一种约氏乳杆菌及其制备的腺苷七肽、制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种约氏乳杆菌、能制备钝化细菌脂多 糖活性的腺苷七肽、还涉及其制备方法。
技术背景
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的主要组 成成分。脂多糖又称内毒素，当细胞死亡后，脂多糖被释放出来，在体内可以通 过细胞信号转导系统激活内皮细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞等，使其合成和释 放多种细胞因子和炎性介质等细胞刺激因子，进而激发机体积极防御，引起一系 列炎性反应。LPS作为一种典型的细胞膜上的模式识别受体(MAMP)，是诱导 动物肠黏膜损伤的应激源之一，其不仅可损伤肠道，还会引发细菌移位，损伤的 胃肠道屏障会造成肠道紧密连接蛋白异常表达，使得内毒素、病原体等得以穿过 肠壁。LPS能诱导活化细胞表面Toll样受体4(TLR4)激发下游的NF-κB信号通路， 并合成释放细胞炎性因子(白介素IL-1β、IL-8和肿瘤坏死因子TNF-α等的表达)， 继而加重肠道的损伤(王梦竹，脂多糖诱导的肠屏障蛋白及其信号通路研究进展， 动物营养学报，2020)。很小剂量的LPS即可产生极其广泛的生物及病理作用， 严重威胁人类健康(刘霏，内毒素脂多糖对药物转运体的影响研究进展，解放军 药学学报，2015)。研究表明，某些蛋白和多肽可与LPS中和，从而缓减炎症， 预防由革兰氏阴性杆菌引起的败血症(专利CN 107200783 A；石芳，生命的化 学，2004，24(4)：312-314)。但目前作为能够降低LPS活性的多肽大部分来 源于动物本身，如专利CN 107200783 A中能够结合LPS减低活性的为15个氨基 酸残基组成的血浆高分子量激肽原，其实际生产过程需要从血浆中进行提取，生 产工艺和环境要求苛刻，成本较高，无法在动物生产中应用。
特定乳杆菌能够在LPS诱导的肠道炎症中发挥免疫调节作用，抑制细胞炎症 信号通路的激活，降低炎症因子的表达，乳杆菌的抗炎作用可能通过其产生的代 谢产物，如酸性代谢产物、胞外多糖、生物活性肽等发挥效应。但是，目前未见 可生产、分泌能够降低LPS活性的纯化单体(肽)的乳杆菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种能产生腺苷七肽的约氏乳杆菌，通过微生物发酵制 备的腺苷七肽，无毒副作用，具有降低LPS活性的功效。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种约氏乳杆菌，分类命名为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii，2020年5 月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国北京， 保藏号为CGMCC NO.19858。
上述约氏乳杆菌，能制备高纯度(90％以上)的腺苷七肽，且能够实现高 产。
本发明的另一目的是提供一种腺苷七肽，其氨基酸序列为：MATGNAD (SEQ ID NO:1)。
上述腺苷七肽在体外可降低70％以上的细菌LPS活性，体内可减少LPS攻毒 小鼠的炎症反应。
一种饲料，包含上述腺苷七肽。
一种药物组合物，包含上述腺苷七肽及一种或多种辅料。
上述辅料包括填充剂、赋形剂、粘合剂、增溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、 软膏剂、矫味剂、矫嗅剂、崩解剂、防腐剂。
本发明还提供了一种发酵培养基，用于上述约氏乳杆菌的发酵培养，该培养 基为蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁的组合物，其中蛋白胨为1％， 酵母浸出粉为0.5％，葡萄糖为2％；醋酸钠为0.5％；硫酸镁为0.05％，以重量百分 比计，培养基pH为6.0～7.0。
本发明还提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将上述约氏乳杆菌接种于上述发酵培养基，静置培养14～16小时，再 按照10％体积转接于发酵培养基培养12～14小时，培养温度为35～37℃；
步骤2：发酵液通过碟式离心机和陶瓷膜(孔径200nm)除杂，获得清液；
步骤3：清液先后通过陶瓷超滤膜(2000Da)及陶瓷超滤膜(500Da)，收 集浓液；
步骤4：浓液通过调节等电点，离心获得沉淀物；
步骤5：沉淀物按照1:5溶于去离子水(pH＝7.0～7.5)中，重复调节等电点及 离心获得沉淀物；
步骤6：沉淀物通过冷冻干燥(-80℃～-55℃，真空度<10Pa)，获得腺苷七 肽纯品。
上述制备方法中，等电点为PH＝6.3。
有益效果：
1.腺苷七肽(又名杆菌七肽、microcin C7肽)是由肠杆菌属、乳杆菌属等 微生物分泌的一种细菌素类抗菌肽，其是由7个氨基酸残基组成的寡肽，C端通 过N-酰磷酰胺键与5'-磷酸腺苷(AMP)所中和形成小分子量抗菌肽，具有一定 的抗菌能力。腺苷七肽N端的蛋氨酸(Met)残基为其保守序列，不同微生物分 泌的腺苷七肽的氨基酸残基略有所差异(Olga Bantysh，mBio，2014，5(3)： e01059-14)。本发明通过微生物发酵方法，从约氏乳杆菌的代谢产物中分离获 得的腺苷七肽，安全性高，对细胞或生物体均无毒副作用，具有抗菌抗炎多重功 效，可作为新型饲料添加剂、兽药或药物组合物成分等。
2.本发明提供了一种制备上述腺苷七肽的约氏乳杆菌，采用微生物发酵即 可大量获得高纯度的腺苷七肽，成本低、质量高、无毒害。
3.本发明提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，采用上述菌株在特制发酵 培养基中发酵培养，通过超滤，等电点析出，离心等步骤可获得20～30kg/天产量 的高纯度(90％以上)腺苷七肽，生产工艺简单、生产效率高、成本低，可实现 规模化生产制备。
附图说明：
图1是样品串联质谱序列匹配结果
图2是腺苷七肽的结构式
图3是不同浓度腺苷七肽与30μg/mL LPS混合30min后的各组LPS含量
图4是各实验组中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10的表达水平
图5是各实验组中NF-κB(P65)和iNOS的表达水平
具体实施方案
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例 只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领 域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调 整。
一、腺苷七肽的制备和回收
1将约氏乳杆菌(CGMCC NO.19858)接种于MRS肉汤培养基，静置培养14～16 小时，培养温度为35～37℃；
2.将培养好的约氏乳杆菌按照10％体积转接于发酵培养基，每1000ml培养基成分为：蛋白胨10g；酵母浸出粉5g；葡萄糖20g；醋酸钠5g；硫酸镁0.5g，调节 pH＝6.0～7.0(通过氢氧化钠进行调节)，溶氧≤10％(通过搅拌速度进行调节)， 培养12～14小时，培养温度为35～37℃；与常规MRS与改良MRS培养基比较，上 述发酵培养基能显著提高腺苷七肽的产量和纯度(表1)；
3.发酵液通过碟式离心机和陶瓷膜(孔径为200nm)除杂，获得清液；
4.将1.3步所获得清液先通过陶瓷超滤膜(2000Da)收集清液；
5.将1.4所获得清液再通过陶瓷超滤膜(500Da)后收集浓液，即截留得到 500～1500Da分子量的产物；
6.将1.5中截留浓液通过调节等电点pH＝6.3，管式离心机离心(转速16000rpm)获得沉淀物；
7.将1.6所得沉淀物按照1:5(1g溶质：5ml溶剂)溶于去离子水(pH＝7.0～7.5)中，重复步骤1.6，目的是洗涤去除杂质，得到离心沉淀物，即为腺苷七肽纯品；
8.腺苷七肽离心沉淀物通过冷冻干燥(-80℃～-55℃，真空度<10Pa)，获得腺苷七肽纯品粉末，纯度大于90％，产量可达20～30kg/天。
表1不同培养基对腺苷七肽产量和纯度的影响
#：常规MRS为北京奥博星生物技术有限责任公司生产的MRS培养基(货号 02-293)
*：改良MRS为专利CN201911127892.0所述培养基，检测方法采用高效液相色谱法，参照CN201911127892.0方法
**：纯度的测定采用峰面积归一化法，参考《中华人民共和国兽药典》(2015 版二部附录51)
二、腺苷七肽的结构鉴定
上述样品用去离子水溶解成4mg/ml，备用。采用蛋白质测序仪进行Edman降 解法N-末端氨基酸进行序列测定，送检样品测定10个循环，组分实测结果见表2， 常规MRS和改良MRS样品的实测结果为多序列共存，序列1为MATGNAD，对应 目标肽序列，序列2和3为目标肽N-末端降解1～2个氨基酸组分。本专利培养基样 品的实测序列与理论序列一致，串联质谱碎片离子鉴定总得分为331(表3)，序 列覆盖率为100％(图1)，送检样品全长序列被鉴定为MATGNAD，N-末端发生 甲酰化修饰(Formyl(N-term))，C-末端发生单磷酸腺苷修饰，且单磷酸腺苷 进一步发生氨丙基修饰(Nucleotide(C-term))(图2)。串联质谱碎片离子 良好，结果可靠。实测序列与理论序列一致，送检样品被成功鉴定为目标肽。
表2送检样品N-末端Edman测序结果
/：含量低，且受其他组分干扰，影响氨基酸色谱峰判读。
表3本专利培养基送检样品序列匹配结果(ESI-MS/MS)
三、腺苷七肽体外降低LPS活性
将LPS溶于磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH＝7.2～7.4)中，LPS浓度为60μg/mL， 同样将腺苷七肽溶于磷酸盐缓冲液，配制浓度为0、20、60、100、200μg/mL， 然后按照1：1混合，则LPS的终浓度为30μg/mL，腺苷七肽终浓度为0、10、30、 50、100μg/mL，涡旋仪震荡1min，4℃静置30min，采用试剂盒(BioLegend)对 LPS含量进行测定(μg/mL)。结果表明，随着腺苷七肽浓度的增加，检测到的 LPS含量越低，说明其随着腺苷七肽含量增高，降低LPS的效果约明显，其中 50μg/mL的腺苷七肽中和率高达75.7％(图3)。
四、腺苷七肽降低LPS攻毒小鼠的炎症反应
1.动物模型构建及实验分组：160只18～22g SPF级昆明小鼠(购自北京维通 利华实验动物技术有限公司)，雌雄各半。正常饲养3d后，随机分为8组(每组 20只)，对照组腹腔注射0.5mL生理盐水，其他7组腹腔注射0.5mL LPS (1mg/mL)。6h后，对照组饲喂基础日粮，其他7组分别饲喂有0、0.5、1.0、2.0 和4.0mg/kg的腺苷七肽以及1.0和2.0mg/kg体重的多粘菌素(阳性干预组)，喂 饲7天后进行检测。
2.炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10)表达量测定：每组小鼠中随机选取5 只，放血处死，剖开腹腔，迅速取出小肠，生理盐水冲洗干净后，截取3cm空 肠，并迅速在预冷PBS(pH＝7.4)中研磨匀浆，匀浆液3,000rpm离心15min， 取上清液待测。样品按试剂盒(IL-1β、TNF-α、IL-10ELISA试剂盒，厦门慧嘉 生物科技有限公司)方法进行测定。图4结果表明，LPS攻毒后，小鼠肠道的IL-1β 及TNF-α水平显著升高(P<0.01)，IL-10的含量显著降低(P<0.01)。经过 治疗后，4.0mg/kg腺苷七肽组和2.0mg/kg多粘菌素组的IL-1β含量比阴性对照 组显著下降(P<0.01)。0.5mg腺苷七肽不能降低小鼠肠道TNF-α含量，而 1.0、2.0和4.0mg/kg腺苷七肽以及两个多粘菌素治疗组小鼠肠道内TNF-α水平 与LPS模型组相比均显著降低(P<0.05)。1.0、2.0和4.0mg/kg腺苷七肽处 理组中小鼠肠道内IL-10的含量与LPS模型组相比均显著升高(P<0.05)。2.0 mg/kg多粘菌素治疗组小鼠肠道内IL-10的含量与阴性对照组相比显著升高(P< 0.05)。
3.小鼠肠道NF-κB(P65)和iNOS的表达检测：每组小鼠中随机选取10只， 放血处死，剖开腹腔，迅速取出小肠，生理盐水冲洗干净后，截取3cm空肠， 在含有蛋白酶抑制剂的PBS(pH＝7.4)中研磨匀浆，匀浆液3,000g离心15min。 上清液放置于离心管，加入裂解液B(20mM HEPES，pH＝7.9；0.4M NaCl；1 mM EDTA；1mM EGTA；1mM DTT；1mM PMSF)，4℃条件下剧烈震荡5min， 4℃条件12,000rpm下离心5min后，-80℃保存。按美国Cell Signaling试剂盒 方法进行Western Blot，检测NF-κB(P65)表达量和iNOS表达量。图5结果表 明，LPS攻毒后，肠道内NF-κB(P65)和iNOS表达量显著升高(P<0.01)。 经过四个不同剂量腺苷七肽治疗后，与模型组相比，小鼠肠道内NF-κB(P65) 和iNOS的表达量均显著下降(P<0.05)。同样，两个多粘菌素剂量治疗组NF-κB (P65)和iNOS的表达量与阴性对照组相比均显著下降(P<0.05)。腺苷七肽 与多粘菌素对iNOS的抑制作用没有差异，1.0mg/kg以上治疗剂量的腺苷七肽对 NF-κB(P65)的抑制作用显著强于多粘菌素。
以上实验结果表明，腺苷七肽可阻断LPS诱导的炎症信号通路NF-κB(P65) 和炎症诱导因子iNOS，减少促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，增加抑炎因子 IL-10的表达，从而减少炎症反应发生。
序列表
<110> 安杰利（重庆）生物科技有限公司
<120> 一种约氏乳杆菌及其制备的腺苷七肽、制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 7
<212> protein
<213> 人工序列
<220> 腺苷七肽氨基酸序列
<400> 1
1MATGNAD7
