一种化合物精氨酸双糖苷AFG的合成新方法
技术领域
本发明属于有机化合物合成制备的技术领域，涉及一种化合物精氨酸双糖苷AFG的合成新方法。具体涉及化合物精氨酸双糖苷(Arginyl-fructosyl-glucose，AFG)的合成新方法及应用，具体以丙二醇和乙醇混合液为反应媒介并采用有机试剂沉淀获得AFG的合成新方法。
背景技术
人参为传统名贵药材，在《神农本草经》中被列为上品。AFG(Arginyl-fructosyl-glucose，C18H34N4O12)是红参加工过程中，鲜人参在烘干阶段发生美拉德反应的中间产物[1]。鲜人参在加工为红参过程中，麦芽糖与精氨酸发生羰醛缩和反应，经Amadori重排而生成。Yukio Suzuki等建立红参加工中褐变产生与AFG之间的关系，结果表明精氨酸和糖量的增加都能加速褐变的程度[2,3]。赵晶等研究了不同加热时间对红参AF和AFG含量的影响，指出：随着预热时间的加长，AF和AFG的含量会呈现上升趋势[4]。在以往的文献中记载AFG合成方法为：以无水冰乙酸或丙三醇为反应媒介，精氨酸和麦芽糖质量比为1:2或1:4，80℃反应30～180min，合成率仅约为15～28％[5,6]。
但是，以冰醋酸为媒介的粗合成物具有强烈刺激性酸味；以甘油(丙三醇)为媒介的产物不仅精氨酸残留量大，且合成液粘稠度大，流动性差，不易于后续无水丙酮沉淀和洗涤。因此，寻找一种产物合成率高、纯度高、精氨酸残留量低、无刺激性气味、生产成本低、简单易行的合成方法是很有必要的。
目前，该化合物的制备现有技术如下：
CN201110038843.7，公布一种AFG的制备方法，通过将精氨酸与麦芽糖置入冰醋酸中，加入美拉德反应抑制剂(亚硫酸钠)，反应10～120min得总反应物；将总合成物低压浓缩，冷冻干燥得到AFG。
CN201410637060.4，公布一种AFG的合成方法，即精氨酸与麦芽糖在无水丙三醇中加入酸性物质柠檬酸，加热20～100℃发生美拉德反应，生成AFG。
CN201510511005.5，公布一种快速分离、纯化人参AFG的方法，涉及精氨酸与麦芽糖在无水丙三醇中加入柠檬酸，加热使其发生美拉德反应，合成得到AFG。
通过上述现有合成AFG的工艺可知，现有合成工艺的特点及其主要缺点，如下表所示：
表1.不同AFG合成工艺的特点及优缺点对比
由上述表1中现有合成方法可知，对AFG的合成方法通常是以冰醋酸或丙三醇为反应媒介。(1)以亚硫酸钠及冰醋酸为催化剂和反应媒介的不足之处明显，亚硫酸钠受高热分解产生有毒的硫化物烟气，冰醋酸挥发产生刺激性气体；(2)丙三醇黏度较大，流动性差，后续丙酮沉淀和洗涤次数增加，增加成本，且产物不易于分离；(2)丙三醇吸水性强，极易吸潮，产物中少许丙三醇残留会使加速产物吸潮，稳定性降低。
而本发明使用柠檬酸为催化剂及以丙二醇乙醇混合液为反应媒介可充分弥补了现有合成方法的不足，本发明充分利用丙二醇黏度小、流动性强和稳定性优于丙三醇等特点，通过多次试验结果表明以丙二醇乙醇混合液为反应媒介不仅粗合成率大幅度提高，产物纯度增加，其操作简单，且节约成本，产物稳定性良好。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种化合物精氨酸双糖苷AFG的合成新方法，为一种新的制备方法：精氨酸和麦芽糖与“丙二醇/乙醇混合液”为反应媒介，“柠檬酸”为催化剂，加热和混匀条件下合成AFG。另外，由于AFG是一种非常容易变质的物质，反应后的后处理对于获得高收率和高纯度产物也至关重要。本发明具有操作简易，产物粗合成率高，合成物精氨酸残留量少，成本低，产物刺激性小和稳定性高等特点。
具体地，本发明通过以下技术方案来实现：
一种化合物精氨酸双糖苷AFG的合成新方法，包括：
以丙二醇乙醇混合液为反应媒介合成AFG：将精氨酸、麦芽糖和柠檬酸置于丙二醇和乙醇混合液中，混匀后加热生成AFG，具体方法包括：
将精氨酸和麦芽糖以1:(2～4)的重量比例置入10～20倍体积(以精氨酸质量计，g/mL)的丙二醇和乙醇混合液中，再加入柠檬酸为催化剂，20～100℃加热30～150min，有机试剂洗涤，真空抽滤，低温干燥得AFG。
作为本发明的一种优选技术方案，精氨酸：麦芽糖：柠檬酸以1:2:0.75的重量比加入丙二醇乙醇混合液中进行反应。
作为本发明的一种优选技术方案，丙二醇与乙醇混合液乙醇体积占比为5-20％。
作为本发明的一种优选技术方案，精氨酸按照10.0g计时、麦芽糖按照20.0g计时和柠檬酸按照7.5g计时，优选丙二醇乙醇混合液的使用量为100mL。
作为本发明的一种优选技术方案，加热温度为80℃，时间为100～120min。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的有机试剂选自丙酮，其中丙二醇与乙醇混合液和丙酮的体积比为1：(10～15)。
通过大量的实验研究发现，AFG可与高浓度有机试剂产生沉淀，得沉淀物。特别是，丙酮与反应溶液能较好的互溶，且目标产物AFG在多种溶剂中发生可逆反应，优选得到丙酮。
作为本发明的一种优选技术方案，洗涤次数为2～3次，可将丙二醇洗净。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的丙二醇选自1,2-丙二醇或1,3丙二醇，所述乙醇为无水乙醇。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的丙二醇为食品级。
本发明进一步提供了AFG产物在药品和保健品中进行应用，所述AFG产物通过前述的制备方法制得。
作为本发明的一种优选技术方案，将AFG作为活性成分或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，制成保健品或制药中可接受的任何剂型，选自片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，颗粒剂和贴剂。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
本发明中，首次使用丙二醇与乙醇混合液为反应媒介合成AFG的方法，粗合成率可达到80％以上，AFG纯度达81～83％，同时降低了AFG的生产成本，且粗合成物无刺激性气味，反应所用柠檬酸为常用食品添加剂，安全可靠。
以丙二醇为反应媒介，制备物中精氨酸残留量少，丙二醇黏性小，流动性好，易于后续沉淀及减少洗脱次数，产物粗合成率得到大幅度提升，降低了生产成本，且丙二醇吸水性较丙三醇弱，产物稳定性增加。
更为重要的是，丙二醇为化妆品、牙膏和香皂中常用的润滑剂，在制药工业也较为常用，对人体均无伤害，乙醇挥发性好，产物中无残留，增加了AFG粗合成物的使用安全性，加速了其在工业生产中的应用。本发明优选所述的丙二醇为食品级1,2-丙二醇或1,3-丙二醇，二者的反应速率相当。
附图说明：
附图1：美拉德反应路线示意图；
附图2：丙二醇乙醇混合液反应组中AFG含量测定示意图。
参考文献
[1]郑毅男,孟祥颖,张晶,等.红参中新化合物精氨酸苷的生成机理及生成条件的研究[J].中国药物化学杂志,1997,7(3):217～220.
[2]Yukio Suzuki,Kang-Ju Choi,Kei Uchida,et al.Effects of thePreheating Treatments of Raw Ginseng in the Model System on the Synthesis ofthe Maillard Type-Browning Reaction Products of Red Ginseng[J].J Ginseng Res,2004,3(28):136～142.
[3]Yukio Suzuki,Kang-Ju Choi,Kei Uchida,et al.Arginyl-fructosyl-glucose and Arginyl-fructose,Compounds Related to Browning Reaction in theModel System of Steaming and Heat-drying Processes for the Preparation of RedGinseng[J].J Ginseng Res,2004,3(28):143～148.
[4]赵晶,长城,徐钰琳,等.不同预热时间对红参中AF、AFG含量的影响[J].现代农业科技,2010(08):364+366.
[5]刘丽敏.西洋参中L-精氨酸及其衍生物的研究[D].吉林农业大学,2008.
[6]郑毅男,孟祥颖,张晶,等.红参中新化合物精氨酸苷的生成机理及生成条件的研究[J].中国药物化学杂志.1997,7(3):217～220.
具体实施方式
本发明和附图将通过以下方式实验来解释本发明，但本发明不局限于此。
实验例一、反应媒介丙二醇与乙醇比例对合成AFG的影响
丙二醇与乙醇比例对AFG制备的影响
1.1按比例精氨酸：葡萄糖：柠檬酸以1:2:0.75的重量置入不同比例的反应媒介(丙二醇与乙醇混合液)中进行反应，通过调控丙二醇与乙醇的比例，得到合成物，称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
1.2精密称取(10.g精氨酸+20.0g葡萄糖+7.5g柠檬酸)5份，分别置于100mL反应媒介中(其中乙醇使用量分别为：0ml，5mL，10mL，15mL和20mL，混匀条件下依次加热至80℃，反应时间为120min，反应液经洗涤、抽滤、低温干燥，即得，通过称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
实验例二、丙酮洗涤对合成AFG的影响
丙酮洗涤次数及用量对合成AFG的影响
2.1按比例精氨酸：麦芽糖：柠檬酸以1:2:0.75的重量置入10倍量的反应媒介(乙醇占比为10％)中进行反应，通过调控丙酮洗涤次数及用量，得到合成物，称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
2.2精密称取(10.g精氨酸+20.0g麦芽糖+7.5g柠檬酸)5份，均置于100mL的反应媒介(乙醇占比为10％)中，混匀条件下依次用丙酮洗脱1次、2次、3次、4次、5次，每次300mL，反应时间为120min，反应液经抽滤、低温干燥，即得，通过称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
实验例三、丙二醇合成AFG的最佳工艺条件
合成温度和时间的AFG制备的影响
3.1按比例精氨酸：麦芽糖：柠檬酸以1:2:0.75的重量置入10倍量的反应媒介(乙醇占比为10％)中进行反应，通过调控温度及时间，得到合成物，称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
3.2精密称取(10.g精氨酸+20.0g麦芽糖+7.5g柠檬酸)5份，均置于100mL反应媒介(乙醇占比为10％)中，混匀条件下依次加热至20℃、40℃、60℃、80℃、100℃，反应时间为30min，反应液经洗涤、抽滤、低温干燥，即得，通过称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
3.3精密称取(10.g精氨酸+20.0g麦芽糖+7.5g柠檬酸)7份，均置于100mL反应媒介(乙醇占比为10％)中，混匀条件下依次加反应20min、40min、60min、80min、100min、120min和150min，加热至反应温度为80℃，反应液经洗涤、抽滤、低温干燥，即得，通过称量计算粗得率和用糖衍生法检测AFG纯度。
4.AFG粗合成中精氨酸的检测
4.1检测方法：运用柱前衍生高效液相色谱法进行检测检测1.1，1.2及1.3粗合成物中精氨酸残留量。
4.2精氨酸标准品制备：精密称取分析级精氨酸10.0mg，加色谱级甲醇定容至10mL，即浓度为1mg/mL；备用。
4.3样品制备：每组分别精密称取50.0mg，按照氨基酸衍生法进行衍生检测。
4.4色谱条件：Venusil--AA氨基酸分析专用柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相A:乙酸钠缓冲溶液-乙腈溶液(pH＝6.5)；流动相B:乙腈水溶液V(乙腈):V(水)＝4：1。0min，0％B；4min，3％B；16min，10％B；17min，20％B；32min，34％B；30min；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温40；进样量20μL。
实施例1
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL无水丙二醇(不添加乙醇)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，每次300mL，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为60.6％，AFG纯度为72.1％。
实施例2
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL反应媒介(5mL乙醇与95mL丙二醇混合液)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，每次300mL，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为80.2％，AFG纯度为74.5％。
实施例3
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL反应媒介(10mL乙醇与90mL丙二醇混合液)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，每次300mL，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为82.6％，AFG纯度为84.1％。反应路线如图1所示，AFG的HPLC谱图如图2所示。
实施例4
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL反应媒介(15mL乙醇与85mL丙二醇混合液)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，每次300mL，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为73.0％，AFG纯度为73.6％。
实施例5
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL反应媒介(20mL乙醇与80mL丙二醇混合液)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，每次300mL，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为70.4％，AFG纯度为71.5％。
实施例6
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于20℃恒温水浴摇床中，反应30min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均产物得率为13.5％，AFG纯度为5.3％。
实施例7
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于40℃恒温水浴摇床中，反应30min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为19.1％，AFG纯度为8.6％。
实施例8
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于60℃恒温水浴摇床中，反应30min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为53.8％，AFG纯度为18.1％。
实施例9
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应30min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为61.5％，AFG纯度为32.4％。
实施例10
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于100℃恒温水浴摇床中，反应30min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为58.4％，AFG纯度为33.5％。
实施例11
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应20min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为23.0％，AFG纯度为28.0％。
实施例12
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应40min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为37.4％，AFG纯度为45.3％。
实施例13
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应60min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为66.7％，AFG纯度为61.9％。
实施例14
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应80min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为73.4％，AFG纯度为72.3％。
实施例15
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应100min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为82.2％，AFG纯度为82.4％。
实施例16
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为79.4％，AFG纯度为80.1％。
实施例17
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，均置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应150min，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为76.4％，AFG纯度为75.6％。
实施例18
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤1次，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为83.5％，AFG纯度为80.6％。
实施例19
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤2次，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为82.3％，AFG纯度为83.8％。
实施例20
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤3次，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为82.1％，AFG纯度为85.3％。
实施例21
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤4次，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为80.3％，AFG纯度为85.3％。
实施例22
精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙二醇与乙醇混合液(乙醇体积占比为10％)中，混匀后置于80℃恒温水浴摇床中，反应120min，反应液用丙酮洗涤5次，粗合成物低温干燥后称量，重复试验3次，均得率为80.1％，AFG纯度为85.3％。
根据上述实施例，结果由表1可见：通过对反应媒介丙二醇与乙醇比例的调控合成AFG，实验结果表明，当反应媒介比例为乙醇比例为10％时反应时产物得率及纯度能达到最理想状态。
表1.不同比例丙二醇与乙醇对影响AFG合成的统计表
由表1可知，10％乙醇参与反应即可时得率及纯度达到最高，且经济适用。
根据上述实施例，结果由表2可见：通过对时间及温度的调控来合成AFG，实验结果表明，当温度为80℃，时间为100min时合成物的得率最高，且AFG的纯度达到最大。
表2.不同时间及温度对影响AFG合成的统计表
由表2可知，通过控制变量法分别调控时间及温度，得到AFG的最佳合成温度为80℃，时间为100min。
根据上述实施例，结果由表3可见：通过控制丙酮洗涤次数及用量可得出合成AFG用丙酮洗涤次数为2-3次。
表3.不同丙酮洗涤影响AFG合成的统计表
由表3可知，通过控制丙酮洗的次数及用量，得到AFG的最佳丙酮洗涤次数为3次。
对比实验例一、AFG的合成
按照前述优选制备条件，使用不同媒介合成AFG
D1.1按比例精氨酸：麦芽糖：柠檬酸以1：2：0.75的重量置入10倍量的以下媒介中进行反应，反应液经丙酮沉淀，并洗涤2～3次，低温干燥得到合成物，称量计算粗得率和AFG纯度。
D1.1.1按上述比例精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL冰醋酸中，混匀条件下加热至80℃，反应100min，反应液经丙酮沉淀洗脱，抽滤，低温干燥即得粗合成物，重复试验3次，计算产物均得率及AFG纯度。
D1.1.2精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL无水丙三醇中，混匀条件下加热至80℃，反应100min，反应液经丙酮沉淀洗脱，抽滤，低温干燥即得粗合成物，重复试验3次，计算产物均得率及AFG纯度。
D1.1.3精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL无水丙二醇与乙醇混合液中，混匀条件下加热至80℃，反应100min，反应液经丙酮沉淀洗脱，抽滤，低温干燥即得粗合成物，重复试验3次，计算产物均得率及AFG纯度。
D1.1.4精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL无水丙二醇，混匀条件下加热至80℃，反应100min，反应液经丙酮沉淀洗脱，抽滤，低温干燥即得粗合成物，重复试验3次，计算产物均得率及AFG纯度。
D1.1.5精确称量10.0g精氨酸、20.0g麦芽糖和7.5g柠檬酸，置于100mL丙醇中，混匀条件下加热至80℃，反应100min，反应液经丙酮沉淀洗脱，抽滤，低温干燥即得粗合成物，重复试验3次，计算产物均得率及AFG纯度。
结果见表4：冰醋酸组及丙三醇组与丙二醇组比产物得率、AFG纯度均较低；且冰醋酸组及丙三醇组精氨酸残留量明显高于丙二醇组，丙醇组反应无沉淀产生，不能进行反应。
通过上述试验结果，并结合试验过程可总结得出不同反应媒介对合成AFG得率、ARG残留量的影响及优缺点。
表4.不同媒介合成AFG工艺的特点对比
由表4可以总结出，以丙二醇与乙醇混合液为反应媒介，并在特定的反应条件下可极大促进麦芽糖与精氨酸的反应，不仅提升产物得率和AFG纯度，有效降低精氨酸的残留量，且降低反应难度，有效减少洗脱时丙酮的用量，增加产物稳定性。以丙醇作为反应溶剂，因其沸点与反应所用温度接近，反应时易挥发，不能完成反应，无沉淀产生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
