识别铜绿假单胞菌的DNAzymes及筛选检测方法与用途
技术领域
本发明属致病菌检测和分子生物学技术领域，具体涉及可用于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）特异性检测的DNAzymes及其筛选方法，以及其用于检测铜绿假单胞菌的方法与用途。
背景技术
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是自然界中广泛分布的一种革兰氏阴性杆菌，也是人体皮肤、呼吸道常见的条件致病菌。其致病特点为引起继发性感染，多发生在机体免疫力降低时。铜绿假单胞菌能引发鱼的赤皮病，使鱼体出血发炎，鳍片脱落，严重危害水产养殖。铜绿假单胞菌具有很强的生存能力和耐药性，在饮用水的生产过程中不易被消除，WHO已将铜绿假单胞菌作为瓶装矿泉水污染危害的指示菌。铜绿假单胞菌还是住院患者特别是ICU 患者感染的重要病原菌，能导致人囊性肺纤维化、角膜炎、胃肠道感染和败血病等。
DNAzyme是通过体外筛选获得的具有催化活性的DNA寡核苷酸。DNAzyme具有结构稳定，分子相对较小、催化效率高、易于合成和修饰，不会引起机体免疫反应等优点。DNAzyme一般是从1013~1015个随机DNA文库中筛选得到的具有RNA特异性切割功能的单链DNA序列。这些用于体外筛选的随机文库，两端为固定的引物序列，中间由固定数目的A、T、G、C四种碱基随机排布。1994年第一个DNAzyme被报道用于RNA金属离子切割。在金属离子的作用下，DNAzyme完成催化切割的主要机理是：在底物的脱氧核糖核苷碱基上的2’-OH攻击与之毗邻的磷酸二酯键中的磷原子，使其电位发生转变，从而使底物的DNA链发生断裂，达到切割效果。其筛选流程主要包括：随机文库和引物的设计与合成；初始筛选文库的连接与纯化；正筛选和反筛选；聚合酶链式扩增（PCR）和克隆测序。一般DNAzyme的筛选过程持续4~20个循环（视筛选目标而定），期间不断引入反筛选以提高所得目标序列的特异性。
目前，国内外对铜绿假单胞菌的研究主要体现在其血清型（Serotype）、基因型（Genotype）、毒力因子（Virulence factor）及免疫特性（Immune characteristics）等方面的研究。虽然检测检测铜绿假单胞菌的方法有很多，但大多数方法花费时间长，价格昂贵且不适合现场使用。例如，细胞培养通常需要几天的时间完成，而基于抗体的测定需要多次清洗且价格昂贵。恒温扩增技术需要引物多且设计复杂，产物回收测序也困难。PCR需要DNA提取，多次试剂和热循环，而且可能提取到已经死亡细胞的DNA。目前，DNAzyme的筛选主要集中在金属离子、微生物细胞、蛋白质以及小分子等方面。尽管已有细菌相关的DNAzyme被研究报道，但未见DNAzyme检测铜绿假单胞菌的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的用于铜绿假单胞菌特异性检测的DNAzymes，可以实现铜绿假单胞菌的简单、快速、精确检测。
本发明的又一个目的是提供所述DNAzyme的筛选方法。
本发明的另一个目的是提供所述DNAzyme用于检测铜绿假单胞菌的用途与检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于特异性识别铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的DNAzymes，所述DNAzymes的核苷酸序列为单链DNA片段, 其核苷酸序列（5’-3’）为PAE-1或者PAE-2：
PAE-1：TCCCCCTCTTGTTCCGGAGGAAGGACGGCAGGTGACCCTT
GGACGGGGTTGTCAGCAGTCTGTCCAT
PAE-2：TCCCCCTCTTGTGTGCGGGAGCACAGAGGGGGTGACGGTG
GTCTGGGGTTGTCAGCAGTCTGTCCAT
底物：TGCTGACAACTrAGGACAAGAGGGGGA。
本发明所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzymes，其进一步优选的技术方案是：用于其检测目标物时的底物，其序列为：TGCTGACAACTrAGGACAAGAGGGGGA。
本发明所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzymes，其进一步优选的技术方案是：对所述的DNAzymes序列和/或底物进行任何突变、改造所得到的序列和/或底物，并用于铜绿假单胞菌的检测。
本发明所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzymes，其进一步优选的技术方案是：所述的突变、改造选自：改造、磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化修饰；添加生物素、地高辛、荧光物质、淬灭集团、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
本发明还公开了一种如以上技术方案所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzyme的筛选方法，其步骤如下：
(1) 合成含有35个随机碱基的寡核苷酸文库和含有切割位点及生物素标签的引物；
(2) 将要检测的铜绿假单胞菌在营养肉汤液体培养基中进行培养；将菌悬液进行浓度梯度稀释并涂琼脂板以检测菌体数；
(3) 将步骤（2）所得菌体离心，保留上清液即胞外产物；
(4) 将初始文库通过PCR进行连接，引入切割位点和生物素标签，醇沉法纯化并回收DNA序列；
(5) 将步骤（4）所得PCR产物和链霉素包被的磁珠37℃连接30分钟；
(6) 然后磁性分离弃去上清液，用链霉链霉亲和素反应缓冲液清洗磁珠，去除不含生物素的DNA序列；
(7) 用0.2 N的NaOH洗涤磁珠，磁性分离以制备单链；
(8) 用去离子水清洗磁珠使pH接近中性；
(9) 将等体积的铜绿假单胞菌胞外产物与2×筛选缓冲液混合，37℃孵育切割1小时，磁性分离，醇沉法回收上清液；
(10) PCR扩增步骤(9)所得产物并用于下一轮筛选；
(11) 高通量测序和DNA序列分析；
(12) 候选DNAzyme活性及性质检测，筛选得到PAE-1和PAE-2。
以上所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzyme的筛选方法，其进一步优选的技术方案是，生物素标签均标记在DNA序列的5’端。
以上所述的用于特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzyme的筛选方法，其进一步优选的技术方案是，所使用的铜绿假单胞菌菌体浓度为4.5×108 CFU每毫升；DNA切割片段浓度测定中使用的仪器为超微量紫外分光光度计；所有结合和切割反应均在1.5毫升无菌离心管中进行；DNAzyme切割荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪；DNAzymes切割和磁性分离的磁珠直径为0.5 μm。
本发明还公开了一种铜绿假单胞菌的检测方法，将样品与标记的DNAzyme及底物混合后检测相应的数值，与空白比较并做出判断。
本发明还公开了DNAzymes的用途，所述的用途为将序列号为PAE-1或者PAE-2的DNAzymes用于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的特异性识别。
与现有技术相比，本发明技术方案的具有如下有益效果：
1、本发明提供了特异性强、切割能力高、检测限低的铜绿假单胞菌依赖性DNAzymes，无需对检测目标做复杂前处理，就能够快速、有效的检测铜绿假单胞菌，可广泛的应用于水产养殖和医院病房中铜绿假单胞菌病原微生物的快速检测，有效地保护水体免遭该病原菌污染，在水产养殖以及水体防污以及医院诊断方面具有广泛的应用价值。
2、本发明用铜绿假单胞菌筛选具有特异性的DNAzyme，以其他菌株为阴性对照，并对所得的DNAzyme进行特异性和敏感性等性质研究，得到了对铜绿假单胞菌具有超敏感性和特异性生物传感器。为铜绿假单胞菌的检测和鉴定，以及铜绿假单胞菌菌体引起的疾病的诊断提供了简单、快速、精确的方法。
3、特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzymes可形成特殊loop环的二级结构，其对铜绿假单胞菌具有特异性识别作用，荧光标记的DNAzymes可检测106 CFU/mL铜绿假单胞菌, 检测范围为大于1×106 CFU/mL。通过动力学检测，其切割速率为0.0167 min-1。
附图说明：
图1为本发明中所设计的荧光模拟分子信标原理切割图；
图2为本发明在进行体外筛选时对每轮切割片段浓度的检测图；
图3 为本发明中高通量测序得到的前10条DNA序列及其占比图；
图4为本发明中对候选DNA序列的切割活性检测图；
图5为本发明中得到的两条具有切割活性的DNAzyme的活性大小比对图；
图6为本发明中筛选得到的两条铜绿假单胞菌特异性RNA切割DNAzymes的二级结构模拟图；
图7为本发明中对铜绿假单胞菌胞外产物反应浓度优化图；
图8为本发明中DNAzyme切割影响pH优化图；
图9为本发明中筛选缓冲液中Na+、Mg2+浓度优化图；
图10为本发明中不同金属离子对DNAzyme切割活性的检测图；
图11为本发明中PAE-1 DNAzyme菌种特异性检测图；
图12为本发明中PAE-1 DNAzyme敏感性检测图；
图13为本发明中靶标的分子量鉴定；
图14为本发明中切割反应动力学。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对发明的铜绿假单胞菌特异性RNA切割的DNAzymes的筛选及性质鉴定进行详细说明。
实施例：
一、筛选前准备
(1) 随机文库和PCR引物的设计，随机文库均为75 nt的序列，并将5’端进行磷酸化，中间为35 nt的随机序列，两边为20 nt的引物序列。上海生工生物工程有限公司合成了DNA随机文库及相关体外筛选的DNA序列(5’-3’)。
初始文库：pGGACAAGAGGGGGATCTTGT-N35-GTTGTCAGCAGTCTGTCCAT
引物1：ATGGACAGACTGCTGACAAC
引物2:Biotin-TGCTGACAACTrAGGACAAGAGGGGGA
FAM-substrate: FAM-ATGGACAGACTGCTGACAACTrAGGACAAGAGGGGGA
(2) 采用营养肉汤液体培养基对铜绿假单胞菌进行培养，待其OD600 nm接近1时停止培养，利用梯度稀释涂布法确定每毫升细菌数量。
(3) 胞外产物的制备：将所有培养液按1 mL的量平均分装到1.5 mL的无菌离心管中，室温12000 rpm离心5 min，收集上清液，置于-20°C冰箱保存备用。
(4) 所有初始DNA文库及相关引物均需要经过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）进行纯化。
(5) 将随机文库、引物1 和引物2按照以下方案进行PCR扩增以制备符合RNA切割要求的初始DNA文库：
50 μL的PCR体系包括：1 μL 随机文库（终浓度为20 ng~100 ng），2 μL 10 μM 的引物1和引物2，1.5 μL 10 mM的dNTP混合液，5 μL 10×PCR 反应预混液，1 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，37.5 μL超纯水。PCR扩增条件如下： 94°C 预变性 5 min，94°C变性30 s，57°C 退火30 s，72°C 延伸1 min，扩增8个循环，最终72°C延伸2 min。
(6) 通过醇沉法纯化并回收所有产物，作为初始筛选文库进行体外筛选。
二、体外筛选
(1) 在1.5 mL的无菌离心管中加入50 μL浓度为50 mg/mL的链霉素包被磁珠（直径0.5 μL，取前充分振荡重悬），用500 μL链霉亲和素反应缓冲液洗涤磁珠，重复洗涤三次。
链霉亲和素反应缓冲液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，1 M NaCl，0.01%~0.1%Tween-20，pH 7.5
(2) 将含有生物素标签的PCR纯化产物溶解在500 μL的链霉亲和素反应缓冲液中与清洗后的磁珠混合（此时磁珠浓度为5 mg/mL），将该反应管置于DNA混合仪上37℃连接30min。
(3) 利用磁性分离器去除没有结合的DNA（上清），500 μL链霉亲和素反应缓冲液清洗两次。
(4) 加入500 μL 的0.2 N NaOH，混合均匀，室温静置2 min，然后进行磁性分离来去除不含生物素的DNA，重复此步骤1次。
(5) 去离子水对磁珠进行多次水洗直到pH维持在7左右。
(6) 150 μL的2×筛选缓冲液重悬磁珠，再加入150 μL的铜绿假单胞菌胞外产物（CEM-PA），混合均匀后置于DNA混合仪上37℃切割1 h。
2×筛选缓冲液：100 mM HEPES，300 mM NaCl，30 mM MgCl2，0.02% Tween-20，pH7.0
(7) 磁性分离，醇沉法回收反应所得切割片段（上清），Q5000紫外分光光度计检测浓度。
(8) 醇沉产物干燥后经PCR扩增，用于下一轮筛选。
通过对每轮筛选切割产物浓度的检测来判断筛选进程，如图2所示。
高通量测序分析：
将所得PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行高通量测序。该公司利用Illumina公司Miseq平台进行测序，产生 DNA序列的原始数据，对处理合格的序列进行统计分析，计算不同序列重复出现的次数，并按出现次数进行从高到低排序。我们根据序列长度和所占百分比由高到底选择了前10条序列，利用Clustal软件对这10条序列进行全序列比对。
序列占比图如图3所示。
候选DNA序列活性检测：
DNAzyme复合物制备：取3 μL 100 μM的 FAM-Substrate、2 μL 100 μM 的合成DNA序列和35 μL Buffer B混合均匀，90℃变性1分钟，自然冷却至室温以形成DNAzyme复合物（终浓度为5 μM）。
1.荧光法。
根据图1设计方案进行切割结果检测。取45 μL 的 2×筛选缓冲液， 41 μL 的超纯水，4 μL 的 5 μM DNAzyme复合物和10 μL CEM-PA于96孔板（每个样品含3个平行样）中，混合均匀，在多功能全波长酶标仪中检测，间隔30 s，读板60~120 min（激发波长= 488 nm，入射波长 = 520 nm）。最终将各反应混合物用尿素终止液终止反应后通过15% dPAGE电泳检测，利用凝胶成像仪进行数据分析并量化切割产物以确定切割率，利用公式Yt= Yo + a(1− e−kx)进行线性拟合，其中 Yt和 Yo 分别代表在不同的反应时间和反应时间为0时切割片段强度，k代表实时切割比率。检测结果如图4所示
2. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（15% dPAGE）。
取45 μL 的 2×筛选缓冲液， 41 μL 的超纯水，4 μL 的 5 μM DNAzyme复合物和10 μL CEM于避光管中混合均匀，在37℃切割30 min。按1：1的体积加入2×尿素终止缓冲液，150 V电泳1h。用Gel DocTMEZ凝胶成像分析系统分析拍照。
15 % dPAGE配方如下：
15 % dPAGE储存液 7 mL
10 %过硫酸铵 32 μL
TEMED6 μL
3. 酶标板快速检测
DNAzyme复合物稀释到200 mM，用移液枪取30 μL加到酶标板孔中央，避光放入烘箱1-2h，直到烘干，取出再加入20 μL CEM-PA，置于暗箱式紫外分析仪中观察拍照。
二级结构分析：
用IDT Oligo Analyzer 3.1(https://sg.idtdna.com/UNAFold) 寡核苷酸结构在线分析系统对PAE-1和PAE-3二级结构进行预测。结果发现这两条DNAzyme均含有一个特殊茎环结构（参见图5）。该茎环上红色部分的序列在PAE-1和PAE-2上高度保守，可能与CEM-PA的活性区域有关。
胞外产物浓度优化：
在相同浓度PAE-1的条件下以等体积的不同OD600 nm (0、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9)值的CEM-PA 为横坐标，通过线性曲线方程拟合公式F=Y0+a*x进行线性曲线拟合，其中F为不同OD600 nm浓度下PAE-1切割片段强度，Y0是OD600为0时所对应的片段强度，a为常数。以切割产物片段荧光比值为纵坐标监测绘制如图6所示对比图。结果显示，随着OD600的增加，切割片段强度也逐渐加强，并与OD600 nm等于0.8时进入平衡期，其相关系R2数为0.985，说明OD值与切割片段强度之间具有很好的相关性。
切割反应pH优化：
取OD600 nm为0.8时所对应的CEM-PA浓度为恒量，来研究不同pH值下PAE-1的切割活性。由于反应液中的Mg2+容易在碱性条件下形成沉淀影响实验精确性，我们选pH 4.5-8为优化范围。pH 4.5-5时用乙酸-乙酸钠调节，pH 5.5-6.5时用MES调节，pH 7-8时用HEPES调节。如图7所示，在酸性环境中PAE-1，PAE-2活性较弱或受到抑制（如pH 4.5和5），在pH较高时（如pH7.5和8）显示出较高的活性，pH 7.5到pH 8时仅有小幅度的提升，再提高pH不会增加切割活性反而会因为沉淀影响实验准确性。因此，我们选择pH 8.0为该DNAzyme反应最佳pH并以此来完成该DNA酶的其它化学性能鉴定。
筛选缓冲液中Na+、Mg2+浓度优化:
DNAzyme在特异性金属离子的存在下有较强的切割活性，不同种类和浓度的金属离子能显著影响DNAzyme的活性。二价金属离子是脱氧核酶赖以发挥活性的一个关键性因素，可稳定脱氧核酶的反应过渡状态，有助于其折叠成活性结构。我们首先检测了不同浓度（0，30，60，90，120，150，180，210，240，300，400和600 mM）Na+和Mg2+对PAE-1 DNAzyme活性的影响，当Mg2+浓度为0时，分别检测0，30，60，90，120，150，180，210，240，300，400和600 mM浓度的Na+对DNAzyme活性的影响。选出活性最高时Na+的浓度是30 mM，以Na+浓度为30 mM时检测不同Mg2+的DNAzyme活性。（参见图8），PAE-1，PAE-2的活性随着Na+和Mg2+浓度的增加表现为先上升后下降的趋势，当Na+浓度超过30 mM或者 Mg2+浓度超过60 mM，DNAzyme活性都急剧下降，甚至比Na+和Mg2+浓度为0时都低。这可能是高浓度的金属离子改变了DNAzyme的三维结构，使切割活性降低。
不同金属离子对切割活性的检测：
我们首先评估了锂、钠和钾三种离子（Li+、Na+和K+浓度为30 mM）在1h时对DNAzyme活性的影响（参见图9），其活性大小为：K+>Li+>Na+。然后在含有二价金属离子的缓冲液中加入EDTA形成络合物来判断它对DNAzyme的影响。结果显示，DNAzyme在没有二价金属离子辅助的情况下，其活性受到极大抑制。接下来在30mM Na+的存在下，测试了不同二价金属离子（Ca2+、Ni2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Sr2+）对DNAzyme活性的影响（参见图9）。其中Mn2+、Ni2+、Co2+和Mg2+有较好的辅助作用，切割活性大小为：Mg2+> Co2+> Ni2+> Mn2+，和以前报道的具有相似性。我们发现这些金属离子有一定相似性，Li+、Na+和K+ 在元素周期表上都属于ⅠA族，核外电子排列上有一定相似性，Co2+、 Ni2+、 Mn2+都属于第四周期过度金属元素，电子层数相同。所以除了固有的Na+外，K+和Co2+也有很好的切割效果。
特异性检测：
本实验以铜绿假单胞菌胞外产物为筛选靶标，除了细胞本身代谢，培养基也是影响实验的关键因素，为了消除可能由培养基造成的切割，我们将序列一DNAzyme和空白培养基混合进行验证，同时也验证了PAE-1，PAE-2在8种不同细菌胞外产物下的特异性。（参见图10），结果表明，空白培养基（标记空白对照）不仅不能引起切割，还会导致荧光的淬灭。验证的8种细菌：创伤弧菌，金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气假单胞菌、创伤弧菌、迟钝爱德华菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都不具备切割活性，荧光值都保持下降。因此，PAE-1，PAE-2对铜绿假单胞菌具有高度特异性，其在经过修饰之后可制备成用于铜绿假单胞菌特异性检测的生物传感器，为今后铜绿假单胞菌的检测提供便利。
敏感性检测：
我们采用梯度稀释法稀释铜绿假单胞菌培养液（6.5×108 cfu/mL）来收集不同浓度下的铜绿假单胞菌胞外产物，从而确定PAE-1，PAE-2的有效检测范围。取不同浓度的铜绿假单胞菌胞外产物（培养液12000 rmp 5 min离心）在上述最佳条件下进行DNAzyme检测，37℃2h内的荧光值变化如图11所示。结果表明，随着铜绿假单胞菌浓度从10-6递增，切割产生的荧光值逐渐加强，检测限为6.5×10-6 cfu/mL。
靶标性质及分子量预测:
为了判断铜绿假单胞菌胞外产物的种类，我们先假设这种靶标是一类蛋白质。实验组取36μL水、45μL BufferB、5μL胰蛋白酶和10μL CEM，在37℃消化60分钟，然后加入4μLDNAzyme混合均匀， 37℃读板（激发波长= 488 nm，入射波长 = 520 nm）2h。对照组将胰蛋白酶沸水煮5分钟灭活，其它步骤相同，结果如图12所示。结果得出CEM-PA可以被胰蛋白酶消解，可以确定靶标为蛋白质。然后我们尝试用不同孔径的离心过滤管来估量该蛋白质的分子量，我们分别使用了3K、5K、10K和50K的离心柱过滤CEM-PA，并将滤液分别进行孵育，结果显示仅50K的滤液可以诱导PAE-1，PAE-2的切割，其他均不能引起切割反应（参见图13），该数据显示目标蛋白的分子量在10 kDa和50 kDa之间。
切割速率：
基于以上研究，我们在100 mM HEPES、60 mM K+、30mM Mg2+ 和pH8.0的条件下分别测定了PAE-1，PAE-2切割反应动力学（参见图14），并通过一级反应速率方程Yt= Y0+ a（1-e-bx）来完成动力学线性曲线拟合，其中Yt和Y0分别代表在给定的反应时间t和时间为0时DNAzyme切割片段强度，b代表反应速率常数。拟合结果表明：PAE-1具有良性的切割性能，其反应速率常数为0.0167min-1，PAE-2也具有良性的切割性能，其反应速率常数为0.0197min-1该速率表明在特定条件下该DNAzyme可有效的对铜绿假单胞菌的检测。
序列表
<110> 江苏海洋大学
<120> 识别铜绿假单胞菌的DNAzymes及筛选检测方法与用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tccccctctt gttccggagg aaggacggca ggtgaccctt ggacggggtt gtcagcagtc 60
tgtccat 67
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
tccccctctt gtgtgcggga gcacagaggg ggtgacggtg gtctggggtt gtcagcagtc 60
tgtccat 67
