一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用

一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其应用。

　　背景技术

　　上个世纪，工作模式的急剧变化、交通的改善、缺乏体育活动、生活方式的显著改变以及伴随全球化而来的垃圾食品导致了全世界糖尿病发病率的急剧增加。根据JAMA杂志发布中国糖尿病流行病学最新数据，结果显示，成人糖尿病患病率为10.9％(95％CI，10.4％～11.5％)糖尿病前期比例也高达35.7％(95％CI，34.1％～37.4％)。此外，根据相关报道显示(http://www.bjd.com.cn/a/201911/09/WS5dc627d7e4b0621d5c14d277.html)，所有糖尿病患者中，仅有36.5％的人已知自己患有糖尿病，32.2％的人正在接受治疗。在接受治疗的患者中，仅有不到一半(49.2％)的人血糖得到有效控制(HbA1c<7％)，糖尿病防治仍任重道远。

　　糖尿病是一种以血葡萄糖水平慢性增高为特征的慢性代谢性疾病，它会引起各种严重的健康并发症，如冠状动脉及周围血管疾病、中风、糖尿病神经病变、截肢、癌症、肾功能衰竭、致残失明、预期寿命缩短和巨大的健康成本。2型糖尿病(diabetes mellitus type2，T2DM)，原名为成人发病型糖尿病，多在35～40岁之后发病，是最常见的糖尿病。该类糖尿病通过体重控制和体育锻炼可以改善血糖脂质代谢进而降低风险，然而，在大多数情况下必须使用一种或多种药物才能有效管理T2DM。大多数治疗T2DM的策略可分为四类:1)胰岛素分泌促进剂通过增加细胞内钙离子浓度来触发胰岛素分泌或刺激细胞分泌胰岛素；2)降低胰岛素抵抗，增强胰岛素作用，在不增加血浆胰岛素水平的情况下降低高血糖；3)抑制肝脏产糖；4)抑制葡萄糖摄取，减慢膳食对葡萄糖的吸收。糖尿病是一种终身疾病，需要长期的医疗管理，因此有必要进行广泛的研究来探索更有效和更安全的药物。

　　α-葡萄糖苷酶是参与碳水化合物消化的关键酶，这种酶的抑制剂可以减缓可吸收的单糖从饮食中的复杂碳水化合物中释放出来，这种作用机制可以使血糖水平降低，但这种降糖机制有一定的毒副作用以及不能被人体很好的吸收等不足，因此，研究高效低毒的抑制剂仍然是一道难题。

　　香豆素是一种特殊的骨架，存在于许多天然和合成的生物活性分子中，具有广泛的药物应用，包括抗氧化、抗炎、抗凝血、抗菌、抗癌、抗艾滋病毒和抗血脂异常活性。查尔酮即α,β-不饱和酮是天然有机分子中重要的结构形式之一，也是合成多种天然物和药物的重要有机中间体，查尔酮及其衍生物是芳香醛酮发生交叉羟醛缩合的产物，其化学名为1,3-二苯基丙烯酮。查尔酮类化合物广泛存在于自然界中，以它为母体的化合物存在于甘草、红花等多种天然植物体中。由于其分子机构具有较大的柔性，能与不同的受体结合，因此具有广泛的生物药理活性，如：抗肿瘤、抑制和清除氧自由基、抗菌、抗病毒、抗溃疡和解痉挛等生物药理活性。

　　香豆素-查尔酮类衍生物，由于其独特的可塑性结构，近年来已引起科研工作者的浓厚研究兴趣。中国发明专利申请文件CN109293616A公开了一种含香豆素查尔酮类衍生物、其制备方法及应用，具体公开了该类化合物可应用于抑制水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌等植物细菌活性等作用。中国发明专利文件CN102516235B公开了一种含香豆素骨架的二苯并噻吩类查尔酮及其合成方法与应用，并具体公开了该类化合物具有良好的紫外吸收和荧光发射性能，可用于发光器件的制作。然而，尚未有将其应用于抑制葡萄糖苷酶中的相关报道。

　　发明内容

　　本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种利用香豆素-查尔酮类衍生物制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

　　本发明还提出上述抑制剂的应用。

　　根据本发明实施例的第一方面实施例的α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂包括如下结构式的化合物：

　　其中，R选自噻吩基、吲哚基、取代或未取代苯基。

　　根据本发明的一些实施例，所述取代是指基团上的氢原子被选自以下组中的一个或多个取代基取代：烷基、烷氧基、硫醚基、卤素、卤代烷基；优选地，所述取代基选自以下组中的一个或多个：甲基、甲氧基、硫甲基、氟、氯、溴或三氟甲基。

　　根据本发明的一些实施例，所述取代苯基中的取代为单取代或多取代。

　　根据本发明的一些实施例，所述R选自以下组中的一个或多个：

　　

　　根据本发明实施例的α-葡萄糖苷酶抑制剂，至少具有如下有益效果：本发明方案巧妙地利用骨架拼接原理，将靶点不同的香豆素和查尔酮活性单元的拼接，使得其既可增强药效，也可提高药物与靶位作用的选择性；该抑制剂的活性成分不仅毒性低，而且能够有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有良好的潜在医疗保健价值。

　　根据本发明的第二方面实施例的应用，将上述抑制剂应用于保健品、药物或药物前体的制备中。

　　根据本发明的一些实施例，所述保健品为膳食补充剂或降糖食品。

　　根据本发明的一些实施例，所述药物或药物前体为防治Ⅱ型糖尿病的药物或药物前体。

　　根据本发明的一些实施例，所述药物的剂型选自经胃肠道给药剂型或注射给药剂型。

　　根据本发明的一些实施例，所述药物的制备中还包含将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂与药学上可接受的辅料混合的步骤。

　　根据本发明的一些实施例，所述辅料选自以下组中的一个或多个：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

　　根据本发明第二方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明方案的抑制剂对α-葡萄糖苷酶表现出显著的抑制活性，可达阿卡波糖的10倍以上。

　　本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

　　附图说明

　　图1为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3j在体外对α-葡萄糖苷酶的浓度-抑制率关系曲线图；

　　图2为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3q在体外对α-葡萄糖苷酶的浓度-抑制率关系曲线图；

　　图3为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3t在体外对α-葡萄糖苷酶的浓度-抑制率关系曲线图；

　　图4为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3j在体外对α-葡萄糖苷酶的酶动力学图；

　　图5为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3q在体外对α-葡萄糖苷酶的酶动力学图；

　　图6为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3t在体外对α-葡萄糖苷酶的酶动力学图；

　　图7为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3j在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学双倒数图；

　　图8为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3j在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学斜率-浓度关系曲线图；

　　图9为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3j在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学截矩-浓度关系曲线图；

　　图10为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3q在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学双倒数图；

　　图11为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3q在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学斜率-浓度关系曲线图；

　　图12为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3q在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学截矩-浓度关系曲线图；

　　图13为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3t在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学双倒数图；

　　图14为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3t在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学斜率-浓度关系曲线图；

　　图15为本发明实施例中香豆素-查尔酮衍生物3t在体外对α-葡萄糖苷酶的底物动力学截矩-浓度关系曲线图。

　　具体实施方式

　　为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

　　本发明方案的抑制剂的活性成分均为香豆素-查尔酮衍生物，其可以通过以下步骤制备而得：以3-乙酰基香豆素(1)为原料，与醛类化合物(2)在哌啶(piperidine)溶液与冰醋酸(glacial acetic acid)溶液体积比例为2:1的碱性条件下，以无水乙醇(EtOH)为溶剂，发生醛酮缩合反应，反应时长为3-20h(优选为18～20h)，生成目标产物香豆素-查尔酮衍生物(3)，其反应原理如下式所示：

　　

　　本发明的实施例一为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂的活性成分为3-肉桂酰-香豆素(3-cinnamoyl-2H-chromen-2-one)，其结构式如下：(标记为3a)。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为产率为51.7％，制得的产品呈黄色固体状，通过核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),7.92(dd,J＝40,20Hz,2H),7.71-7.65(m,4H),7.44-7.39(m,4H),7.35(t,J＝8,7.5Hz,1H).

　　本发明的实施例二为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-((对甲苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(p-tolyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3b。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为45.9％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.58(s,1H),7.84(dd,J＝20,15Hz,2H),7.69-7.62(m,4H),7.39(d,J＝5Hz,1H),7.35(td,J＝7.5,1Hz,1H),6.93(dt,J＝10,3Hz,2H),3.85(s,3H).

　　本发明的实施例三为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(2-苯甲醚基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(2-methoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3c。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为47.7％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.56(s,1H),8.22(d,J＝15Hz,1H),7.98(d,J＝15Hz,1H),7.73-7.62(m,3H),7.42-7.32(m,3H),6.99(t,J＝10,10Hz,1H),6.93(d,J＝10Hz,1H),3.92(s,3H).

　　本发明的实施例四为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(3-苯甲醚基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(3-methoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3d。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为42.1％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(s,1H),7.93(d,J＝20Hz,1H),7.71-7.65(m,2H),7.41(d,J＝5Hz,1H),7.39-7.31(m,2H),7.28(d,J＝10Hz,1H),7.19(t,J＝5,2Hz,1H),6.97(ddd,J＝8,2.5,1Hz,1H),3.86(s,3H).

　　本发明的实施例五为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(4-苯甲醚基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(4-methoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3e。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为49.7％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.58(s,1H),7.88(dd,J＝30,15Hz,2H),7.69-7.64(m,2H),7.58(d,J＝10Hz,2H),7.40(d,J＝10Hz,1H),7.35(t,J＝10,5Hz,1H),7.22(d,J＝10Hz,2H),2.39(s,3H).

　　本发明的实施例六为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(4-苯甲硫醚基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(4-(methylthio)phenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3f。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为55.2％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(s,1H),7.87(dd,J＝40,20Hz,2H),7.70-7.64(m,2H),7.61-7.57(m,2H),7.40(d,J＝10Hz,1H),7.35(td,J＝10,1.5Hz,1H),7.24(d,J＝10Hz,2H),2.52(s,3H).

　　本发明的实施例七为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(2-氟苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(2-fluorophenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3g。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为45％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),8.01(dd,J＝30,15Hz,2H),7.74(t,J＝10,10Hz,1H),7.71-7.65(m,2H),7.42-7.34(m,3H),7.19(t,J＝10,10Hz,1H),7.12(t,J＝10,10Hz,1H).

　　本发明的实施例八为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(3-氟苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(3-fluorophenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3h。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为45.3％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.95(d,J＝20Hz,1H),7.81(d,J＝15Hz,1H),7.71-7.66(m,2H),7.45-7.36(m,5H),7.19(tdd,J＝8.2,2.6,1Hz,1H).

　　本发明的实施例九为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(4-氟苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(4-fluorophenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3i。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为44.9％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.90(d,J＝20Hz,1H),7.84(d,J＝20Hz,1H),7.71-7.65(m,4H),7.41(d,J＝10Hz,1H),7.37(td,J＝8.1,0.4Hz,1H),7.14-7.08(m,2H).

　　本发明的实施例十为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(2，4-二氟苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(2,4-difluorophenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3j。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为44.7％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.96(d,J＝15Hz,2H),7.78-7.71(m,1H),7.71-7.65(m,2H),7.41(d,J＝10Hz,1H),7.39-7.35(m,1H),6.98-6.92(m,1H),6.91-6.84(m,1H).

　　本发明的实施例十一为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(3，4-二氟苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(3,4-difluorophenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3k。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为47.3％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.64(s,1H),7.91(d,J＝15Hz,1H),7.78(d,J＝15Hz,1H),7.70(dd,J＝10,5Hz,1H),7.56-7.50(m,1H),7.45-7.38(m,4H),7.23(dt,J＝10,10Hz,1H).

　　本发明的实施例十二为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-(3-(2-三氟甲基)苯基)丙烯酰)-香豆素((E)-3-(3-(2-(trifluoromethyl)phenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one)，标记为3l。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为49.8％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.94(dd,J＝10,5Hz,2H),7.74-7.58(m,4H),7.53-7.48(m,1H),7.45-7.34(m,3H).

　　本发明的实施例十三为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-(3-(间-三氟甲基)苯基)丙烯酰)-香豆素(3-[3-(m-trifluoromethylphenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3m。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为49.9％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.86(dd,J＝10,5Hz,3H),7.71-7.65(m,3H),7.57-7.53(m,1H),7.44-7.34(m,3H).

　　本发明的实施例十四为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-(3-(对-三氟甲基)苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(p-trifluoromethylphenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3n。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为41.4％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.86(d,J＝15Hz,1H),7.78(d,J＝10Hz,2H),7.72-7.65(m,3H),7.44-7.36(m,3H).

　　本发明的实施例十五为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(2-氯苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(2-chlorophenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3o。

　　本发明的实施例十六为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(3-氯苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(3-chlorophenyl)]acrylocoumarin)，标记为3p。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为46.4％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.95(d,J＝15Hz,1H),7.78(d,J＝15Hz,1H),7.71-7.64(m,3H),7.55(d,J＝10Hz,1H),7.43-7.34(m,4H).

　　本发明的实施例十七为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(4-氯苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(4-chlorophenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3q。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为45％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.93(d,J＝15Hz,1H),7.81(d,J＝15Hz,1H),7.70-7.65(m,2H),7.63(dt,J＝8.5,2.5Hz,2H),7.42-7.34(m,4H).

　　本发明的实施例十八为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(2-溴苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(2-Bromophenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3r。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为40.8％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),8.24(d,J＝15Hz,1H),7.90(d,J＝15Hz,1H),7.83(dd,J＝10,5Hz,1H),7.72-7.66(m,2H),7.63(dd,J＝10,5Hz,1H),7.41(d,J＝10Hz,1H),7.39-7.34(m,2H),7.28-7.22(m,1H).

　　本发明的实施例十九为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(3-溴苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(3-Bromophenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3s。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为41.8％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.94(d,J＝15Hz,1H),7.82-7.75(m,2H),7.70-7.65(m,2H),7.59(d,J＝10Hz,1H),7.53(ddd,J＝3,1.5,1Hz,1H),7.43-7.35(m,2H),7.29(t,J＝10,10Hz,1H).

　　本发明的实施例二十为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(4-溴苯基)丙烯酰香豆素(3-[3-(4-Bromophenyl)]acryloylcoumarin)，标记为3t。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为44.5％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.95(d,J＝15Hz,1H),7.79(d,J＝15Hz,1H),7.70-7.65(m,2H),7.54(s,4H),7.41(d,J＝10Hz,1H),7.36(td,J＝5,1Hz,1H).

　　本发明的实施例二十一为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为(E)-3-3-噻吩-丙烯酰香豆素(E)-3-(3-(thiophen-2-yl)acryloyl)-2H-chromen-2-one，标记为3u。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为51.7％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),7.92(dd,J＝40,20Hz,2H),7.71-7.65(m,4H),7.44-7.39(m,4H),7.35(t,J＝8,7.5Hz,1H).

　　本发明的实施例二十二为：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其活性成分为3-3-(2-甲基吲哚)丙烯酰香豆素(3-[3-(indole-2-methyl)]acryloylcoumarin)，标记为3v。

　　参照上述步骤制备而得，式中，R为其产率为40.7％；制得的产品呈黄色固体状，通过NMR表征其结构，结果如下：1H NMR(500MHz,DMSO)δ12.00(s,1H),8.68(s,1H),8.01(d,J＝15Hz,1H),8.10-8.04(m,2H),7.98(td,J＝10,3.5Hz,2H),7.78-7.73(m,1H),7.69(d,J＝15Hz,1H),7.54-7.49(m,2H),7.44(td,J＝10,1.5Hz,1H),7.30-7.22(m,2H).

　　性能测试：

　　一、取上述化合物测试其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果：

　　1.1试剂与标准溶液的配制

　　(1)100mM pH 6.8的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)的配制：分别取17.907 g的磷酸氢二钠和6.804 g的磷酸二氢钾混合溶解，然后加去离子水定容至1L，用pH计测定pH值。

　　(2)香豆素-查尔酮系列衍生物溶液的配制：称取一定量的香豆素-查尔酮系列衍生物加到二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液当中进行溶解，制得浓度为10mM的母液，然后根据所需浓度用100mM pH 6.8的磷酸缓冲液进行稀释，实验当中DMSO的终浓度不超过5％。

　　(3)对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)溶液的配制：准确称取0.006025g pNPG溶解于20mL的pH 6.8PBS中充分溶解，即得1mM的pNPG母液。

　　(4)α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶活力为100U的酶加适量100mM PBS配成工作浓度分别为0.0375U/mL、0.05U/mL、0.0625U/mL、0.075U/mL并分装冷冻。

　　阿卡波糖(Acarbose)溶液的配制：准确称取阿卡波糖0.06456g，置于10mL容量瓶中，然后用100mM pH 6.8PBS溶液定容至刻度，即得到10mM的母液。

　　1.2实验步骤

　　(1)在37℃的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 6.8)条件下，使用α-葡萄糖苷酶和pNPG对香豆素衍生物的α-葡萄糖苷酶抑制作用进行了测定。将化合物溶解在DMSO中以制备所需的各种浓度。将PBS中的酶(最终浓度为0.1U/mL)与各种浓度的测试化合物在37℃下孵育10分钟，然后添加pNPG(最终浓度为0.25mM)。在37℃下进一步温育30分钟后，用酶标仪在405nm下测量吸光度。阿卡波糖用作阳性样品。所有实验均进行三次测定。

　　(2)待测化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性根据如下公式计算：

　　抑制率抑制率(％)＝[(OD1-OD0)/OD0]×100％

　　其中，OD1和OD0分别代表实验组和空白组的吸光度值，数据处理：使用MS Excel分析处理数据，并用Origin 9.1计算得到半数抑制浓度(IC50)，IC50代表在所述实验条件下，α-葡萄糖苷酶的活性被抑制50％时所需待测化合物的浓度。

　　1.3结果分析

　　应用体外酶学实验对合成得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性评价，结果表明，大多数衍生物均表现出优异的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值在间，阳性对照药阿卡波糖IC50为259.90±1.06μM。化合物3j、3q和3t的浓度-抑制率关系曲线如图1～3所示，部分化合物详细数据结果如下表1所示：

　　表1

　　

　　

　　a测试化合物的抑制率在100μM低于50％.

　　b值为三次独立实验结果的mean±S.

　　从上表1可以看出，本发明方案的抑制效果均远强于阿卡波糖及苯甲醛(benzaldehyde)、3-乙酰基香豆素(3-Acetylcoumarin)，其中，化合物3j、3q和3t的抑制效果最好，其IC50值分别是30.30±2.53μM、29.74±2.68μM、24.09±2.36μM，表明这些小分子化合物在与α-葡萄糖苷酶相互作用时表现出较强的结合亲和力。由此可以推知，香豆素-查尔酮结构对此类型化合物具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性有着重要作用。

　　二、采用体外酶动力学实验对合成得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性动力学评价。

　　2.1试剂与标准溶液的配制

　　(1)100mM pH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)的配制：分别取17.907g的磷酸氢二钠和6.804g的磷酸二氢钾混合溶解，然后加去离子水定容至1L，用pH计测定pH值。

　　(2)香豆素-查尔酮系列衍生物溶液的配制：称取一定量的香豆素-查尔酮系列衍生物加到二甲基亚砜(DMSO)溶液当中进行溶解，制得浓度为10mM的母液，然后根据所需浓度用100mM pH 6.8的磷酸缓冲液进行稀释，实验当中DMSO的终浓度不超过5％。

　　(3)pNPG溶液的配制：准确称取0.006025g pNPG溶解于20mL的pH 6.8PBS中充分溶解，即得1mM的pNPG母液。

　　α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶活力为100U的酶加适量100mM PBS配成工作浓度分别为0.0375U/mL、0.05U/mL、0.0625U/mL、0.075U/mL并分装冷冻。

　　阿卡波糖溶液的配制：准确称取阿卡波糖0.06456g，置于10mL容量瓶中，然后用100mM pH 6.8 PBS溶液定容至刻度，即得到10mM的母液。

　　2.2实验步骤

　　(1)通过测定系列酶促反应速率(V)与α-葡萄糖苷酶的关系图，以确定抑制的类型。将不同浓度的10μLα-葡萄糖苷酶溶液(0.075U/mL，0.1U/mL，0.125U/mL，0.15U/mL终浓度)和磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 6.8，130μL)添加到96孔板，其次，加入衍生物3j 10μL(0、25、30和40μM，终浓度)，最后，加入0.25mM pNPG(终浓度)作为底物，在37℃引发酶反应，在吸光度405nm下测量30分钟的吸光度变化。空白对照组用10μL含量等于5％的DMSO来替换10μL化合物，用阿卡波糖作为阳性对照，每组平行设置4个复孔。

　　(2)数据处理：使用MS Excel，Origin9.1分析处理数据，酶反应体系的反应速率为△OD/min。

　　2.3结果分析

　　通常根据抑制剂的类型，酶抑制剂可分为可逆抑制剂和不可逆抑制剂。不可逆抑制：在相同的抑制剂浓度下，酶浓度增加曲线的斜率不变，不同抑制剂浓度曲线相互平行。相反，可逆抑制剂被定义为多条曲线相交于原点。为了获得酶抑制剂与酶结合的原理，有必要研究酶抑制剂与酶的相互作用。选择有着最低IC50的化合物3j3q和3t进行抑制动力学的研究，酶反应速率(V)vsα-glucosidase生成一系列曲线。以3j为例分析，在不同浓度的3j存在下，改变酶的浓度，通过绘制不同浓度下剩余酶活性相对于酶的直线，结果如图4～6所示。从图4～6中可以看出，所有的直线都有良好的线性关系，都经过原点。此外，随着3j浓度的增加，直线的斜率逐渐减小。显然，3j的存在并没有改变酶的数量，而是降低了酶的活性。上面的结果清楚地表明，香豆素衍生物的抑制机制α-glucosidase是可逆的。从图4～6可以看出，3q和3t属于类似于3j的可逆抑制机理。

　　三、采用体外底物动力学实验对合成得到的活性化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性动力学评价。

　　3.1试剂与标准溶液的配制

　　(1)100mM pH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)的配制：分别取17.907g的磷酸氢二钠和6.804g的磷酸二氢钾混合溶解，然后加去离子水定容至1L，用pH计测定pH值。

　　(2)香豆素-查尔酮系列衍生物溶液的配制：称取一定量的香豆素-查尔酮系列衍生物加到二甲基亚砜(DMSO)溶液当中进行溶解，制得浓度为10mM的母液，然后根据所需浓度用100mM pH 6.8的磷酸缓冲液进行稀释，实验当中DMSO的终浓度不超过5％。

　　(3)pNPG溶液的配制：准确称取0.006025g pNPG溶解于20mL的pH 6.8 PBS中充分溶解，即得1mM的pNPG母液。

　　α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶活力为100U的酶加适量100mM PBS配成工作浓度分别为0.0375U/mL、0.05U/mL、0.0625U/mL、0.075U/mL并分装冷冻。

　　阿卡波糖溶液的配制：准确称取阿卡波糖0.06456g，置于10mL容量瓶中，然后用100mM pH 6.8 PBS溶液定容至刻度，即得到10mM的母液。

　　3.2实验步骤(1)研究衍生物对α-葡萄糖苷酶的抑制方式：将10μL(0.1U/mL，终浓度)的α-葡萄糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 6.8，130μL)添加到96孔板中，其次是加入衍生物3j 10μL(0、25、30和40μM，工作浓度)，最后，加入不同浓度的pNPG10μL(0.25mM，0.5mM，0.75mM，1mM，工作浓度)作为底物，在37℃引发酶反应，使用酶标仪在405nm下测定吸光度。通过使用双倒数图获得抑制剂的抑制模式，并且通过衍生物浓度[I]对斜率的二次图获得常数Ki，通过衍生物浓度[I]对截留率的二次图获得常数Kis。

　　(3)数据处理：使用MS Excel，Origin9.1分析处理数据，酶反应体系的反应速率为△OD/min。

　　3.3结果分析

　　本次采用Lineweaver-Burk直线来判断，象限内直线相交为混合抑制，平行或不相交为反竞争抑制，Y轴上直线相交为竞争抑制，X轴上直线相交为非竞争抑制。因此，需要用α-glucosidase Lineweaver-Burk做双倒数图来研究最有效的化合物的抑制模式。以3j为例，随着3j浓度的增大，直线的斜率趋于增大。所有的直线相交于第二象限的一点，说明此抑制类型为混合型抑制。对于3q和3t，从图中可以看出，这两个化合物也具有与3j相同的抑制类型。底物动力学抑制类型评价实验测定结果如图7～15所示。由图7～15可以看出，筛选得到的抑制剂为混合性抑制剂。表明其不仅可以和α-葡萄糖苷酶结合，而且还可以和α-葡萄糖苷酶-底物复合物结合。同时，根据图7～15可以得知，化合物3d、3f、3i抑制常数KI分别为11.02、16.48、18.82。

　　四、采用分子对接(Molecular docking)的方法分析活性化合物3d、3f、3i与α-葡萄糖苷酶的相互作用规律。

　　为阐明筛选得到的抑制剂3d、3f、3i与α-葡萄糖苷酶可能存在的相互结合模式及作用位点，采用分子对接的方法来探讨三者与α-葡萄糖苷酶的相互作用规律。α-葡萄糖苷酶由一个亚基构成。在对接实验中，分析分子对接结果，根据其对接打分确定，认为化合物与α-葡萄糖苷酶对接打分最高的构象，结合自由能最低，即为最优势构象，并对其作进一步分析。结果表明，小分子抑制剂与α-葡萄糖苷酶之间所形成的氢键、范德华力等作用力的存在对于维系蛋白受体-配体复合物构象的稳定发挥着非常重要作用。

　　以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。