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一种嗜麦芽窄食单胞菌GYH及其在降解氯代烃类污染物中的应用

2020-11-13 11:32:54

　　一种嗜麦芽窄食单胞菌GYH及其在降解氯代烃类污染物中的应用

　　(一)技术领域

　　本发明涉及一种嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)GYH及其在降解三氯甲烷等污染物中的应用。

　　(二)背景技术

　　氯代烃是烃分子中的氢原子被氯原子取代后形成的一种卤代烃。卤代烃根据取代卤素的不同，分为氟代烃、氯代烃、溴代烃和碘代烃;也可根据分子中卤素原子的多少分为一卤代烃、二卤代烃和多卤代烃。低级的烃是气体或者液体，高级的烃是固体。绝大多数卤代烃不溶于水或在水中溶解度很小，但能溶于有机溶剂。卤代烃大都有特殊气味。卤代烃是一类重要的有机合成中间体，是许多有机合成的原料，许多卤代烃可用作灭火剂(如四氯化碳)、冷冻剂(如氟利昂)、麻醉剂(如氯仿，现已不使用)、杀虫剂(如六六六，现已禁用)，以及高分子工业的原料(如氯乙烯、四氟乙烯)，以及重要的卤代烃—氟利昂。卤素是强毒性基，卤代烃一般比母体烃类的毒性大。卤代烃经皮肤吸收后，侵犯神经中枢或作用于内脏器官,引起中毒。一般来说，碘代烃毒性最大,溴代烃、氯代烃、氟代烃毒性依次降低。低级卤代烃比高级卤代烃毒性强;饱和卤代烃比不饱和卤代烃毒性强;多卤代烃比含卤素少的卤代烃毒性强。

　　三氯甲烷主要用来生产氟利昂，染料和药物，在医学上常用作麻醉剂，可用作抗生素、香料、油脂、树脂、橡胶的溶剂和萃取剂，与四氯化碳混合可制成不冻的防火液体，还可用于烟雾剂的发射药、谷物的熏蒸剂和校准温度的标准液。三氯甲烷对身体的危害只要作用于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。当吸入或经皮肤吸收引起急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤湿热和粘膜刺激症状。以后呈现精神紊乱、呼吸表浅、反射消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性颤动。同时可伴有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感，伴恶心、呕吐、腹痛、腹泻。以后出现麻醉症状。液态可致皮炎、湿疹，甚至皮肤灼伤。慢性影响主要引起肝脏损害，并有消化不良、乏力、头痛、失眠等症状，少数有肾损害及嗜氯仿癖。

　　因此研究环境中三氯甲烷的降解对人类健康很有必要，通过文献检索，有关于Stenotrophomonas maltophilia对多环芳烃、苯并芘、环三亚甲基三硝胺的生物降解的一些报道，未发现有关嗜麦芽窄食单胞菌以三氯甲烷等为唯一碳源来实现高效降解的报道。本发明的嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia GYH能以三氯甲烷等为唯一碳源实现降解，并且生长环境温和，易扩大培养，该降解菌的发现对于工业废水废气中氯代烃类污染物的高效净化具有重要意义。

　　(三)发明内容

　　本发明目的是提供一种嗜麦芽窄食单胞菌及其降解氯代烃类污染物中的应用，该菌株具有较强的高效去除污染物能力。

　　本发明采用的技术方案是：

　　本发明提供一株新菌株--嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)GYH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 20191025，保藏日期：2019年12月09日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

　　本发明嗜麦芽窄食单胞菌GYH的基本特征为：菌落淡黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为椭圆型菌，有鞭毛，革兰氏染色阴性。

　　本发明还提供一种所述嗜麦芽窄食单胞菌GYH在降解氯代烃类污染物中的应用，具体所述的应用是将嗜麦芽窄食单胞菌GYH经扩大培养获得的静息细胞加入pH=5-8(优选pH=7)无机培养基中，再加入氯代烃类污染物，在20-35℃、140-180rpm(优选30℃、160rpm)条件下进行培养，实现污染物的降解。

　　进一步，所述氯代烃类污染物包括三氯甲烷、氯苯、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、二氯甲烷。

　　进一步，所述无机盐培养基中，静息细胞加入量以菌体干重计为50-100mg/L，优选80mg/L。

　　进一步，所述无机盐培养基中氯代烃类污染物的初始加入浓度为1-10mg/L，优选2.98-8.93mg/L。

　　进一步，所述无机盐培养基组成为：KH2PO4 2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.025g/L、NaOH 0.18g/L，溶剂为超纯水，pH 5-8。

　　本发明将嗜麦芽窄食单胞菌GYH接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养2d，使保藏的细菌活化复苏，再将活化的细菌划线于LB固体培养基，30℃培养箱培养，取单菌落继续平板划线以检测细菌的纯度，得到可常规保持(4℃)的细菌斜面，该细菌斜面需要每三个月转接一次，以保证菌种的活性。

　　进一步，所述嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞按如下步骤制备：

　　(1)斜面培养：

　　将嗜麦芽窄食单胞菌GYH接种至LB固体培养基，30℃培养箱培养，得到斜面菌体;LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaNO3，10g/L蛋白胨，15-20g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水;

　　(2)扩大培养

　　将步骤(1)斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养基洗涤，获得嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞;LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaNO3，10g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH自然。

　　与现有技术相比，本发明有益效果体现在：

　　本发明提供的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)GYH取自污水厂污泥，对于氯化烃类，尤其是三氯甲烷具有较好地降解效果，可以把其转化为CO2、H2O等无害物质;

　　本发明所述的嗜麦芽窄食单胞菌GYH能去除氯代烃类污染物的浓度可从2.9-8.93mg/L。因此，该嗜麦芽窄食单胞菌对于工业类似污染物(如氯苯等)具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。

　　(四)附图说明

　　图1为菌株GYH在LB培养基菌落形态照片。

　　图2为菌株GYH的透射电子显微镜照片。

　　图3为菌株GYH的系统发育树图。

　　图4为菌株GYH不同浓度降解完全所需时间。

　　图5为菌株GYH不同浓度底物84h降解率。

　　图6为菌株GYH不同pH下84h降解率。

　　(五)具体实施方式

　　下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

　　下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　实施例1：Stenotrophomonas maltophilia GYH的分离、纯化及其鉴定

　　1、Stenotrophomonas maltophilia GYH的分离及纯化

　　Stenotrophomonas maltophilia GYH是从活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下：

　　在300mL摇瓶中加入50mL无机盐培养基，并加入10mL活性污泥和8.9mg/L的三氯甲烷进行富集培养，待三氯甲烷浓度为初始浓度的50%时从中取出5mL富集液于50mL新鲜无机盐培养基中，加入终浓度8.9mg/L的三氯甲烷，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布LB固体培养基，选择单菌落接种分离平板划线纯化(图1)，将生长获得的菌落加入无机盐培养基，并加入终浓度8.9mg/L三氯甲烷作为唯一的碳源及能源进行验证，得到具有三氯甲烷降解能力的目的菌株，记为菌株GYH，通过透射电子显微镜确定其形态(图2)。

　　无机盐培养基组成：KH2PO4 2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.025g/L、NaOH 0.18g/L，溶剂为超纯水，pH 5-8。

　　LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaNO3，10g/L蛋白胨，18g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水。

　　LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaNO3，10g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH自然。

　　分离平板培养基组成：在无机盐培养基中加入18g/L琼脂后即得分离平板培养基，使用时加入终浓度8.9mg/L三氯甲烷作为碳源。

　　2、菌株GYH的鉴定

　　(1)菌株GYH特征

　　菌落浅黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为椭圆型菌，有鞭毛，大小为655×2577nm，革兰氏染色阴性。通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为Stenotrophomonas maltophilia，具体步骤如下：

　　(2)16S rRNA测序

　　采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取和纯化菌株GYH的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的DNA进行PCR扩增，引物分别为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(浙江天科高新技术发展有限公司)，16S rRNA测序结果(核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，将其上传GenBank，获得NCBI基因登录号为：MN860228)，与上传至Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Stenotrophomonas属，与Stenotrophomonasmaltophilia同源性最高，达到99%。从结果中选取15株Stenotrophomonas具有代表性的菌株，以16S rRNA基因序列同源性为基础，采用MEGA7软件构建系统发育树，如图3。

　　(3)菌株GYH对梅里埃GN卡上63种碳源的利用能力。

　　利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对63种不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))，鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应，菌株GYH可较强利用11种碳源，对其他52种碳源不能利用。

　　表1菌株GYH梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应结果(GN卡)

　　表注：+，阳性反应;-：阴性反应

　　通过生理生化特征、遗传距离及16S rRNA序列对比，将菌株GYH鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)GYH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M20191025，保藏日期2019年12月9日。

　　实施例2嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞的获得

　　1、斜面培养：

　　将嗜麦芽窄食单胞菌CCTCC NO：M 20191025接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养2d，再将活化的细菌划线于LB固体平板30℃培养箱培养24h，取单菌落继续平板划线以检测细菌的纯度，进行LB试管斜面常规(4℃)保存。

　　2、扩大培养

　　将步骤1斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞。

　　实施例3：嗜麦芽窄食单胞菌GYH对不同浓度三氯甲烷的降解性能检测

　　将无机盐培养基分装于体积均为330mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到80mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞，然后加入三氯甲烷作为唯一碳源使其终浓度分别为2.98、5.93、8.93、14.85、20.97、29.8mg/L，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的三氯甲烷浓度，并定时测定溶液中的氯离子生成，绘制不同底物浓度完全降解所需时间，以及84h不同底物浓度降解曲线，结果见图4、图5所示。结果表明，当三氯甲烷浓度低于8.93mg/L时，菌株GYH可以快速的降解所添加的底物。

　　实施例4：嗜麦芽窄食单胞菌CCTCC NO：M 20191025底物广谱性研究。

　　将实施例3中底物改为表2所示，底物加入终浓度10mg/L，其他同实施例3，结果见表2。从表2可以看出，嗜麦芽窄食单胞菌CCTCC NO：M 20191025对氯代烃类有机物均有降解效果，在48h内能完全降解10mg/L的氯苯，72h内能完全降解10mg/L的1.2-二氯乙烷，对其他三种氯代烃也有一定的降解效果。

　　表2不同底物的降解效果

　　实施例5：嗜麦芽窄食单胞菌CCTCC NO：M 20191025在不同pH下三氯甲烷的降解性能检测。

　　将pH分别为5，6，7，8的无机盐培养液分装于体积均为330mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到80mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的嗜麦芽窄食单胞菌GYH静息细胞，然后加入浓度为8.93mg/L的三氯甲烷作为唯一碳源，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的三氯甲烷浓度，并定时测定溶液中的氯离子生成，获得不同pH条件下三氯甲烷完全降解所需时间，结果见图6所示。表明菌株GYH降解三氯甲烷最佳pH为7。

　　虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。

　　序列表

　　<110> 浙江工业大学

　　<120> 一种嗜麦芽窄食单胞菌GYH及其在降解氯代烃类污染物中的应用

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1344

　　<212> DNA

　　<213> 嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)

　　<400> 1

　　gagcttgctc cttgggtggc gagtggcgga cgggtgagga atacatcgga atctactctg 60