一种橙色荧光碳点及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料，具体涉及一种橙色荧光碳点及其制备方法，以及该橙色荧光碳点用于荧光/比色双模式Cu2+和pH传感和细胞成像。
背景技术
碳点作为一种新型的碳纳米材料，自2004年被发现以来受到了广泛的关注。目前，合成碳点的方法有很多，可以归纳为化学方法和物理方法两大类。化学方法包括电化学合成法，燃烧/热解/水热/酸氧化法，模板合成法，微波/超声波法，其他化学方法等。物理方法包括电弧放电，激光烧蚀/钝化和等离子处理等。
碳点具有出色的光致发光性能、良好的光稳定性、优异的水溶性和低毒性等优点。这些特性使它们在成像、药物输送、医学诊断、指纹检测和荧光墨水中具有广阔的应用前景。特别是碳点已被广泛用作化学传感器和生物传感器。然而这些传感器中的大多数只能测定一个目标物。为了进一步丰富其检测功能，已经做出了很多努力来构建基于碳点的多功能传感器。目前，大多数合成的多功能碳点在紫外光激发下发射蓝色荧光。在生物相关领域，蓝色荧光碳点作为光学探针并不具有吸引力，这是由于生物的自体荧光一般为蓝色，会对检测造成干扰；另外，紫外光激发会对生物体造成损伤。因此，开发具有长波长发射的多功能碳点基荧光探针具有重要的意义。
比色法也是一种重要的检测方法，可以通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量。荧光/比色双模式分析不仅可以提供高灵敏度的荧光检测方法，还可以用肉眼可视化目标，因此得到了广泛的研究。然而，基于碳点的荧光和比色双模式传感器的研究仍处于早期阶段，具有很大的研究空间。
发明内容
本发明目的在于提供一种橙色荧光碳点及其制备方法，所述制备方法应工艺简单、制备条件要求低，制得的橙色荧光碳点具有优异的光稳定性和生物相容性，可用于荧光/比色双模式Cu2+和pH传感及细胞成像。
为实现上述目的本发明提供的技术方案为：
一种橙色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：
(1)按质量1：1～2：70～170将柠檬酸和5-氨基水杨酸加入去离子水中，制得混合液；
(2)将步骤(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，进行水热反应；
(3)将步骤(2)得到的产物离心除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用透析袋透析除去杂质，得到橙色荧光碳点溶液；
(4)将步骤(3)得到的橙色荧光碳点溶液冷冻干燥后得到目标橙色荧光碳点。
所述步骤(1)中柠檬酸、5-氨基水杨酸与去离子水按质量比为1：1～1.5：80～170。
所述步骤(2)中水热反应的温度为180～220℃，时间为1～5h。
所述步骤(3)中的透析是用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析12～24h。
本发明方法制备的橙色荧光碳点可用于荧光/比色双模式Cu2+和pH检测及细胞成像。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)制得的橙色荧光碳点具有良好的橙色发光性能，将其用于生物标记、细胞成像，可以避免生物自体荧光的干扰。
(2)制得的橙色荧光碳点稳定性强、毒副作用小、水溶性好。
(3)制得的橙色荧光碳点可以用作荧光/比色双模式Cu2+和pH检测及细胞成像。
附图说明
图1为实施例1制备的橙色荧光碳点溶液分别在日光灯和波长为560nm激发下的照片
图2为实施例1制备的橙色荧光碳点的透射电镜图和尺寸分布图
图3为实施例1中制备的橙色荧光碳点的红外光谱图
图4为实施例1中制备的橙色荧光碳点的X射线光电子能谱图
图5为实施例1中制备的橙色荧光碳点的紫外吸收光谱及荧光发射光谱图
图6为实施例1制备的橙荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图
图7为实施例1制备的橙色荧光碳点对Cu2+选择性的图(荧光法)
图8为实施例1制备的橙色荧光碳点对Cu2+选择性的图(比色法)
图9为实施例1制备的橙色荧光碳点溶液随Cu2+浓度变化的荧光发射光谱图
图10为实施例1制备的橙色荧光碳点溶液随Cu2+浓度变化在日光灯下的照片
图11为实施例1制备的橙色荧光碳点溶液随pH变化的荧光发射光谱图
图12为实施例1制备的橙色荧光碳点溶液随pH变化在日光灯下的照片
图13为实施例1制备的橙色荧光碳点标记的HeLa细胞在加Cu2+前后的激光共聚焦图
图14为实施例1制备的橙色荧光碳点标记的HeLa细胞随pH变化的激光共聚焦图
具体实施方式
以下实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
橙色荧光碳点的制备：
(1)将0.24g柠檬酸和0.30g 5-氨基水杨酸加入20mL去离子水中，制得混合液；
(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，在200℃下水热反应3h；
(3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心20min除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析24h，得到橙色荧光碳点溶液；
(4)将(3)得到的橙色荧光碳点溶液冷冻干燥后得到橙色荧光碳点，其荧光量子产率(以罗丹明6G为标准)为14.0％。
制备的橙色荧光碳点溶液分别在日光灯和波长为560nm激发下的照片见图1，其中左图为波长为560nm激发下的图片，颜色为橙色，右图为橙色荧光碳点溶液在日光灯照射下的图片，颜色为棕色。
制备的橙色荧光碳点的透射电镜图和尺寸分布图见图2。
制备的橙色荧光碳点的红外光谱图见图3。
制备的橙色荧光碳点的X射线光电子能谱图见图4。
制备的橙色荧光碳点的紫外吸收光谱及荧光发射光谱图见图5。
制备的橙色荧光碳点在不同激发波长下的荧光发射光谱图见图6，其中1～8分别是波长为500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm和570nm激发下的荧光光谱图。
实施例2
橙色荧光碳点的制备：
(1)将0.24g柠檬酸和0.30g 5-氨基水杨酸加入25mL去离子水中，制得混合液；
(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，在180℃下水热反应3h；
(3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心20min除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析24h，得到橙色荧光碳点溶液；
实施例3
橙色荧光碳点的制备：
(1)将0.24g柠檬酸和0.30g 5-氨基水杨酸加入30mL去离子水中，制得混合液；
(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，在220℃下水热反应3h；
(3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心20min除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析24h，得到橙色荧光碳点溶液。
实施例4
橙色荧光碳点的制备：
(1)将0.24g柠檬酸和0.30g 5-氨基水杨酸加入35mL去离子水中，制得混合液；
(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，在200℃下水热反应2h；
(3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心20min除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析24h，得到橙色荧光碳点溶液。
实施例5
橙色荧光碳点的制备：
(1)将0.24g柠檬酸和0.30g 5-氨基水杨酸加入40mL去离子水中，制得混合液；
(2)将(1)得到的混合液转移到水热反应釜中，在200℃下水热反应4h；
(3)将(2)得到的产物用离心机以4000r/min转速离心20min除去不溶物得到澄清的棕色溶液，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析24h，得到橙色荧光碳点溶液。
实施例6
实施例1制备的橙色荧光碳点对Cu2+的选择性实验：
用pH＝7.2的0.01mol·L-1的Tris-HCl缓冲液和CuCl2、BiCl3、CaCl2、CdCl2、FeCl3、HgCl2、KCl、AlCl3、BaCl2、MgCl2、MnCl2、NaCl、PbCl2、ZnCl2分别配制金属离子浓度为262μmol·L-1的溶液，分别将0.44mg实施例1制备的橙色荧光碳点溶解到1mL上述含不同金属离子的溶液中，固定激发波长为550nm，在20℃下进行荧光光谱检测，根据(F/F0)，进而达到对Cu2+选择性的检测。根据日光下溶液的颜色，进而达到对Cu2+选择性的比色法检测。
橙色荧光碳点对Cu2+选择性(荧光法)的图见图7：橙色荧光碳点对Cu2+有最大的响应。
橙色荧光碳点对Cu2+选择性(比色法)的图见图8：当碳点溶液中加入Cu2+后呈深棕色，加入其它离子后呈浅黄色或浅棕色。橙色荧光碳点对Cu2+有选择性。
实施例7
实施例1制备的橙色荧光碳点作为Cu2+探针的灵敏度实验：
用pH＝7.2的0.01mol·L-1的Tris-HCl缓冲液和CuCl2分别配制Cu2+浓度为0.05μmol·L-1、0.1μmol·L-1、0.25μmol·L-1、0.5μmol·L-1、0.75μmol·L-1、1μmol·L-1、2.5μmol·L-1、5μmol·L-1、7.5μmol·L-1、10μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、75μmol·L-1、100μmol·L-1、125μmol·L-1、150μmol·L-1、175μmol·L-1、200μmol·L-1、225μmol·L-1、250μmol·L-1、275μmol·L-1、300μmol·L-1、325μmol·L-1、350μmol·L-1、375μmol·L-1和400μmol·L-1的水溶液，分别将0.44mg实施例1制备的橙色荧光碳点溶解到1mL上述含不同浓度Cu2+的水溶液中，固定激发波长为550nm，在20℃下进行荧光光谱检测。
橙色荧光碳点溶液随Cu2+浓度变化的荧光发射光谱图见图9，其中1～27分别是Cu2+浓度为0μmol·L-1、0.05μmol·L-1、0.1μmol·L-1、0.25μmol·L-1、0.5μmol·L-1、0.75μmol·L-1、1μmol·L-1、2.5μmol·L-1、5μmol·L-1、7.5μmol·L-1、10μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、75μmol·L-1、100μmol·L-1、125μmol·L-1、150μmol·L-1、175μmol·L-1、200μmol·L-1、225μmol·L-1、250μmol·L-1、275μmol·L-1、300μmol·L-1、325μmol·L-1、350μmol·L-1、375μmol·L-1和400μmol·L-1的溶有橙色荧光碳点的Tris-HCl缓冲溶液的荧光发射光谱图；从图中可以看出随着Cu2+浓度的增加，595nm处荧光峰强度逐渐降低。
橙色荧光碳点溶液随Cu2+浓度变化在日光灯下照片见图10，图10从左到右依次是Cu2+浓度为0μmol·L-1、0.05μmol·L-1、0.1μmol·L-1、0.25μmol·L-1、0.5μmol·L-1、0.75μmol·L-1、1μmol·L-1、2.5μmol·L-1、5μmol·L-1、7.5μmol·L-1、10μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、75μmol·L-1、100μmol·L-1、125μmol·L-1、150μmol·L-1、175μmol·L-1、200μmol·L-1、225μmol·L-1、250μmol·L-1、275μmol·L-1、300μmol·L-1、325μmol·L-1、350μmol·L-1、375μmol·L-1和400μmol·L-1的溶有橙色荧光碳点的Tris-HCl缓冲溶液在日光灯下的照片；从图中可以看出随着Cu2+浓度的增加，溶液颜色由浅黄色逐渐变为深棕色。
实施例8
实施例1制备的橙色荧光碳点检测pH的实验：
分别将0.44mg实施例1制备的橙色荧光碳点溶解到1mL不同pH值的Tris-HCl缓冲液中，固定激发波长为550nm，在20℃下进行荧光光谱检测，根据荧光强度的变化，进而达到对pH值的检测。
橙色荧光碳点随pH变化的荧光发射光谱图见图11，其中：1～17分别为pH值7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2时的荧光发射光谱图。从图中可以看出荧光强度随着pH值的增加而降低。
橙色荧光碳点随pH变化在日光灯下的照片见图12，图12从左到右依次是pH值为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2在日光灯下的照片，从图中可以看出随着pH增加，溶液颜色由浅黄色逐渐变为深蓝色。
实施例9
实施例1制备的橙色荧光碳点对活细胞中Cu2+传感的实验：
将实施例1制备的橙色荧光碳点加入到pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中(碳点的浓度为1.32mg/mL)用于孵育HeLa细胞30min。
橙色荧光碳点标记的HeLa细胞在加Cu2+前后的激光共聚焦图如图13所示，图中：a为碳点标记的HeLa细胞的激光共聚焦图(显示橙色荧光)；b为碳点标记的HeLa细胞加入Cu2+(768μmol·L-1)的激光共聚焦图(橙色荧光淬灭)。
实施例10
实施例1制备的橙色荧光碳点对活细胞中pH传感的实验：
分别将实施例1制备的橙色荧光碳点加入到不同pH值的Tris-HCl缓冲液中(碳点的浓度为1.32mg/mL)用于孵育HeLa细胞30min。
橙色荧光碳点标记的HeLa细胞随pH变化的激光共聚焦图如图14所示。图中：a为pH7.2时碳点标记的HeLa细胞的激光共聚焦图；b为pH 8.2时碳点标记的HeLa细胞的激光共聚焦图；c为pH 9.2时碳点标记的HeLa细胞的激光共聚焦图。从图中可以看出随着pH值的增加，细胞的荧光强度逐渐减弱。
