一种米曲霉菌株及包含其发酵产物的用于改善皮肤状态的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年02月22日提交的韩国专利申请第10-2019-0020897号的优先权和权益，其通过引用合并于此用于所有目的，如同在此完全阐述一样。
技术领域
本发明涉及一种包含米曲霉菌株及其发酵产物的用于改善皮肤的组合物。
背景技术
角质可以起到保护皮肤免受水分的蒸发并防止异物从外部进入的作用。健康角质层的水分含量约为20％，此时皮肤湿润、结实，看起来光泽健康。随着时间的推移，当老化的角质层不脱落并其水分含量降低至15％以下时，皮肤变得干裂粗糙。随着年龄的增长，角质细胞不迅速脱落且不循环，皮肤变得暗沉并老化加速，导致皮肤粗糙。另一方面，通过用毛巾强力擦拭来去除皮肤角质的方法存在损坏正常角质层、削弱角质层功能、引起皮肤刺激和炎症的问题。因此，应该正确、适当地去除旧的角质，以便新的角质细胞可以从皮肤基底层的细胞中分化而变成健康的皮肤。
皮脂由皮脂腺产生，通过毛孔释放。并且皮脂通过在皮肤表面形成脂肪膜来起到抗菌作用，具有保护皮肤免受紫外线和外部刺激等的各种功能。然而，当皮脂过度分泌或积聚于毛孔时，其会与角质、化妆污垢、灰尘等缠结在一起，并缠结的皮脂堆积被氧化成棕色或黑色而变成“黑头(black head)”。如此形成的黑头将毛孔变得更宽更深，使皮肤看起来不干净。通过用机器或工具去除黑头或皮脂的物理方法和如α羟基酸(AHA)或β羟基酸(BHA)的化学方法表现出直接效果的方法广泛用于化妆品工业中。然而，由于这些方法产生严重的刺激，因此引起皮肤灼热、搔痒、皮肤红斑等的副作用，从而存在皮肤状态可能恶化的问题。
用于化妆品工业的菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶是作为植物来源的蛋白酶用于去除角质的高浓度纯化酶。然而，当以有效的高浓度使用时，可能引起皮肤刺激和过敏反应(Caroline Stremnitzer et al.,2015,Gunjan M.Modi et al.,2009)。当与高浓度蛋白酶一起使用时，脂肪酶(Lipase)也具有增加皮肤刺激和经皮水分流失率(TEWL,Transepidermal water loss)的问题(P.H.Andersen et al.,1993)。由于上述问题，所述酶用于使用后立即洗涤的洁面组合物，而不用于皮肤剂型，但因此存在的问题是酶去除角质或皮脂的效果不明显。
发明内容
本发明一方面提供一种具有蛋白酶活性的米曲霉(Aspergillus oryzae)Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)。
本发明另一方面提供一种由米曲霉菌株发酵的发酵产物。
本发明另一方面提供一种包含由米曲霉菌株或由其发酵的发酵产物的用于改善皮肤状态的组合物。
本发明另一方面提供一种发酵酶剂的制备方法，所述方法包括：培养米曲霉菌株；以及将培养后得到的菌体培养液接种于谷物并发酵。
本发明另一方面提供一种包含由米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)发酵的发酵产物的组合物在制备用于改善皮肤状态的化妆品组合物中的用途。
本发明另一方面提供一种包含由米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)发酵的发酵产物的组合物在制备用于改善皮肤状态的药物组合物中的用途。
本发明一方面提供一种具有蛋白酶活性的米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)。
所述“米曲霉”是一种真菌，可以从谷物分离。所述谷物的种类没有限制，但例如，可以是曲霉。所述菌株可以是通过纯分离培养将曲霉样品接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基而培养的菌落的方法来分离的菌株。所述菌株可以从食物、土壤、海洋等中分离。此外，所述菌株不仅具有脂肪酶活性和/或蛋白酶活性，而且与同种的米曲霉KCCM 11372和黑曲霉(KCCM11239)相比还具有高蛋白酶活性。另外，所述菌株可以包括具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的16S rDNA基因。
本发明另一方面提供一种由米曲霉菌株发酵的发酵产物。本发明另一方面还提供一种由米曲霉菌株发酵的发酵酶剂。
本说明书中的术语“发酵产物”是指通过将微生物添加于包括大米的谷物而发酵来制备的。在一具体实施例中，所述微生物可以是米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)。
本说明书中的术语“发酵酶剂”是指加速或减缓发酵的酶，并且是指催化反应速率的蛋白质，使得复杂的有机物质在酶的存在下分解成简单的其他有机物质。即，本发明的发酵酶剂可以在粉碎由米曲霉菌株生产的酶后制成制剂。所述酶可以是脂肪酶和/或蛋白酶。所述米曲霉菌株的具体内容如上所述。在根据一具体实施例的发酵产物或发酵酶剂中，所述菌株可以是米曲霉Enz-5(保藏号：KCCM12426P)，并且可以包括具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的16SrDNA基因。所述发酵可以是固体发酵。
本说明书中的术语“固体发酵(Solid-state fermentation,SSF)”是指通过将微生物接种于具有低水分的固体状态的谷物来进行的发酵，因为污染菌的生长受到低水分活度的限制，所以固体发酵不会像液体发酵那样造成严重污染。所述固体发酵中的温度、水分含量和通气量可以作为影响酶表达的因素。当固体发酵所述米曲霉菌株时，可以表达胞外酶(extracellular enzyme)，例如，当所述菌株的生长条件恶化时，由于真菌形成用于生存的孢子并将表达的酶包含在孢子中，因此存在胞外酶的活性相对低于菌丝时的活性的问题。因此，为了通过尽可能地延迟形成孢子来最大化酶活性，有必要优化米曲霉菌株的生长条件。
本发明另一方面提供一种包含由米曲霉菌株发酵的发酵产物的用于改善皮肤状态的组合物。本发明另一方面还提供一种包含由米曲霉菌株发酵的发酵酶剂的用于改善皮肤状态的组合物。在一具体实施例中，所述组合物可进一步包含所述菌株的培养液。所述培养液可以是，例如，通过培养所述菌株而获得的培养液本身、其浓缩物或其冻结干燥物，也可以是通过从培养液中去除菌株而获得的培养上清液、其浓缩物或冻结干燥物。另外，所述培养液可以是通过在马铃薯琼脂培养基中在高于5℃但低于40℃的温度下培养米曲霉Enz-5菌株一段时间，例如10小时至80小时，而获得的。在一具体实施例中，菌株的培养上清液可以通过离心分离或过滤菌株培养液来去除菌株的步骤获得。在另一具体实施例中，浓缩物可以通过离心分离或过滤培养液本身或所述培养液并浓缩所得上清液而获得。用于培养所述米曲霉Enz-5菌株的培养基和培养条件可以由本领域普通技术人员适当选择或变更使用。
所述米曲霉菌株的具体内容如上所述。在根据一实施例的组合物中，所述菌株可以是米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)。如上所述，所述米曲霉Ezn-5菌株的特征在于具有脂肪酶活性和/或蛋白酶活性，因此由所述菌株发酵的发酵产物或发酵酶剂；以及包含所述发酵产物或发酵酶剂的化妆品组合物可以表现出诸如去除皮肤角质、去除皮脂和减少皮肤表面上的油分含量等的效果。
所述改善皮肤状况可以是去除皮肤角质、去除皮脂(例如黑头和/或白头)、改善毛孔堵塞症状、减小毛孔大小、或预防和减少痤疮。由所述米曲霉菌株发酵的发酵产物或发酵酶剂具有优异的去除角质和/或去除皮脂效果，因此包含所述发酵产物或发酵酶剂的组合物可用于去除皮肤角质、去除皮脂、改善毛孔堵塞症状、减小毛孔大小、或预防和减少痤疮的组合物。
在根据一具体实施例的组合物中，基于组合物的总重量，所述发酵产物或发酵酶剂可以包括0.1％至5％、例如，0.1％至5％、0.1％至4.8％、0.1％至4.5％、0.1％至4.3％、0.1％至4％、0.5％至5％、0.5％至4.5％、0.5％至4％、0.5％至3.5％、0.5％至3％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、1.5％至5％、1.5％至4.5％、或2％至3％。
根据一具体实施例的组合物可以包括所述发酵产物或发酵酶剂作为有效量或作为有效成分。所述有效量可以根据个体来适当选择。所述有效量可以根据包括以下项的因素以及在生理至医学领域中熟知的其他因素来决定：疾病和疾病状况的严重程度、个体的年龄、体重、健康、性别、个体的对酶剂的敏感度、施用时间、施用途径和排出比率、施用期间、与所述组合物配合或同时使用的其他组合物。
根据一具体实施例的用于改善皮肤状态的组合物可以是化妆品、食物或药物组合物。因此，所述组合物还可以包括在化妆品学上、食物学上或药学上可接受的赋形剂或载体。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素或其组合。所述崩解剂可以是淀粉乙醇酸钠、无水磷酸氢钙或其组合。所述结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石或其组合。
所述组合物的制剂类型可以是非口服施用剂型。非口服施用剂型可以是注射剂或皮肤外用剂。皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。
所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂等。
所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。
根据一实施例的组合物可以是化妆品组合物。在这种情况下，培养液可制备为包括以下的剂型：化妆水(润肤液)、柔肤水、爽肤水、收敛剂(Astringent)、乳液、牛奶润肤露(milk lotion)、保湿乳液、营养液、按摩霜、营养霜、保湿霜、手霜、粉底、精华、营养精华、膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳液、身体清洁液、悬浮液、凝胶、粉末、粘膏(paste)、面膜或片装面膜或喷雾组合物。可根据本领域常规方法制备此类剂型的组合物。所述化妆品组合物可以进一步包括保存剂、稳定剂、表面活性剂、溶剂、保湿剂、润肤剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机和无机颜料、香料、冷感剂或止汗剂。在不损害本发明的目的和效果的范围内，本领域技术人员可以容易地选择诸如上述保湿剂等的附加成分的混合量，该混合量可以是基于组合物的总重量的0.001％至5％，具体而言，0.01％至3％。
根据一具体实施例的组合物可以是食物组合物。在这种情况下，可以制备成本领域已知的常规保健食物的剂型。所述食物组合物可以制备为如散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮液、油剂、糖浆剂、浸渍剂、液剂、萃取剂等的一般剂型，并制备为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、比萨饼、拉面、其他面类、口香糖类、果冻、包括冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料和维生素复合物的等任意的保健食物形式。为了将所述保健食物制成制剂，可以使用食物学上可接受的载体或添加剂，并且本领域已知的任何载体或添加剂可以用于制备想要制备的制剂。作为所述添加剂，可以含有各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，所述添加剂可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些添加剂成分可以单独使用或组合使用，添加剂的比例可以为基于组合物的总重量的0.001％至5％，具体地，0.01％至3％。
所述食物组合物中的所述培养液的含量可以根据使用目的(预防或改善)来适当地决定。通常，可以包括食物总重量的0.01％至15％，当作为饮料制造时，以100mL为基准，可以含有0.02g至10g的比例，具体地，0.3g至1g的比例。
所述饮料可以进一步包括所述提取物之外的其他成分，并且可以进一步包括通常用于饮料的各种香料或天然碳水化合物等。所述天然碳水化合物可以含有如单糖类(例如葡萄糖、果糖等)、二糖类(例如麦芽糖、蔗糖等)、多糖类(例如糊精、环式糊精等)的常规糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。另外，香料可以含有天然香料(例如:奇异果甜蛋白(Thaumatin)、甜叶菊提取物等)及合成香料(例如:糖精、阿斯巴甜等)。
所述天然碳水化合物的比例通常为每100mL饮料约1g至20g，具体地，约5g至12g。
根据一具体实施例的组合物可以是药物组合物。具体而言，所述药物组合物可以是用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物。所述皮肤疾病可以是皮脂囊肿、脂溢性皮炎、毛囊角化症等。在一实施例中，已确认所述组合物可以改善如毛囊角化症、皮肤角质、黑头和/或白头、毛孔堵塞等的皮肤状态。因此，所述药物组合物可以通过有效地去除皮肤角质、黑头和/或白头来预防或治疗皮脂囊肿、脂溢性皮炎、毛囊角化症、毛孔堵塞等。
另一方面提供包括将所述组合物施用于个体的步骤的改善个体皮肤状态或预防或治疗皮肤疾病的方法。所述组合物与上述相同。
术语“施用的”、"导入的"及“移植的”可互换使用，并可以指实现根据一具体实施例的组合物的至所需的部位的至少部分局部化的方法或根据路径的至个体内的根据一实施例的组合物的布置。根据一实施例的组合物的培养液或培养液成分的至少一部分可通过任何传送至活体中的期望位置的合适途径来施用。
施用是可通过本领域已知的任何方法来执行。施用可以通过例如静脉内、肌肉内、口服、经皮(transdermal)、粘膜、鼻内(intranasal)、气管内或皮下施用的途径，以任意方式直接向个体执行。所述施用可以对全身或局部执行。
所述个体可以是哺乳动物，例如:人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以是需要改善皮肤美容效果的个体，例如皮肤屏障增强、皮肤保湿、皮肤细胞再生、皮肤活力增加、抗氧化、抗炎或抗特应性。
所述施用可以是每天将由米曲霉菌株发酵的发酵产物或发酵酶剂按照以下量施用于每个个体：0.1mg至1000mg，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。然而，施用量可以根据诸如制剂方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度及反应灵敏性等的因素来不同地处方，本领域技术人员将理解，可以考虑这些因素以适当调整施用量。施用次数可以是每天1次或在临床上可接受的副作用范围内2次或以上，关于施用部位，可以对一处或两处以上施用，并且每天或每2天至5天为间隔的总施用天数可以是在一次治疗时施用1天至30天。如有需要，可在适当的时间后重复相同的治疗。对于除人以外的动物，可以以每kg施用量与人相同的施用量来施用，或者以目标动物与人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等换算所述施用量的量来施用。
本发明另一方面提供一种发酵酶剂的制备方法，所述方法包括：培养米曲霉菌株；以及将培养后得到的菌体培养液接种于谷物并发酵以制备发酵产物。
所述米曲霉菌株的具体内容如上所述。在根据一具体实施例的方法中，所述菌株可以是米曲霉Enz-5菌株(保藏号：KCCM12426P)。
根据一具体实施例的方法包括培养米曲霉菌株的步骤。所述培养可以是在初始水分含量为20％至70％的培养基中进行的培养。所述初始水分含量可以是例如20％至70％、20％至60％、20％至50％、30％至70％、40％至70％或40％至50％。此时，当初始水分含量小于所述范围时，存在促进形成菌株孢子而导致蛋白酶活性降低的问题；当初始水分含量大于所述范围时，存在菌株之间的空气循环减少而导致菌株的生长减慢并由其他微生物引起污染的问题。
根据一具体实施例的方法包括将培养所述菌株而获得的菌体培养液接种于谷物并发酵以制备发酵产物的步骤。所述发酵可以是固体发酵。所述固体发酵可以在20℃至40℃下进行。所述发酵温度可以是例如20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、25℃至40℃、25℃至35℃或30℃至35℃。此时，当发酵温度低于所述范围时，存在菌株的生长速度减慢而导致污染和/或生产性降低的问题；当发酵温度高于所述范围时，存在菌株的生长受到抑制而导致酶的表达降低的问题。所述固体发酵可以进行50小时至70小时。所述发酵时间可以是例如50小时至70小时、50小时至65小时、50小时至60小时、55小时至70小时或55小时至65小时。此时，当发酵时间小于所述范围时，存在酶没有充分表达而导致生产性降低的问题；当发酵时间大于所述范围时，存在孢子在菌株中形成时产生的酶被捕集到孢子中而导致酶活性降低的问题。另外，可以进行所述固体发酵以具有0.05vvm至0.5vvm的通气量。所述通气量可以是例如0.05vvm至0.5vvm、0.05vvm至0.4vvm、0.05vvm至0.3vvm、0.1vvm至0.5vvm、0.2vvm至0.5vvm或0.3vvm至0.45vvm。此时，当通气量小于所述范围时，存在随着作为绝对好氧菌株的米曲霉Enz-5菌株的生长，二氧化碳增加并所需的氧量不足而抑制生长，导致生产性降低或污染可能性增加的问题；当通气量大于所述范围时，存在发酵产物中的水分含量急剧减少而导致菌株的生长受到抑制和/或酶的表达减少的问题。此外，所述方法进一步包括干燥通过将所述发酵产物与无菌水混合并提取来制备的酶液的步骤。
附图说明
被包括以提供对本发明的进一步理解并且被并入且构成本说明书的一部分的附图例示本发明的示例性实施例，并且与说明书一起用于解释本发明构思。
图1是显示在含有脱脂乳(skim milk)的培养基中培养候选菌株后具有蛋白水解活性的菌株的照片，其中所述候选菌株是在来自传统曲霉的形态学上归类为真菌的菌株。
图2是显示根据初始水分含量和发酵时间的米曲霉Enz-5的蛋白酶活性的图表。
图3是显示在初始水含量50％和发酵时间66小时的条件下根据通气量的米曲霉Enz-5的蛋白酶活性的图表。
图4是比较米曲霉Enz-5及其他真菌之间的蛋白酶活性的图表。
图5是显示在发酵之前和之后确认米曲霉Enz-5固体发酵产物的脂肪酶活性的结果。
图6是显示在将添加复合酶剂粉末的面膜施用于脸部后的去除角质程度的图(a)和图表(b)。
图7是显示在将添加复合酶剂粉末的面膜施用于脸部后的黑头、白头和毛孔的大小变化的照片。
具体实施方式
在下文中，将提供本发明的优选实施例以便于理解本发明。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
【实施例】
实施例1：米曲霉菌株的分离、种属鉴定及培养
1-1、米曲霉菌株的分离及种属鉴定
将购自济州岛的传统曲霉10g用0.85％氯化钠溶液适当地连续稀释，然后在添加氯霉素(chloramphenicol)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Himedia，India，M1942)上涂抹，并且在30℃下培养60小时。然后，选择外观呈真菌形态的菌株。将所选的菌株接种于由蒸牛奶1％、氯化钠2％、蛋白胨2％和琼脂2％组成的脱脂乳琼脂平板(pH7.0)，然后在30℃下培养48小时，最终选择降解性能最大的菌株。
委托韩国种菌协会附属的韩国微生物保藏中心对最终选择的菌株进行种属鉴定，并分析了内转录间隔区(ITS)-5.8S 16SrDNA核苷酸序列。结果发现，最终选择的菌株与米曲霉具有99.9％的同一性。将所述分离的菌株，即米曲霉Enz-5于2019年1月11日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12426P。
1-2、米曲霉Enz-5菌株的培养
为了确认从所述实施例1-1中分离的米曲霉Enz-5菌株的培养条件，将最佳生长温度设定为5℃至40℃(以5℃的间隔)以确定最佳培养温度。并且，为了确认生长培养基，通过使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Difco，美国)在30℃下培养5天来确认。结果,可以确认所述菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中在30℃下培养72小时时具有最高活性。
实施例2：用米曲霉Enz-5菌株制备固体发酵产物及酶粉末
2-1、根据固体发酵产物的制备、初始水分和通气量确认酶表达的最佳条件
用从所述实施例1-1中分离的米曲霉Enz-5制备固体发酵产物。具体而言，将大米的平均水分含量校正为40％至50％，并在121℃下灭菌30分钟。然后，将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养的米曲霉Enz-5接种于由孢子悬浮液制备而冷却的大米，并在33℃的温度和75％至85％的湿度下固体发酵60小时至65小时。此时，为了确认所述菌株的最佳酶表达条件，将初始水分含量设定为30％、40％、50％和60％。
图1是显示在含有脱脂乳(skim milk)的培养基中培养候选菌株后具有蛋白水解活性的菌株的照片，其中所述候选菌株是来自传统曲霉的形态学上归类为真菌的菌株。通常，具有蛋白酶活性的菌株在培养过程中降解脱脂乳以形成透明圈(clear zone)。如图1所示，根据一实施例的米曲霉Enz-5在含有脱脂乳的培养基中形成最大的透明圈，因此与其他菌株相比具有优异的蛋白酶活性。
图2是显示根据初始水分含量和发酵时间的米曲霉Enz-5的蛋白酶活性的图表。如图2所示，当初始水分含量为50％时，可以确认所述菌株的蛋白酶活性最优异。具体地，通过将初始水分含量设定为50％、将发酵时间设定为66小时、将通气量分别设定为0vvm、0.05vvm、0.1vvm和1vvm来比较蛋白酶活性。此时，1vvm是指在1L或1kg的培养基中供应1L空气1分钟。
图3是显示在初始水含量50％和发酵时间66小时的条件下根据通气量的米曲霉Enz-5的蛋白酶活性的图表。如图3所示，当通气量为0.05至0.5时，可以确认蛋白酶活性优异。
2-2、复合酶粉末的制备
在所述实施例2-1中确认的最佳酶产生条件下(初始水分为50％、通气量为0.05vvm至0.5vvm和发酵时间为66小时)以1:10的质量比混合固体发酵的大米和无菌水，并在4℃和250rpm的条件下搅拌提取60分钟。然后，通过0.45μm的膜过滤(membranefiltration)来制备酶液。在冻结干燥所制备的酶液后，与赋形剂混合以制备复合酶粉末。
实施例3：添加复合酶粉末的面膜剂型的制备
制备添加在所述实施例2-2中制备的复合酶粉末的面膜剂型。通过常规方法根据下表1的组成和含量制备面膜剂型。
[表1]
[实验例]
蛋白酶定量分析
通过在福林反应(Folin's reaction)中用比色法测定酸溶性低分子降解产物的量来确定蛋白酶活性，其中所述酸溶性低分子降解产物在蛋白酶作用于干酪素时因肽键的裂解而增加。其单位将酶量定义为1个单位，其中所述酶量显示在根据操作法的条件测试时相当于每分钟1μg酪氨酸的福林试剂呈色物质的增加。此时，在所述实施例2-1中确认的初始水分含量为50％、通气量为0.05-0.5vvm和发酵时间为66小时的条件下测量米曲霉Enz-5、比较例1和比较例2的蛋白酶活性。
具体地，根据以下方法进行在所述实施例1的常规固体发酵条件下培养的米曲霉Enz-5的粗酶液、米曲霉KCCM 11372(比较例1)及黑曲霉KCCM 11239(比较例2)的蛋白酶定量分析。
首先，将添加氯化钠的柠檬酸缓冲液(citric acid buffer)30ml添加于所述实施例2-1的固体发酵产物3g，并在室温下提取1小时。然后，将所提取的提取液以4000rpm离心分离20分钟，使用0.45μm针头过滤器(syringe filter)过滤上清液而得到米曲霉Enz-5粗酶提取液。稀释所得到的米曲霉Enz-5粗酶液。此时，当酶的活性未知时，通过适当地反应每种稀释液来选择包括在酪氨酸参考范围内的稀释倍数。此后，将所述粗酶液0.5ml和McIlvaine缓冲液(pH6.0)1ml放入玻璃试管中并在40℃下预热5分钟。此时，将底物溶液放入另一个试管中并在40℃下预热5分钟。然后，每隔一定时间(10秒或20秒间隔)向所预热的粗酶液加入底物溶液1.5ml并立即混合。将所述粗酶液和底物溶液混合物在40℃±0.5下反应60分钟，然后当反应时间恰好为60分钟时，通过添加反应终止液(0.4M TCA溶液，三氯乙酸(Trichloroacetic acid))3ml来终止反应。所述混合物的最终体积为5ml，可以确认在添加反应终止液后立即出现白色沉淀。用瓦特曼纸(Whatman paper)#2过滤终止反应的溶液，并将滤液1ml转移到试管中。此后，依次添加所述滤液1ml、0.4M碳酸钠溶液5ml和苯酚试剂1ml并混合，在40℃下反应30分钟后，使用吸光度计在660nm处确认显色反应。
另一方面，在比较例1和比较例2中，将粗酶液和底物混合物以与上述相同的方式反应。此时，容量为粗酶液0.5ml、McIlvaine缓冲液(pH6.0)1ml、0.4M TCA3ml和底物溶液1.5ml。然后，以与上述相同的方式获得滤液并确认显色反应。
图4是比较米曲霉Enz-5、比较例1和比较例2的蛋白酶活性的图表。如图4所示，与米曲霉KCCM 11372(比较例1)和黑曲霉KCCM 11239(比较例2)相比，可以确认米曲霉Enz-5的蛋白酶活性显着更高。即，根据一方面的米曲霉Enz-5在所述实施例2-1中确认的水分、发酵时间和通气量的条件下具有优异的蛋白酶表达，所以包含用所述菌株发酵的发酵产物的化妆品组合物具有优异的去除角质或皮脂的效果。
脂肪酶的定性分析
为了进行在最佳的酶产生条件下培养的所述实施例2-1的米曲霉Enz-5固体发酵产物的脂肪酶的定性分析，在所述实施例2-1的固体发酵产物10g中加入无菌水100ml，以250rpm提取30分钟，然后用0.45μm膜过滤而得到滤液。随后，根据
图5是显示在发酵之前和之后确认米曲霉Enz-5固体发酵产物的脂肪酶活性的结果。如图5所示，由于底物被发酵后产生的酶降解，附着于底物的染料着色，因此可以确认米曲霉Enz-5的脂肪酶活性。即，由于根据一方面的米曲霉Enz-5具有脂肪酶活性，因此包含由所述菌株发酵的发酵产物的化妆品组合物具有去除皮肤表面的油分的优异效果。
确认皮肤刺激
确认所述实施例2-2中制备的复合酶粉末的皮肤刺激性。具体而言，将所述实施例2-2的复合酶粉末分别以0％、1％、5％和10％的浓度溶解于蒸馏水，然后分别以35μl施用于皮肤试验部位。将贴布贴在皮肤上48小时，在撕除贴布后用标记笔标记试验部位，并分别在30分钟、24小时和120小时后观察试验部位。如下表2所示，将皮肤反应的刺激程度根据国际接触性皮炎研究组(ICDRG:International Contact Dermatitis Research Group)的评估标准进行分类，结果如下表3所示。
[表2]
[表3]
结果如表3所示，当浓度为0％至5％时，反应指数均为0，平均皮肤反应度也为0；当浓度为10％时，反应指数为1，平均皮肤反应度为0.19。根据上表2，可以确认复合酶剂粉末在0％至10％的浓度下没有皮肤刺激。
确认去除角质效果
确认在所述实施例3中制备的面膜剂型的去除角质效果。具体而言，将面膜剂型敷于20岁以上的5名健康成年男女(平均年龄30.5岁)的脸上。在脸上使用面膜制型之前和之后30分钟，分别用皮肤粘度计(SV-600，德国)测量角质量。将2×2大小的胶带与皮肤接触并按压5秒钟，然后将具有角质的胶带照射于测量照相机的偏振光，并通过图像分析来测量每单位面积的角质量。
图6是显示在将添加复合酶粉末的面膜施用于脸部后的去除角质程度的图(a)和图表(b)。如图6(a)所示，可以确认在使用面膜后角质的量显着减少。另外，如量化去除角质程度的图6(b)所示，可以确认在使用面膜后角质的量显着减少75.5％。即，根据一方面的米曲霉Enz-5菌株的发酵产物可以有效地去除皮肤角质。
确认去除黑头和白头的效果
确认在所述实施例3中制备的面膜剂型的去除黑头和白头效果。具体而言，每两天一次持续四周将面膜剂型敷于20岁以上的5名健康成年男女(平均年龄30.5岁)的脸上。在脸上使用面膜制型之前、之后第2周、第4周，目视评价用数字皮肤镜(DE300，美国)测量的图像。
图7是显示在将添加复合酶剂粉末的面膜施用于脸部后的黑头、白头和毛孔的大小变化的照片。如图7所示，可以确认在使用面膜后5名受试者的毛孔大小、黑头和白头均显着减小。即，根据一方面的米曲霉Enz-5菌株的发酵产物不仅可以减小毛孔的大小，还可以有效地去除黑头和白头。
[保藏号]
保藏机构名称:韩国微生物保藏中心
保藏号：KCCM12426P
保藏日期：2019年1月11日
使用根据一方面的米曲霉Enz-5菌株的固体发酵产物不引起皮肤刺激，并且可以去除皮肤角质、黑头和白头，而没有皮肤灼热、搔痒、皮肤红斑等的副作用，从而可以用于管理皮脂和毛孔。
虽然已在此描述了某些示例性实施例和实施方式，但是根据该描述，其它实施例和修改将是明显的。因此，本发明构思不限于这些实施例，而是限于所附权利要求的更宽范围，并且对于本领域普通技术人员来说，各种显而易见的修改和等同布置将是明显的。
<110> 科丝美诗株式会社
<120> 一种米曲霉菌株及包含其发酵产物的用于改善皮肤状态的组合物
<130> PX058488CN
<150> KR 10-2019-0020897
<151> 2019-02-22
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 496
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 米曲霉Enz-5
<400> 1
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