一种非洲猪瘟基因芯片及其应用
技术领域：
本发明属于病毒靶标捕获测序领域，特别涉及非洲猪瘟关键序列的捕获，特别是一套针对于非洲猪瘟病毒关键序列靶标捕获液相探针的设计及其应用。
技术背景：
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒感染的一种急性、烈性猪传染病，主要症状为出血与发热。非洲猪瘟发病过程短，具有极高的死亡率。非洲猪瘟由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起，该病毒是一种双链DNA病毒，是非洲病毒科非洲病毒属的唯一成员，其主要的感染对象为家猪或野猪。非洲猪瘟病毒全基因组长度大约为170-193kb，在不同毒株中检测到150-167个开放阅读框。
随着高通量测序技术的发展与成熟，基于全基因组测序对病毒样本进行全基因组扫描，已然成为研究病毒遗传进化规律的强力手段。由于单一的非洲猪瘟病毒DNA的获取较为困难，现阶段通用的测序策略是提取宿主跟病毒的总DNA，通过足够量的DNA进行二代测序建库，从最后的大量数据中将极少量(约0.75％)的病毒短读序列提取出来，进行组装拼接以获取病毒全基因组序列。
基于液相探针的二代测序具有极高的特异性，可针对组织样品核酸中病毒全基因组进行捕获测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，更精确地发现非洲猪瘟病毒的遗传变异信息。
因此，开发一款价格低廉的、准确性高的方法快速获得准确的病毒基因组的变异，对于研究非洲猪瘟病毒的全球进化网络具有深远的意义。
发明内容：
本发明人经过对现有猪瘟病毒的全基因组数据进行分析，提供了一组基因探针，通过包括这些基因探针的基因芯片，实现对非洲猪瘟病毒基因序列的捕获测序。
因此，在第一方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的序列组合，所述序列组合包括DNA探针组，所述DNA探针包括SEQ%20ID%20NO.7、SEQ%20ID%20NO.14、SEQ%20ID%20NO.24、SEQ%20IDNO.31、SEQ%20ID%20NO.40、SEQ%20ID%20NO.73、SEQ%20ID%20NO.74、SEQ%20ID%20NO.77、SEQ%20ID%20NO.78、SEQ%20IDNO.84、SEQ%20ID%20NO.96、SEQ%20ID%20NO.130、SEQ%20ID%20NO.134、SEQ%20ID%20NO.142、SEQ%20ID%20NO.153。
在一个实施方案中，所述的DNA探针组包括155条DNA探针，所述的DNA探针序列如SEQ%20ID%20NO.1～SEQ%20ID%20NO.155所示。
在一个实施方案中，所述DNA探针还包括接头序列。
在一个实施方案中，所述的DNA探针为生物素标记的DNA探针。
在第二方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括DNA探针组，所述DNA探针包括SEQ%20ID%20NO.7、SEQ%20ID%20NO.14、SEQ%20ID%20NO.24、SEQ%20ID%20NO.31、SEQ%20IDNO.40、SEQ%20ID%20NO.73、SEQ%20ID%20NO.74、SEQ%20ID%20NO.77、SEQ%20ID%20NO.78、SEQ%20ID%20NO.84、SEQ%20IDNO.96、SEQ%20ID%20NO.130、SEQ%20ID%20NO.134、SEQ%20ID%20NO.142、SEQ%20ID%20NO.153。
在一个实施方案中，所述的DNA探针组包括155条DNA探针，所述的DNA探针序列如SEQ%20ID%20NO.1～SEQ%20ID%20NO.155所示。
在一个实施方案中，所述的DNA探针为生物素标记的DNA探针。
在第三方面，本发明提供了一种利用基因芯片筛查非洲猪瘟病毒基因突变的方法，所述方法包括：
1)提取待检测样本的基因组DNA；
2)将所述DNA打断至200-300bp的范围；
3)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
4)将DNA小片段文库和本发明第一方面的序列组合和第二方面的基因芯片进行杂交，检测基因突变。
在第四方面中，本发明还提供了本发明第一方面的序列组合和第二方面的基因芯片用于检测非洲猪瘟的用途。
本发明的方法和基因芯片至少有如下优点：
本发明的方法和芯片相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；本发明的方法和芯片可以一次性检测疾病相关致病基因的大多数突变，平衡了性价比，对非洲猪瘟的快速诊断和防控有重大意义。本发明的芯片通过液相探针技术进行非洲猪瘟病毒基因捕获测序方便、快速、准确。本发明基于液相探针的二代测序具有极高的特异性，可针对组织样品核酸中病毒全基因组进行捕获测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，更精确地发现非洲猪瘟病毒的遗传变异信息。
具体实施方式：
通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例，可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
在ASFV基因组中对干扰素产生调节作用的是多基因家族基因(MGF)，低毒的ASFV缺乏MGF360或MGF505家族中这些基因的不同拷贝数。这些基因在ASFV基因组中的缺失导致了I型干扰素产量的增加，说明了它们在其水平调节中的重要作用。在MGF505-2R基因中发现了微小但显著的遗传多样性，表明ASFV分子进化缓慢，该基因在调节干扰素I的产生和血吸附现象中起重要作用。另外I329L编码的蛋白作为toll样受体3信号通路的抑制剂，参与了I型干扰素诱导和应答的抑制。在ASFV感染的野猪肺(WSL)细胞中，K145R基因的产物被证明是最显著的病毒蛋白。最近对感染猪的转录组分析表明，K145R在RNA水平上表达丰富。通过对病毒cDNA表达库的筛选，pK145R也被鉴定为恢复期猪的抗体诱导蛋白。
ASFV衣壳由17280个蛋白构成，其中包括1个major蛋白(p72)和4个minor蛋白(pM1249L、p17、p49和pH240R)。而100纳米长的pM1249L蛋白作为核心组织者与其他衣壳蛋白形成分子间网络，形成衣壳骨架。KP177R(P22)是早期诱导结构蛋白，该蛋白在病毒感染后的早期，可通过免疫标记在细胞膜上被检测到。CP204L编码磷蛋白质，与宿主细胞产生相互作用，结合核糖核蛋白-K，参与病毒入侵。NP419L编码DNA连接酶，是构成ASFV最低限度DNA基底切除修复途径(BER)机制的组成部分，该酶在短时间内对受损DNA起作用。D1133L是ASFV编码的6个解旋酶超家族成员之一，有报道推测其在转录中起作用。QP383R编码参与氧化还原代谢的酶，是细菌NifS蛋白同源物。
因此，对于ASFV基因组中重要基因突变的检测尤为重要。本发明解决了如何利用最简的探针序列实现更有效地检测的问题。
在本发明中，非洲猪瘟病毒的参考基因组是MK333180。
本基因芯片包括针对如下基因的探针：MGF_360-1L、KP177R、MGF_110-1L、MGF_505-2R、MGF_505-9R、K145R、M1249L、C84L、CP204L、NP419L、D1133L、QP383R、I267L、I329L&I73R、MGF_360-16R。
上述基因探针序列如下：
ASF最初于1921年在肯尼亚报道。于2007年传入格鲁吉亚共和国，后传播到其他东欧国家，包括俄罗斯(2007年)，乌克兰(2012年)，白俄罗斯(2013年)，立陶宛(2014年)，爱沙尼亚(2014年)，波兰(2014年)，拉脱维亚(2014年)，罗马尼亚(2017年)，捷克共和国(2017年)，匈牙利(2018年)，比利时(2018年)和中国(2018年)。
自2018年9月ASF传入比利时以来，东欧国家的非洲猪瘟病毒全基因组序列与中国境内所获得的全基因组序列几乎完全相同。对已经报道的ASFV关键基因序列与与本发明的参考基因组序列比对得到突变位点。
2007年，在格鲁吉亚国家报告了一例ASF病例，病毒全基因组为GA/2007(GenBank:FR682468.1)，从那时起，ASFV在俄罗斯流行起来，并蔓延到其他欧洲国家。
2013年至2018年，在俄罗斯ASF暴发。多个地区开展采样研究，分离株Odintsovo02/14(GenBank：KP843857)的生物学特性与其它菌株有显著差异，在71.4％的动物体内检测到病毒抗体，死亡率为87.5％。Odintsovo 02/14分离株来自一头野猪，采样于莫斯科地区Odintsovo区Tarakanovsky森林地区。
2018年8月3日，辽宁省沈阳市郊区某养猪场发现首例猪瘟病例。在沈阳第一次ASF爆发的猪中检测到了ASFV的病毒基因组,Miao等人上传了ASFV-SY18的全基因组序列(GenBank:MH766894.1)，该ASFV是中国第一次ASF爆发的原因。还有报道称该序列与2017年在波兰分离的ASFV全基因组序列具有最高的相似度，该波兰病毒称为PoL/2017(GenBank:MG939588.1)。
对已经报道的ASFV关键基因序列与本发明的参考基因组序列比对得到突变位点。
本申请所选基因在参考基因组上的突变位点如下：
在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。“g.”表示基因组序列。以符号“>”进行表示突变，如：g.123A>T，表示与参考序列相比，第123位的A被T所取代；以“del”进行表示缺失；如：g.2052delA，表示与参考序列相比，第2052位发生A的缺失；以“ins”进行表示插入；如：g.5756_5757insAGG，表示与参考序列相比，在第5756与5757位点之间插入了三个碱基AGG。
对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及一条探针序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及MK333180.1:876-976，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
在本实施例中，针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。对于所述探针序列的长度，大于120bp会带来合成上的困难，小于110bp一是其捕获能力降低，二是会增加探针数量，从而增加成本，二者平衡非常重要，发明人经过不断试验，得到了120bp的较优值。对于所述探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，这是因为会对每一个区域都形成2层或者3层的探针覆盖，因此探针覆盖均匀，进而不影响捕获的均一性，而探针覆盖不均匀会影响到捕获的均一性。因此，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2的情况下，优选探针长度是偶数；在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况下，优选探针长度是3的整倍数。但是，在探针长度不是偶数或3的整倍数的情况下，所述重叠取所述探针长度1/2或2/3的近似整数也是可以的，虽然其效果不如探针长度是偶数或3的整倍数的情况。通过商业基因芯片公司制备基因芯片，每个探针序列进行三次重复。
实施例：
1、实验方法
以Affymetrix HG U133A芯片平台各检测非洲猪瘟样本对本发明的基因芯片(包括序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.155所示的探针和常规对照序列)进行测试。基因芯片设计和测试由艾吉泰康(北京)生物技术有限公司进行。
第一步：基因组的提取
按照制造商提供的说明书，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN,Germany)提取非洲猪瘟样本颈静脉、下腔静脉、耳静脉或心脏的全血基因组。
第二步：基因组的质检定量
使用Qubit对样本基因组进行浓度测定，仅测定双链DNA，根据浓度和体积计算双链DNA的量。用分光光度计分析DNA纯度，A260/A280应接近1.8为较纯的DNA(即比值在1.7-1.9)。-20℃储存样品。
第三步：DNA随机打断
使用Covaris随机打断样本基因组至150-200bp。
第四步：基因组文库构建
打断的基因组DNA进行末端修复，3’端加“A”，然后连接接头，最后用PCR扩增的方法进行样本标记和富集DNA。所述接头序列包括SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.157：
SEQ ID NO.156:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNT
SEQ ID NO.157:NNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC。
第五步：生物素标记
使用Random Primer DNA Labeling Kit B型(生物素标记)对DNA进行标记。
1、在1.5mL RNase-free离心管中按下表加入下列试剂：
2、沸水浴5-10分钟，或在PCR仪上100℃加热5-10分钟后，立即放冰上待用。
3、高速离心速秒使所有液体集中在管底，加入下列试剂：
注：不需加dNTP，已经包括在2×随机引物标记反应液(B型)中了。
4、轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心速秒使所有液体集中在管底。
5、37℃保温1-20小时。标记效率跟模板的量和保温时间有关，具体见下表：
6、加1μL自备的0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。
第六步：杂交
20×真核生物杂交控制试剂在使用前65℃加热5分钟。将标记过后的DNA100℃加热5分钟。在新的1.5mL RNase-free离心管中按下表加入试剂：
通过加样孔加入适量体积1×杂交缓冲液湿润芯片；在45℃下60rpm预杂交芯片10分钟；处理过的样品45℃加热，5分钟，最大速离心5分钟；从芯片中取出缓冲液，加等体积处理好的杂交液45℃，60rpm杂交芯片16小时。
第七步：洗脱和染色
杂交16小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的1.5mL离心管，放置冰上或-80℃长时间保存。将洗脱缓冲液A充满芯片。配制下列溶液：
SAPE液(使用前配制，4℃储存)：
抗体溶液：
洗脱工作站按下表工作：
第八步：结果判读
采用GeneChip Scanner 3000 7G扫描芯片，并进行芯片的图像分析处理。
2、实验结果：
为了验证本发明的基因芯片的效果，发明人选取了收集的180个样本对非洲猪瘟病毒的突变进行了检测。对于每个样本突变已知，对于检测不一致的结果，我们通过全基因组进行测序，重新确定突变位点。
样品选择：
每个样本重复三次，对于所有360次样本检测，利用DNA探针SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.155，对基因突变的检出率：检测效率100％。为了简化本发明的基因芯片，综合考虑探针成本和检出率的性价比对所述基因芯片包括的探针进行优化，利用DNA探针SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.73、SEQ IDNO.74、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.130、SEQID NO.134、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.153，突变位点的检出率是96.8％。并不拘囿于相关理论，发明人认为，加上其他探针序列进行校正，可以更好地排除宿主基因组序列的干扰，达到更加好的检出率。
对于本领域技术人员而言，本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他具体的形式实现本发明。结合这里展示的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。
本发明操作简便易行，大大节省了检测时间，达到了快速检测的目的，降低了检测成本，可用于控制非洲猪瘟病毒的传播、出入境动物及其副产品的检疫和规模化猪场非洲猪瘟病毒的排查工作。1、成功地构建了一种非洲猪瘟检测基因芯片：本发明所制备的非洲猪瘟病毒探针可与对应病毒的目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。2、制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。3、检测基因芯片的构建，为非洲猪瘟的鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物的检疫和相应疫病的控制提供了技术保障。对满足出入境动物的检疫工作的需要，控制非洲猪瘟病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
