米拓扑结构阵列相结合；将液体样品注入芯片通道中对细菌进行特异性抓捕和清除。
在本发明的一个实施例中，制造微流控芯片的方法为：配置PDMS预聚液，并将预聚液倾倒在含有微流控芯片图案的载体上，对所述载体进行固化，待成型后，剥离载体得到微流控芯片。
在本发明的一个实施例中，在所述芯片通道的入口和出口处设置微流控导管，液体样品通过微流控导管注入芯片通道中。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法及应用，通过外界刺激改变受刺激细胞的细胞膜上蛋白表达，从而获得具有目标蛋白富集的细胞膜；通过静电作用将细胞膜包覆在具有纳米拓扑结构材料的表面上，被包覆的细胞膜具有细胞膜流动性，在细胞膜上表达的蛋白具有原有的生物空间结构、生物活性和生物功能；受细菌刺激的巨噬细胞膜包覆的纳米拓扑结构阵列在静态条件下，可以高效的对粘附的细菌进行抓捕，因此制备及操作简单；另外，将细胞膜修饰的纳米拓扑结构材料的基底与图案化的微流控通道组装的芯片，可以应用于细菌抓捕。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法流程图；
图2a是本发明细胞膜未修饰纳米线的透射电镜图；
图2b是本发明细胞膜修饰纳米线的透射电镜图；
图3是本发明带有正电荷的纳米线基板的示意图；
图4是本发明结合具有巨噬细胞膜修饰的微流控装置的三维视图；
图5是本发明微流控芯片对混入不同数量的金黄色葡萄球菌的血液的细菌抓捕统计；
图6是本发明微流控芯片对混入不同数量的大肠杆菌的血液的细菌抓捕统计。
说明书附图标记说明：10-巨噬细胞，11-受刺激的巨噬细胞，12-受刺激的巨噬细胞膜，20-基板，21-带有纳米线的基板，22-带有正电荷的纳米线基板，30-巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列，40-微流控装置，41-微流控导管。
具体实施方式
实施例一
如图1所示，本实施例提供一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法，包括如下步骤：步骤S1：对巨噬细胞10进行刺激形成受刺激的巨噬细胞11，提取受刺激的巨噬细胞膜12；同时，对基板20进行加工形成带有纳米线的基板21，如图2a所示，对所述带有纳米线的基板21进行处理形成带有正电荷的纳米线基板22，如图3所示；步骤S2：将受刺激的巨噬细胞膜12与所述带有正电荷的纳米线基板22相结合，如图2b所示，得到巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30。
本实施例所述细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法，所述步骤S1中，对巨噬细胞10进行刺激形成受刺激的巨噬细胞11，提取受刺激的巨噬细胞膜12，从而使所述巨噬细胞膜带有负电荷；同时，对基板20进行加工形成带有纳米线的基板21，如图2a所示，对所述带有纳米线的基板21进行处理形成带有正电荷的纳米线基板22，如图3所示；所述步骤S2中，将受刺激的巨噬细胞膜12与所述带有正电荷的纳米线基板22相结合，如图2b所示，得到巨噬细胞膜修饰的硅纳米拓扑结构阵列30，所述纳米拓扑结构阵列30被包覆后，膜表面的功能性蛋白保留原有的生物空间结构、生物活性和生物功能，由于利用电荷作用将细胞膜包覆在结构化基板表面，包覆上的细胞膜具有细胞膜流动性，同时细胞膜上的生物功能性蛋白具有原有的空间形态；另外，巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30是一种具有很强的细菌抓捕能力的基底，有利于高效清除受细菌污染血液中的细菌。
提取受刺激的巨噬细胞膜12的方法为：将受刺激的巨噬细胞11进行反复冻融，将融化好后的液体，放入离心机进行高速离心，收集沉淀并加入新的缓冲溶液，收集后的沉淀即为细胞膜悬液，从而可以提取受刺激的巨噬细胞膜。
将受刺激的巨噬细胞11进行融化时，待液体融化开，再次移入液氮，所述液氮会将细胞瞬间冻住，再次融化，会将细胞涨破，反复操作多次后，将融化好后的液体即细胞膜放入离心机，通过离心机进行高速离心。
下面详细介绍如何提取受刺激的巨噬细胞膜12：
小鼠来源的巨噬细胞J774A.1培养在100mm培养皿中，待细胞增殖数量达到100万时，加入500万细菌刺激3小时；
细菌刺激细胞完毕后,使用磷酸盐缓冲溶液清洗，清洗后将巨噬细胞10用缓冲溶液冲下来并收集，得到受刺激的巨噬细胞11；
将受刺激的巨噬细胞11移入1毫升Ep管中并封好，将Ep管浸没入液氮中10秒，之后迅速转移到37摄氏度温水中，待液体融化开，再次移入液氮中。此操作反复进行10次，由于液氮会将细胞瞬间冻住，而通过再次融化会将细胞涨破，如此反复这个过程，形成融化好后的液体。
将融化好后的液体放入离心机进行高速离心，离心速度为2万重力加速度，收集沉淀并加入新的缓冲溶液，此操作重复5遍；
收集后的沉淀即细胞膜悬液，放入4度冰箱保存，得到受刺激的巨噬细胞膜12。
对所述带有纳米线的基板21进行处理形成带有正电荷的纳米线基板22的方法为：在所述带有纳米线的基板21上布设硅烷偶联剂，从而可以使带有纳米线的基板21上形成正电荷，有利于根据静电作用吸附受刺激的巨噬细胞膜12。
在所述带有纳米线的基板21上布设硅烷偶联剂之前，将所述基板20依次浸泡在氢氟酸的水溶液、硝酸银和氢氟酸的溶液、硝酸溶液中，然后将所述基板20使用去离子水清洗干净并用氮气吹干。其中在氢氟酸的水溶液中浸泡基板20时，由于通常基板表面会覆有一层二氧化硅，所述二氧化硅会影响基板20的反应，因此通过所述氢氟酸会腐蚀掉这层二氧化硅，使所述基板20本身漏出；在硝酸银和氢氟酸的溶液中浸泡基板20时，在硝酸银的存在条件下，氢氟酸配合硝酸银会腐蚀基板20，使表面产生纳米线；硝酸溶液浸泡基板20时，有利于清理掉残留在所述基板20表面上的剩余化学物质。
在所述带有纳米线的基板21上布设硅烷偶联剂的方法为：将带有纳米线的基板21使用氧等离子体清洗机在高功率下处理设定时间，并在指定时间内，将其浸泡到含有指定浓度的APTES的无水乙醇溶液中。
对基板20进行加工形带有纳米线的基板21的方法为：在基板20表面旋涂一层正性光刻胶；将涂有光刻胶的基板20在覆盖有光刻板的条件下进行紫外照射；照射后的基板20使用显影液快速冲洗得到具有图案的光刻胶图案，形成带有纳米线的基板21。
下面详细说明如何形成带有正电荷的纳米线基板22：
将水虎鱼溶液清洗后的光滑基板20表面旋涂一层正性光刻胶；
将涂有光刻胶的基板20在覆盖有光刻板的条件下进行紫外照射；
照射后的基板使用显影液快速冲洗得到具有图案的光刻胶图案，形成带有纳米线的基板21，从而得到纹路，有利于跟微流控芯片配合；
将这层图案化的光刻胶作为掩板，浸泡在含有5％氢氟酸的水溶液中5分钟，其中所述掩板会遮挡住一些区域，没有被遮挡的区域是裸露出来的基板，裸露的部分就是芯片上的图案，将基板20取出浸泡在含有0.02M硝酸银和4.8M氢氟酸的溶液中40分钟；因此通过硝酸银和氢氟酸腐蚀裸露出的基板，从而可以得到带有纳米线的基板21；
将带有纳米线的基板21转移到50％硝酸溶液中浸泡20分钟，从而有利于清理掉残留在带有纳米线的基板21表面的剩余化学物质；
将带有纳米线的基板21使用去离子水清洗干净并用氮气吹干；具体地，将带有纳米线的基板21泡入丙酮溶液中去除掉光刻胶涂层并用去离子水清洗干净，最后使用氮气吹干，针对纹路上得到纳米线，才会和芯片流动的部分进行接触，有利于修饰细胞膜。
将吹干后的带有纳米线的基板21使用氧等离子体清洗机在高功率下处理3分钟并浸泡到含有10％APTES的无水乙醇溶液中10分钟，从而可以形成带有正电荷的纳米线基板22。
本实施例中，所述基板20可以采用硅片。
实施例二
如图1所示，本实施例提供第一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，根据实施例一中所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30，以所述巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30作为基底，用作医用敷料扣覆在含有菌落的培养板上。
本实施例提供第一种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，根据实施例一中所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30，以所述巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30作为基底，用作医用敷料扣覆在含有菌落的培养板上或伤口感染部位，有利于观察被抓捕下来的细菌。
具体地，将金黄色葡萄球菌或者大肠杆菌涂覆在培养板上并形成菌落；以所述巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30作为基底，用作医用敷料扣覆在含有菌落的培养板上；经过一段时间后，将基底取下，观察被抓捕下来的细菌，有利于后续进行分析和研究。
实施例三
如图1和图3所示，本实施例提供第二种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，包括：制造微流控芯片，在所述微流控芯片内设置芯片通道；将所述微流控芯片与实施例一所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取的巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30相结合，如图4所示；将液体样品注入芯片通道中对细菌进行特异性抓捕和清除。
本实施例提供第二种细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的应用，包括：制造微流控芯片，在所述微流控芯片内设置芯片通道，有利于将液体样品注入芯片通道中；将所述微流控芯片与实施例一所述的细胞膜包覆纳米拓扑结构阵列的制备方法获取的巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30相结合，从而形成了具有纳米拓扑结构阵列的微流控装置40；将液体样品注入芯片通道中对细菌进行特异性抓捕和清除，通过所述微流控装置40可以在芯片通道中流动的情况下对细菌进行特异性抓捕和清除，可以高效清除受细菌污染血液中的细菌，有利于后续的分析和研究。
制造所述微流控芯片的方法为：配置PDMS预聚液，并将预聚液倾倒在含有微流控芯片图案的载体上，对所述载体进行固化，待成型后，剥离载体得到微流控芯片。
具体地，按照质量比10比1将预聚体A和预聚体B混合配制PDMS预聚液，并将预聚液倾倒在含有微流控芯片图案的载体上，将载体移入70°烘箱中固化40分钟，固化后从成型的PDMS中剥离载体，得到微流控芯片。
在所述芯片通道的入口和出口处设置微流控导管41，液体样品通过微流控导管41注入芯片通道中。具体地，在芯片孔道的入口处和出口处打出1毫米圆孔并将微流控导管41插入。
另外，如图4所示，在具体应用过程中，将微流控芯片与巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30结合在一起，并用带有螺丝的夹板固定，形成微孔流装置40。
由于在微孔流装置40中，以巨噬细胞膜修饰的纳米拓扑结构阵列30作为基板还没有修饰修饰细胞膜，因此需要通入细胞膜，在里面进行修饰，然后冲走没有修饰的细胞膜就可以得到用于后续试验的细胞膜。具体地，将细胞膜悬液超声分散，将分散后的悬液注入微流控芯片并保持孔道液体充盈的情况下放入4度冰箱过夜，从而可以修饰巨噬细胞膜，上述通入细胞膜的方式修饰可以保证细胞膜只修饰在芯片对应的区域而不是整个基板。
过夜后，使用缓冲溶液清洗所述微流控芯片孔道，有利于对微流控芯片进行清洗。
将1000,10000，100000个金黄色葡萄球菌或者是大肠杆菌分别混入1毫升含有肝素的小鼠血液中；将细菌污染的血液以0.2毫升每小时的速度注入微流控芯片；收集流出的血液并进行涂板实验得到血液中残存的细菌含量，从而可以验证血液清除效果，如图5和图6所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
