一株产生物表面活性剂的石油芳烃降解菌株PB3及其应用
技术领域
本发明涉及一株产生物表面活性剂的石油芳烃降解菌株PB3(Klebsiellamichiganensis)及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
原油污染环境中多环芳烃降解难是我国石油石化污染控制和行业可持续发展中亟待解决的突出问题，在众多的多环芳烃污染修复方法中，微生物修复因其低成本、高效等优点，已成为解决石油污染问题的优选方法，而该方法中起主导作用的是降解菌株。因此，寻求多环芳烃高效降解菌株对于提高生物降解效率具有重要意义。
生物表面活性剂是一些特定微生物在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、脂肽、磷脂、脂肪酸中性脂和结合多糖、蛋白质等复合物。生物表面活性剂中含有亲水基团和亲油基团，相较于化学表面活性剂，具有绿色、低毒、环境友好等特性，在疏水性有机物如多环芳烃(PAHs)、石油等污染物修复中发挥着重要的作用，可使有机物乳化并明显增溶，加速微生物对疏水性物质的降利用和降解。因此，筛选既能分泌生物表面活性剂又能高效降解石油芳烃双重功能的微生物，具有广阔的市场应用价值，已成为石油污染生物修复以及微生物资源挖掘的重要工作。
本申请从石油污染土壤中分离出了一株产生生物表面活性剂的石油芳烃降解菌株，具有较高的开发和应用前景。
发明内容
本发明涉及一株能够降解石油芳烃且产生表面活性剂菌株PB3，该菌株能有效降解多种芳烃，可应用于石油污染环境生物修复。
通过对菌株PB3形态特征观察、16SrDNA测序、比对和进化树构建分析，确定该菌株为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)，并命名为密歇根克雷伯氏菌PB3(Klebsiella michiganensis PB3),其保藏号为：CGMCC NO.19312。该菌株于2020年01月07日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
密歇根克雷伯氏菌PB3的筛选方法，步骤为：(1)样品的采集及富集培养：分别用含有5.0g和10.0g原油的无机盐培养基对含油土样进行富集培养；(2)菌株分离纯化与筛选：用菲和芘为唯一碳源的选择培养基分离纯化富集液中菌株；纯化菌株进一步接入液体选择培养基中培养，依据对芳烃唯一碳源降解效果筛选出芳烃降解菌；(3)产表面活性剂菌株摇瓶筛选：将上述芳烃降解菌株，接入装有原油无机盐培养基的三角瓶中，进行培养，根据摇瓶中原油挂壁、溶解效果，以及发酵液浑浊乳化程度，选出能够利用原油(或石油)为碳源，产生生物表面活性剂的菌株；(4)排油圈法与液滴铺展法相结合，综合筛选得到产生物表面活性剂效率高的菌株，由此获得既能产生表面活性剂又能降解芳烃的菌株PB3。
所述密歇根克雷伯氏菌PB3能以芳烃为唯一碳源生长，具有降解石油芳烃能力，所述芳烃为多环芳烃，选自萘、菲、芘、芴、蒽中的至少一种。
所述菌株PB3在用原油为唯一碳源无机盐培养基培养时，可以产生生物表面活性剂。
所述菌株PB3在发酵培养过程中，生成了一种含有多糖和蛋白质的生物表面活性剂。
所述密歇根克雷伯氏菌PB3在制备生物表面活性剂的应用。
所述的密歇根克雷伯氏菌PB3在芳烃为唯一碳源降解中的应用。
密歇根克雷伯氏菌在降解土壤、水环境中多环芳烃的应用。
密歇根克雷伯氏菌PB3在原油或石油污染修复中应用。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的菌株密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)PB3可利用原油进行生长，并且可利用原油发酵产生生物表面活性剂，对原油降解起到乳化、增溶作用。且伴随着菌株生长，生物表面活性剂不断分泌产生，作用持久。
2、本发明提供的菌株PB3具有降解萘、菲、芘、芴、蒽在内的多环芳烃能力，降解谱宽。
3、本发明提供的菌株PB3,具有分泌生物表面活性剂和降解多环芳烃双重功能，在处理原油污染中，可一举两得，应用前景广阔。可用于原油或石油污染土壤和水体的修复，同时可用于焦化废水和石化废水的生物降解处理。
附图说明
图1为菌株PB3平板菌落形态。
图2为菌株PB3显微形态电镜照。
图3为菌株PB3的系统发育树。
图4为菌株PB3利用原油产生生物表面活性剂乳化效果实验照(a)未接菌对照组，(b)接菌实验组。
图5为菌株PB3对芘为唯一碳源的降解曲线。
具体实施方式
下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。
实施例1：菌株筛选与鉴定
1、样品的采集及富集培养
菌样：采自天津某油田石油污染土样多份。
取10.0g石油污染土样，加入到装有100ml灭菌生理盐水的三角瓶中，在28℃、160r/min的恒温摇床中震荡30min。取10mL震荡液加入到90mL以原油为唯一碳源的富集培养基中，28℃、160r/min下培养5-7d；再按照10％接种量转接至新的相同的富集培养基中继续培养3次，得到富集培养液。
所述的富集培养基：NH4NO3 2.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，原油含量分别为5.0g、10.0g，pH＝7.0±0.2，121℃灭菌15-20min。
2、菌株分离纯化与筛选
(1)芳烃平板分离与纯化：取上述富集培养液1mL，用生理盐水将其分别稀释成10-1-10-6梯度的菌液，分别涂布于芳烃为唯一碳源的选择培养基平板上，于30℃的恒温培养箱中培养。待平板培养基上长出单一菌落后，挑取生长较快、形态不同的单菌落，继续在相同培养基平板中划线纯化，得到纯菌落，用牛肉膏蛋白胨培养基试管斜面保存菌株。通过上述操作，得到能够利用富集培养基中原油生长且能够利用芳烃菲和芘生长的菌株。
所述的选择培养基：用丙酮分别配制含有芳烃菲或芘的溶液，用0.22um滤膜过滤除菌后，按照一定添加量，分别添加至灭菌后且冷却至45-50℃的无机盐培养基中，得到含有菲或芘为唯一碳源，浓度包括25mg/L、50mg/L、150mg/L的选择培养基；摇匀倒平板，得到选择培养基平板，待丙酮挥发后使用。
无机盐培养基：NH4NO3 2.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O0.1g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH＝7.0，121℃灭菌15-20min。如配置固体培养基，添加10-14g/L琼脂。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌15-20min。
(2)芳烃降解摇瓶测定与筛选：取上述芳烃平板分离纯化得到的菌株，用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化培养24h，然后，取菌株活化液在4℃、8000r/min下离心5min，取菌体，使用无机盐液体培养基悬起菌体得到菌悬液。将菌悬液分别接种到菲或芘为唯一碳源的液体选择培养基中，菲或芘浓度包含20mg/L和50mg/L，然后置于28-30℃、160r/min条件下培养6d，取样测定OD600和降解率。分析不同菌株利用芳烃生长和降解效果，通过分析比较，挑选出对菲或芘降解率高的菌株，取降解率大于40％菌株，由此得到多株芳烃降解菌株。所述的液体选择培养基配置方法同上述(1)，但不添加琼脂。
经富集、分离纯化与芳烃降解摇瓶测定实验，得到多株能够利用原油生长和降解芳烃的菌株，在此基础上，利用产表面活性剂摇瓶筛选法、排油圈法以及液滴铺展法，进一步从中筛选出具有产生物表面活性剂的菌株。
(3)产表面活性剂菌株摇瓶筛选法：取上述得到的芳烃降解菌株，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，160r/min摇床中活化12-24h，然后，取菌株活化液在4℃、8000r/min下离心5min，取菌体，使用无机盐液体培养基悬起菌体制备菌悬液，即得到种子液，调整其OD600＝0.8，然后接种至装有原油无机盐培养基的三角瓶中，接种量为5-8％，同时设置未接种的空白对照组(CK)。将三角放置于30℃，160r/min摇床中连续培养，在第2、4、6、8d观察摇瓶中原油挂壁、溶解效果，以及发酵液浑浊乳化程度。实验发现对照组原油黏瓶壁严重，油水分离，发酵液呈透明状态。对于加菌后的实验组，不同菌株在培养后呈现状态不同，挑选出对原油乳化作用明显、原油不黏壁、发酵液呈浑浊状的摇瓶，记录其菌株编号。此方法以原油(或石油)作为唯一碳源，由此进一步筛选得到可利用原油(或石油)做碳源生长，且能产生物表面活性剂的菌株。图4为菌株PB3接种到以原油为唯一碳源的无机盐培养基中培养6d，产生表面活性剂的摇瓶实验照，其中，(a)为未接菌对照组，(b)为接菌实验组。
所述的原油无机盐培养基为：NH4NO3 2.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCl2 0.01g，FeSO4.7H2O 0.01g，原油5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌30min。
(4)排油圈法与液滴铺展法：取上述具有降解芳烃菲或芘、且对原油有乳化性作用的菌株，按照上述(3)中方法制备种子液，采用2-3％接种量，将种子液接种至装有发酵培养基的三角瓶中，置于30℃、160r/min摇床中连续培养，在培养的第1-6d，每天取发酵液，经8000rpm离心5min，得到发酵液的上清液，备用。
取直径为9cm或15cm培养皿，加蒸馏水，水面上加适量液体石蜡(或石油、或柴油)形成油膜。在油膜上滴加上述制备的发酵液的上清液，中心油膜被挤向四周，形成一个圆圈，测量该排油圈直径，连续测定3次，取平均值作为该菌株的排油圈直径，并以此作为衡量菌株产表面活性剂能力的指标。选取排油圈直径大于4.6cm以上菌株，并进一步结合液滴铺展法筛选表面活性剂产生菌株。
液滴铺展法操作步骤如下：使用量程为200ul的移液枪吸取上述发酵液的上清液，将液滴按照一定高度，垂直滴在干净的载玻片上，待液滴稳定之后使用游标卡尺量取液滴直径，对照组CK为蒸馏水。每个实验设置10个平行，取其平均值。形成液滴直径越大，表面活性越强，挑选直径大于0.8400cm的液滴。
所述的发酵培养基：葡萄糖18.0g，NaNO3 2.0g，KH2PO4 1.5g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO4 0.01g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，115℃灭菌15min。
在上述摇瓶筛选法基础上，结合排油圈法与液滴铺展法，综合评定产表面活性剂的能力。该方法简单实用，通过这种方法得到了产表面活性剂的微生物菌株。由此得到了对原油(或石油)乳化作用强的产生物表面活性剂的菌株PB3，该菌株同时能较好利用原油生长和降解芳烃。将筛选得到菌株用牛肉膏蛋白胨试管斜面4℃保存备用。
3、菌株形态与分子生物学鉴定
(1)菌落形态特征观察
对菌株PB3菌落形态和显微形态观察发现，该细菌菌落形态为圆形、有光泽、整齐、光滑、不透明、白色；显微形态特性为杆状。菌株PB3菌落形态和显微形态见图1，其中(a)为平板中的菌落照，(b)为显微形态扫描电镜照。
(2)菌株PB3的分子生物学鉴定
a)基因组的提取与PCR扩增
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，提取PB3菌株基因组DNA，送北京生工生物公司进行PCR扩增和测序。利用细菌通用引物27F和1492R，对菌株PB3的16S rDNA基因进行PCR扩增，PCR扩增条件采用50μl反应体系：10×PCR buffer 5μl，dNTP mix 1μl，Template 2μl，引物27F4μl，1492R4μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，ddH2O 33.75μl。
PCR反应条件：95℃预热5min，95℃30S，55℃30S，72℃1.5min，循环35次，72℃延伸7min。
PCR所得产物,由生工生物公司测序，得到菌株PB3的16S rDNA基因序列长度1437碱基(bp)。
b)测序及系统发育树构建
将测序结果与http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon比对，发现菌株PB3的16SrDNA序列与Klebsiella michiganensis菌的同源性较高，相似性达到99.90％。挑选相关菌株的基因序列，用MEGA 6.0构建系统发育树，见图3。图3显示，菌株PB3与菌株Klebsiella.michiganensis W14(JQ070300)聚于同一分支，系统发育关系最为密切。
c)菌株PB3鉴定为具有新功能菌株
通过对菌株PB3形态特征观察、16SrDNA测序、比对和进化树构建分析，确定该菌株为密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)，并命名为密歇根克雷伯氏菌PB3(Klebsiella michiganensis PB3),其保藏号为：CGMCC NO.19312。该菌株于2020年01月07日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
目前，有关密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)具有降解萘、菲、芘、芴、蒽在内的多环芳烃且能够产生生物表面活性剂双重功能，国内外尚未见到报道。因此，菌株PB3是一株具有降解石油芳烃和产生物表面活性剂的新功能菌株。
实施例2：菌株PB3降解芳烃研究
将菌株PB3用牛肉膏蛋白胨培养基活化后，用上述方法制备菌悬液，接种至芳烃浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L无机盐液体培养基中，接种量为5-8％，设置未加菌液做空白对照。将样品放置于30℃、160r/min摇床中连续培养8d。从第0d开始，每天取样测定发酵液中芳烃碳源残留量，并计算降解率。结果发现菌株PB3对20mg/L-100mg/L的芘均有降解能力，其中对浓度为20mg/L的芘降解率可达82.48％，对浓度为20mg/L的芘降解率见图5。
利用上述方法，制备菌株PB3菌悬液，分别接种至含有芳烃萘、菲、芴和蒽为唯一碳源的无机盐液体培养基中，萘、菲、芴和蒽浓度设置为100mg/L、50mg/L、50mg/L及50mg/L，接种量为5-8％，设置未加菌液做空白对照。将样品放置于30℃，160r/min摇床中连续培养8d，从第0d开始连续8d，每天取样，分别测定不同芳烃在发酵液中的残留量，并计算降解率。结果发现菌株PB3对萘、菲、芴和蒽均具有降解能力，降解率在65％以上。
另外，研究还发现，菌株PB3对多环芳烃为唯一碳源降解体系中，添加适宜共代谢碳源，有助于降解率提高；同时，添加适宜的共代谢氮源，也有助于降解率提高。
多环芳烃测定方法：将多环芳烃萘、菲、芘、芴、蒽溶解于环己烷中，使用紫外可见分光光度计在200-800nm进行全波段扫描，得到萘、菲、芘、芴、蒽的最大吸收波长分别是275nm、292nm、262nm、264nm及357nm。构建不同多环芳烃的标准曲线。测定降解液吸光值，根据标准曲线计算各种芳烃生物降解率。
综上所述，菌株PB3能够利用原油生长，同时具有降解多种多环芳烃的功能，可用于原油或石油污染土壤、水体中多环芳烃的生物降解处理，也可用于环境中多种多环芳烃复合污染的生物修复。
实施例3：菌株PB3产生物表面活性剂研究
1、菌株代谢胞外多糖表面活性物质
将菌株PB3接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min摇床中活化培养24h，取菌株活化液，在4℃、8000r/min下离心5min，取菌体，使用无机盐液体培养基悬起菌体，再离心、弃上清、再次悬起菌体，如此操作3次，得到菌悬液。然后，按照5％接种量，将菌悬液分别接种到原油为唯一碳源的无机盐培养基中，以及乙酸钠为唯一碳源的无机盐培养基中，原油和乙酸钠添加量为5g/L，同时设置未接菌的空白对照组(CK)。置于30℃、160r/min摇床中连续培养7d，每天取发酵液样，置于4℃、8000r/min下离心5min，取上清液，用于测定菌株代谢胞外多糖含量，测定方法采用蒽酮比色法测定。
测定结果显示，用原油和乙酸钠无机盐培养基培养菌株PB3，均产生了胞外多糖物质，在第3天产量为35-54mg/L。
2、菌株代谢胞外蛋白质表面活性物质
将菌株PB3接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min摇床中活化培养24h，取菌株活化液，在4℃、8000r/min下离心5min，取菌体，使用无机盐液体培养基悬起菌体，再离心、弃上清、再次悬起菌体，如此操作3次，得到菌悬液。然后，按照5％接种量，将菌悬液分别接种到蔗糖为唯一碳源的无机盐培养基中，蔗糖添加量为15g/L，同时设置未接菌的空白对照组(CK)。置于30℃，160r/min摇床中连续培养7d，每天取发酵液样，置于4℃、8000r/min下离心5min，取上清液，用于测定菌株代谢胞外蛋白质含量，测定方法采用考马斯亮蓝法测定。
测定结果显示，用蔗糖无机盐培养基培养菌株PB3，产生了胞外蛋白质物质，在第3天产量为42.42mg/L。
以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的详细说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的精神和原则范围内所做的改进、简化、替代、组合等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一株产生物表面活性剂的石油芳烃降解菌株PB3及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)
<400> 1
atgatacaag tggtagcgcc ctcccgaagg ttaagctacc tacttctttt gcaacccact 60
cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt ggcattctga 120
tccacgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggacta 180
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atttcaccgc tacacctgga attctacccc cctctacaag actccagcct gccagtttcg 840
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tcgccttcct ccccgctgaa agtactttac aacccgaagg ccttcttcat acacgcggca 1080
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gaggcccgaa ggtccccctc tttggtcttg cgacgttatg cggtattagc taccgtttcc 1320
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cacccgagag caagctctct gtgctaccgt tcgactgcat ggtagcgccg ccaagtc 1437
