Trc启动子突变文库及其应用
技术领域
本发明涉及Trc启动子突变文库及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
启动子是基因表达的重要调控元件，决定了基因表达的强度和时机。随着合成生物学和代谢工程的发展，人们在调控细胞代谢过程中，对启动子调控的范围和强度上有着越来越高的要求。具有更广调控范围的启动子可为代谢途径中不同基因的表达提供更加精细的调控，而更高强度的启动子为实现目标蛋白的高效表达提供了充足的动力。从功能上启动子可以分为诱导型和组成型两类，诱导型启动子在相应调控蛋白和诱导剂的作用下对目标基因的转录水平进行着调控，其最大优势在于高表达强度和精准调控。然而，由于诱导型启动子的表达强度与诱导剂密切相关，使得在多基因代谢途径的精准调控中需要添加多种不同诱导剂，从而调控不同基因的表达水平，这限制了其在代谢调控中的使用。此外，多数诱导型启动子存在渗漏表达情况，诱导剂的添加也极大的增加了发酵成本。组成型启动子具有在不同生长条件下稳定的表达水平的优势，然而自然界现有的组成型启动子普遍强度较弱，无法满足实际生产需求。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可调控目的蛋白表达量的启动子文库，所述启动子文库包含SEQ ID NO.1～41所示的启动子；其中，启动子按照SEQ ID NO.1～41的顺序表达强度依次递增。
在一种实施方式中，所述启动子文库由SEQ ID NO.7～41所示的启动子组成。
本发明的第二个目的是提供一种启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～41任一所示。
本发明的第三个目的是提供携带所述启动子的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体为质粒。
在一种实施方式中，所述质粒连接有所述启动子；所述启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。
在一种实施方式中，所述的表达载体还可以包括(从5`到3`方向)：引导目的基因转录的启动子和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3`转录终止子，3`多聚核苷酸化信号，其他非翻译核苷酸序列，转运和靶向核苷酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pTrc99a。
本发明的第四个目的是提供一种利用所述启动子文库调控目的蛋白表达量的方法；所述方法是利用SEQ ID NO.7～41任一所示的启动子表达编码所述目的蛋白的基因，或将编码所述目的蛋白的基因连接至含有所述启动子的表达载体上，并转化至宿主细胞中表达。
在一种实施方式中，所述方法是将编码所述目的蛋白的目的基因连接至所述启动子下游的多克隆位点上，从而将目的基因与启动子连接。
在一种实施方式中，所述目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。
在一种实施方式中，所述的目的基因为编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。
在一种实施方式中，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白或半乳糖苷酶。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)扩增包含目的基因、Nco I酶切位点以及Hind III酶切位点的片段；
(2)将步骤(1)获得的片段连接到质粒pTrc99a上，得到重组质粒pTrc-lacZ；
(3)在步骤(2)获得的质粒pTrc-lacZ上通过易错PCR得到的突变型启动子替换野生型Trc启动子，得到重组质粒mpTrc-lacZ；
(4)将步骤(3)获得的重组质粒转化至宿主细胞中，筛选阳性转化子；
(5)将步骤(4)筛选获得的表达正确蛋白的重组细胞在适宜的培养基中培养。
在一种实施方式中，用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能够吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用TB离子和二甲基亚砜处理(超级感受态制备方法)或用10％的甘油处理(电转感受态)。
在一种实施方式中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：酵母、大肠杆菌、动物组织细胞、植物组织细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
有益效果：本发明通过大量筛选获得了一系列启动子，他们调控目的基因表强度的范围较广，从而建立了Trc启动子突变文库；本发明通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和改造中，突破了原来只能通过基因敲除和过量表达两种非“开”即“关”的手段来实现对细胞基因型的扰动，即可通过对目标基因表达进行梯度式的精确微调来分析和控制其对表型和代谢流分布的影响。
附图说明
图1为重组质粒构建示意图；(A)为重组质粒pTrc-sfGFP的构建示意图，(B)为重组质粒pTrc-lacZ的构建示意图。
图2为Trc启动子突变文库中41个启动子的荧光酶标仪GFP荧光强度。
图3为Trc启动子突变文库中41个启动子表达β-半乳糖苷酶的酶活。
图4为mpTrc1-mpTrc41测序结果比对(阴影部分表示突变的位点)。
具体实施方式
术语：
如本文所用，所述的“启动子”是指一种核苷酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5`端)，能够引导核苷酸序列转录为mRNA。一般地，启动子提供RNA聚合酶和正确其实转录所必须的其他因子的识别位点。
如本文所用，所述的“启动子文库”是指本发明筛选得到的一系列突变型Trc启动子的核苷酸集合体。
如本文所用，所述的“Trc启动子”简称为pTrc。
如本文所用，所述的“pTrc-sfgfp”是指含有表达绿色荧光蛋白的基因sfGFP和Trc启动子的重组质粒。
如本文所用，所述的“pTrc-lacZ”是指含有表达β-半乳糖苷酶的基因lacZ和Trc启动子的重组质粒。
如本文所用，所述的“mpTrc-sfgfp”是指含有表达绿色荧光蛋白的基因sfGFP和mpTrc1-mpTrc41启动子的重组质粒。
如本文所用，所述的“mpTrc-lacZ”是指含有表达β-半乳糖苷酶的基因lacZ和mpTrc1-mpTrc41启动子的重组质粒。
如本文所用，所述的“ECTrc-sfgfp”是指转化了上述质粒pTrc-sfgfp的大肠杆菌菌落。
如本文所用，所述的“ECTrc-lacZ”是指转化了上述质粒pTrc-lacZ的大肠杆菌菌落。
如本文所用，所述的“ECmTrc-sfgfp”是指转化了上述质粒mpTrc-sfgfp的大肠杆菌菌落。
如本文所用，所述的“ECmpTrc-lacZ”是指转化了上述质粒mpTrc-lacZ的大肠杆菌菌落。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。本发明对合适的目的基因没有特别的限制，例如包括但不限于：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、酶、报告基因(如绿色荧光蛋白sfGFP、半乳糖苷酶基因lacZ)。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核苷酸或蛋白质序列之间的关系例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
荧光强度和OD600值的检测：
利用多功能酶标仪Cytation 3imaging Reader system(BioTek，美国伯腾仪器有限公司)，测定荧光强度和OD600值，以野生型E.coli MG1655做对照菌株，绿色荧光检测时的激发波长为485nm和发射波长为528nm。最终所测得荧光强度与细胞OD600的比值定义为启动子的表达强度。
β-半乳糖苷酶的酶活测定
取3mL含有β-半乳糖苷酶的菌株培养液离心弃上清，在冰上进行下列操作：加入裂解液Tris-HCl 25μL，PMSF 12.5μL，振荡破壁。破壁结束后再加入25μL Tris-HCl，离心收集上清即酶液。取30μL酶液加入150μL考马斯亮蓝，测其OD595吸光度。取20μL酶液，加入90μL ZBuffer，30℃保育5min，加入10μL ONPG，溶液出现淡黄色立即加入50μL Na2CO3溶液终止反应，测其OD420吸光度。
培养基：
LB培养基：10g/mL蛋白胨，5g/mL酵母粉，10g/mL NaCl，灭菌后补加1.0μg/mL的氨苄青霉素和1.0μg/mL的链霉素；
M9培养基：6.78g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl，10g/L葡萄糖(单独灭菌)，0.24g/L MgSO4(单独灭菌)，0.115g/L CaCl2(单独灭菌)。灭菌后补加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和50μg/mL的链霉素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：Trc启动子的易错突变
Trc启动子是一种组成型启动子，是由Trp和Lac的拼接杂合启动子，有着比Trp更高的转录效率和受LacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
选用Trc启动子(SEQ ID NO.42)为模板，通过浓度梯度调整PCR反应体系中镁离子浓度(1mM、2mM、0.5mM)、锰离子浓度(3.0mM)、加入非保真Taq DNA聚合酶增加扩增的突变率，得到不同强度的启动子。
利用绿色荧光蛋白(sfGFP)作为报告基因以描述调控其表达的Trc启动子强度。为了构建报告基因表达载体，便于突变启动子插入，首先利用原始未突变的Trc启动子和启动子库中的其他启动子调控报告基因sfGFP的表达，构建GFP报告基因表达载体pTrc和相应的重组菌ECmTrc-sfgfp。
实施例2重组质粒pTrc-sfgfp和mpTrc-sfgfp的构建
如图1(A)所示，以pUC57-sfgfp为模板(构建方法公开于论文《Next Generationof Tn7-Based Single-Copy Insertion Elements for Use in Multi-and Pan-Drug-Resistant Strains of Acinetobacter baumannii》中)，用引物pTrc1 F(SEQ ID NO.43)和pTrc1 R(SEQ ID NO.44))扩增得到sfGFP的PCR产物。将质粒pTrc99a和上述PCR产物同时用EcoR I和Hind III双酶切，并利用胶回收试剂盒回收，将目的基因和pTrc99a经T4 DNA连接酶16℃过夜连接目的sfGFP和pTrc99a，得到重组质粒pTrc-sfgfp。将上述连接反应液中加入100μL大肠杆菌JM109化转感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL LB液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50mg/L)。37℃培养过夜，挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证所用的引物为veri-pTrc1 F：AGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTA(SEQ ID NO.45)，veri-pTrc1 R：GAGACCCCACACTACCATCGGCG(SEQ ID NO.46)。并将阳性菌落转接LB液体培养基，培养12-16小时，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用EcoR I和Hind III酶切验证，最后通过上海生工测序验证。所构建的pTrc-sfgfp作为对照，考察sfGFP的表达。在所构建的重组质粒pTrc-sfgfp的基础上，用实施例1获得的突变型启动子分别替换质粒上原有的野生型启动子pTrc，分别得到含有突变型启动子的重组质粒mpTrcX-sfgfp(X表示突变启动子的序号)。
实施例3基因工程菌ECTrc-sfgfp和ECmpTrc-sfgfp的构建
将大肠杆菌JM109感受态细胞置于冰上解冻；分别加入5μL实施例2构建的重组质粒pTrc-sfgfp和mpTrc-sfgfp，混合均匀后冰浴30min；将上述混合物42℃热激90s，然后加入1mL LB培养基，并将其只与37℃250rpm条件下孵育1h，在5000rpm离心3min后倒上清液，将菌液涂布于相应抗生素平板；倒置培养12-16小时，直到单克隆出现。挑去转化子采用菌落PCR进行验证，获得阳性重组菌株。最后通过上海生工测序验证。
实施例4启动子突变文库的构建
将测序验证的阳性转化子接种到LB液体培养基中，用96孔板37℃培养过夜得到种子液。取30μL种子液接入150mL M9液体培养基中，培养至OD在0.4-0.6时，取100μL于黑色96孔荧光板中，利用多功能酶标仪Cytation 3imaging Reader system(BioTek，美国伯腾仪器有限公司)，测定荧光强度和OD600值，以野生型E.coli MG1655做对照菌株，在绿色荧光检测条件为激发485nm和发射528nm。通过上述方法得到了3665个突变型启动子，其中有26个荧光强度小于100U/mg的突变型启动子，由于表达强度过低被舍弃。
因通过易错PCR得到的启动子调控强度与启动子数量呈现出反比关系，将剩下的突变型启动子按荧光强度的大小划分为7个梯度，每个梯度含有的启动子数量接近。即100-300U/mg、300-700U/mg、700-1500U/mg、1500-3100U/mg、3100-6300U/mg、6300-12700U/mg、12700-84741U/mg，每个梯度的跨度依次为200U/mg、400U/mg、800U/mg、1600U/mg、3200U/mg、6400U/mg、72041U/mg，并从每个梯度中随机选取6个启动子，其中由于第4个梯度含有的启动子数量相对于其他梯度较少，因此从第4个梯度选取了5个启动子。由此选取方法得到了41个启动子，分别为mpTrc1～mpTrc41(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～41所示)，其表达绿色荧光蛋白的强度如表1所示。启动子mpTrc1～mpTrc6的表达强度相对于出发启动子pTrc降低，启动子mpTrc7～mpTrc41的荧光蛋白表达强度相对于出发启动子提高。
表1 Trc启动子突变文库中41个启动子表达GFP的荧光强度
通过对Trc启动子突变文库中SEQ ID NO：1～41所示的启动子进行分析(图4)，发现这41个突变型启动子的碱基分布较平均，突变率(MR)为从1.35％到8.11％不等，即错配的碱基数目为1-6不等，因此突变率是适当的。
实验例5启动子突变文库表达半乳糖苷酶
1、重组质粒pTrc-lacZ和mpTrc-lacZ的构建和鉴定
如图1(B)以大肠杆菌MG1655 K12基因为模板进行扩增lacZ基因，引物分别为pTrc2F：GGAAACAGACCATGGATGACCATGATTACG(SEQ ID NO.47)，pTrc2R：CAGCCAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACC(SEQ ID NO.48)。用Nco I和Hind III于37℃双酶切得到的lacZ基因片段和pTrc99a，并利用胶回收试剂盒回收。将目的片段lacZ和pTrc99a用T4DNA连接酶16℃过夜，转化至大肠杆菌，37℃培养过夜，并菌落PCR验证，验证引物为veri--lacZ F：ACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCA(SEQ ID NO.49)，veri--lacZ R：GTCACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAA(SEQ ID NO.50)。并将阳性菌落转接LB液体培养基，培养12-16小时，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用Nco I和Hind III酶切验证，并送上海生工测序。以所构建的pTrc-sfgfp作为对照，展现报告基因sfGFP的表达强度。在所构建的重组质粒pTrc-lacZ的基础上，通过替换其启动子，分别得到含有人工合成启动子mpTrc1-mpTrc41的重组质粒mpTrc1-lacZ～mpTrc41-lacZ。
2、基因工程菌ECTrc-lacZ和ECmpTrc-lacZ的构建和鉴定
将大肠杆菌感受态细胞置于冰上解冻；分别加入5μL重组质粒mpTrc1-lacZ～mpTrc41-lacZ，混合均匀后冰浴30min；将上述混合物42℃热激90s，然后加入1mL LB培养基，并将其只与37℃ 250rpm条件下孵育1h，在5000rpm离心3min后倒上清液，将菌液涂布于相应抗生素平板；倒置培养12-16小时，直到单克隆出现。挑去转化子采用菌落PCR进行验证，获得阳性重组菌株。
将重组菌株在37℃，250rpm下培养14h，收集细胞培养液，测定细胞中的半乳糖苷酶酶活，结果如表2所示。可见，通过本发明筛选的启动子可精确调控目的蛋白的表达量，控制细胞的代谢流量。
表2、Trc启动子突变文库中41个启动子表达β-半乳糖苷酶的酶活具体数值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> Trc启动子突变文库及其应用
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ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tttggcattg cgggcggata acaatttcac 60
acaggaaaaa gacc 74
<210> 35
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcagata acaatttcac 60
acgggaaaca gacc 74
<210> 36
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ttgacaatta atcatccggc tcgtatagtg tgtggagttg tgagcagata caatttcaca 60
caggaaacag acc 73
<210> 37
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaatta tgagcagata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 38
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcagata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 39
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttgacaatta atcatccgga tcgtataatg tgtggaattg cgggcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 40
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgttgaattg tgggcagata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 41
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ttgacaatta atcacccggc tcgtataatg tttggaattg tgagcagata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 42
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cagaccatgg aattcatgcg tataggtgaa gaac 34
<210> 44
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
caaaacagcc aagcttcttt gtacagttcg tcca 34
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aggcagccat cggaagctgt ggta 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gagaccccac actaccatcg gcg 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggaaacagac catggatgac catgattacg 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
cagccaagct tttatttttg acaccagacc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gtcacgttgg tgtagatggg cgcatcgtaa 30
