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包含作为有效成分的多糖含量增加的绿茶提取物的组合物

2021-02-01 14:18:48

包含作为有效成分的多糖含量增加的绿茶提取物的组合物

　　技术领域

　　本说明书涉及一种具有血糖调节用途的组合物及其制备方法，所述组合物包含作为有效成分的多糖含量增加的绿茶提取物。

　　背景技术

　　血糖是指血液中所含有的葡萄糖，通过以肝脏作用为中心的各种激素的相互作用，使血液中的葡萄糖浓度被维持在适当水平。然而，近年来，由于经济增长和饮食习惯的西化，使血糖调节不能正常进行，因此如肥胖、糖尿、代谢障碍、高血压及心脏病等的生活方式病(成人疾病)的发病正在增加。尤其，当血糖异常升高的高血糖症进展并成为慢性疾病时，会对其他器官造成影响，从而导致肾脏和神经、心血管系统、视网膜等的损伤，还会导致昏厥。

　　糖尿病是与高血糖相关的代表性疾病，作为胰岛素分泌量不足或无法实现胰岛素正常功能等的代谢疾病的一种(DeFronzo，1988)，是一种因高血糖而引起各种症状及征兆，并通过尿液排出葡萄糖的疾病。诱发糖尿病的主要原因包括由于高热量、高脂肪、缺乏运动等而引起的肥胖，而肥胖会增进胰岛素抗性和糖耐量受损，会恶化如高血糖、高胰岛素血症及血脂异常的代谢障碍。

　　其中，血脂异常(dyslipidemia)是指血液中总胆固醇、LDL胆固醇及中性脂肪升高的状态或HDL胆固醇降低的状态。LDL胆固醇也被称为坏胆固醇，当LDL胆固醇值升高时，心脏病发作(Heart attack)或中风等的风险会增加，而HDL胆固醇被称为好胆固醇，当HDL胆固醇值升高时，心脏病发作或中风的风险会降低。此外，中性脂肪作为脂质的一种，高的中性脂肪值会增加心脏病发作或中风的风险。过度升高的血脂会粘附在血管壁上使血管宽度变窄，或引起血管内壁的损伤而诱发血栓，诱发动脉血管至外周血管的整个血液循环障碍而引发血管障碍。这成为动脉硬化的原因，而动脉硬化是各种血管疾病的危险因素，例如，中风等的脑血管疾病和心绞痛、心肌梗塞等的心血管疾病。如上所述，如果对慢性高血糖状态不进行适当地治疗，则在身体中会伴随多种病理症状，因此需要进行有效的血糖管理以预防这种现象。

　　目前，用于调节血糖的方法包括固定生活方式(饮食疗法，运动疗法)和药物疗法等。然而，饮食疗法或运动疗法难以严格管理和实施，并且其效果也是有限的。因此，大多数糖尿患者改进生活方式的同时，会依赖于胰岛素、胰岛素分泌促进剂、胰岛素敏感性增强剂、及降血糖剂等的药物的血糖调节。然而，随着时间的推移，需要越来越多的药物，并且有很多副作用，因此，为了预防这种现象，迫切需要研究和商品化一种源自天然产物的血糖调节药物及功能性食品，其没有毒性且糖尿病患者可以长期摄取。

　　[现有技术文献]

　　[专利文献]

　　专利文献1：韩国授权专利号KR10-0918776B1；

　　专利文献2：韩国专利公开号KR10-2015-0102326A。

　　发明内容

　　技术问题

　　在一个方面，本发明的目的在于提供一种多糖含量增加的绿茶提取物的新用途。

　　在另一个方面，本发明的目的在于提供一种包含作为有效成分的绿茶提取物的用于调节血糖的组合物。

　　在另一个方面，本发明的目的在于提供所述组合物的制备方法。

　　技术方案

　　在一个方面，本发明提供一种用于调节血糖的组合物，其包含绿茶提取物，其中，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。

　　在另一个方面，本发明提供一种所述组合物的制备方法，其包括如下步骤：通过在绿茶中添加作为第一溶剂的醇或醇的水溶液，从绿茶中去除叶绿素及低分子量多酚的第一次提取步骤；以及从所述第一次提取步骤的提取残渣中热水提取水溶性活性成分的第二次提取步骤。

　　有益效果

　　在一个方面，本发明的组合物包含绿茶提取物，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质，所述组合物不仅具有抑制葡萄糖苷酶及淀粉酶的活性的效果，还具有通过抑制小肠细胞的葡萄糖吸收来降低血糖的效果。

　　附图说明

　　图1示出了作为阳性对照组的番石榴提取物、根据本发明的一个实施例制备的绿茶提取物，即，比较实施例、实施例1及实施例2的绿茶提取物各自的α-淀粉酶活性抑制率。

　　图2示出了利用TEER(transepithelial electrical resistance，跨上皮电阻)对抑制小肠细胞吸收葡萄糖进行确认的方法。

　　图3示出了作为阳性对照组的番石榴提取物、根据本发明的一个实施例制备的绿茶提取物，即，比较实施例、实施例1及实施例2的绿茶提取物各自的对小肠细胞吸收葡萄糖的抑制率。

　　具体实施方式

　　以下，将详细描述本发明。

　　本发明的绿茶(Green tea，Thea sinensis)为属于茶科(Theaceae)的常绿乔木或灌木，在本发明中，可不受其种类及栽培天数限制地使用绿茶，并且可使用经干燥或未经干燥的绿茶。此外，在本发明中，可不受绿茶部位限制地使用绿茶，具体地，可使用绿茶叶，可使用绿茶的粉末形式或提取物形式。

　　本发明的多糖(polysaccharide)是由三个或以上的单糖通过糖苷键形成的大分子糖的统称，多糖可分为由一种类型的单糖组成的同质多糖(homopolysaccharides)和由两种或以上类型的单糖组成的杂多糖(heteropolysaccharides)。所述同质多糖包括由中性单糖组成的中性同质多糖、及由酸性单糖或具有酸性取代基的单糖组成的酸性同质多糖，所述中性同质多糖可包括淀粉(糖单位：葡萄糖)、糖原(糖单位：葡萄糖)及壳多糖(糖单位：n-乙酰葡糖胺)等，酸性同质多糖可包括果胶(糖单位：半乳糖醛酸)及硫酸卡洛宁(charonin sulfate)(糖单位：纤维素与硫酸基结合而成)等。所述杂多糖包括含有氨基糖并具有重复结构的粘多糖、糖部分因与蛋白质形成共价键而不具有重复结构的糖蛋白、及与脂质形成共价键的糖脂等。所述粘多糖可包括硫酸软骨素A(糖单位：n-乙酰半乳糖胺·葡萄糖醛酸及硫酸酯)及透明质酸(糖单位：n-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸)等。所述糖蛋白可包括血型物质(糖单位：岩藻糖·半乳糖·n-乙酰葡糖胺·n-乙酰半乳糖胺)及从血清中获得的α1-酸性糖蛋白(糖单位：岩藻糖·半乳糖·甘露糖·n-乙酰葡糖胺)等。糖脂可包括革兰氏阴性细菌的O抗原(糖单位：半乳糖·葡萄糖·甘露糖)等，此外，还可包括半乳聚糖(糖单位：半乳糖及3,6-脱水半乳糖)及海藻酸(糖单位：甘露糖醛酸及古洛糖醛酸)等。本发明的多糖可包括果胶、鼠李聚糖半乳糖醛酸I及鼠李聚糖半乳糖醛酸II等，或可为源自绿茶提取物的多糖。本发明的绿茶提取物中所包含的多糖，可占绿茶提取物总重量的7重量％或以上、7.1重量％或以上、7.2重量％或以上、7.3重量％或以上、7.4重量％或以上、7.5重量％或以上、7.6重量％或以上、7.7重量％或以上、7.8重量％或以上、7.9重量％或以上、8重量％或以上、8.1重量％或以上、8.2重量％或以上、8.3重量％或以上、8.4重量％或以上、8.5重量％或以上、8.6重量％或以上、8.7重量％或以上、8.8重量％或以上、8.9重量％或以上、9重量％或以上、9.1重量％或以上、9.2重量％或以上、9.3重量％或以上、9.4重量％或以上、9.5重量％或以上、9.6重量％或以上、9.7重量％或以上、9.8重量％或以上、或者9.9重量％或以上，具体地，可占9重量％或以上，更具体地，可占9.3重量％或以上。

　　本发明的儿茶素(polysaccharide)作为多酚的一种，是绿茶的呈现涩味的成分，本发明的儿茶素可为选自表儿茶素(epi-catechin)、表没食子儿茶素(epi-gallocatechin)、表儿茶素没食子酸酯(epi-catechin gallate)及表儿茶素没食子酸酯(epi-catechin gallate)中的一种或多种物质，并且可为源自绿茶提取物的儿茶素。此外，基于绿茶提取物的总重量，本发明的绿茶提取物中儿茶素的含量可小于20重量％、小于18重量％、小于16重量％、小于14重量％、小于12重量％、小于10重量％、小于9重量％、小于8重量％、小于7.9重量％、小于7.8重量％、小于7.7重量％、小于7.6重量％、小于7.5重量％、小于7.4重量％、小于7.3重量％、小于7.2重量％、小于7.1重量％、小于7重量％、小于6.9重量％、小于6.8重量％、小于6.7重量％、小于6.6重量％、小于6.5重量％、小于6.4重量％、小于6.3重量％、小于6.2重量％、小于6.1重量％、小于6重量％、小于5.9重量％、小于5.8重量％、小于5.7重量％、小于5.6重量％、小于5.5重量％、小于5.4重量％、小于5.3重量％、小于5.2重量％、小于5.1重量％、小于5重量％、小于4.9重量％、小于4.8重量％、小于4.7重量％、小于4.6重量％、小于4.5重量％、小于4.4重量％、小于4.3重量％、小于4.2重量％、小于4.1重量％、或小于4重量％，具体为小于6重量％，更具体为小于5.2重量％。

　　本发明的膳食纤维(dietary fiber)作为不能被人体消化酶分解的难消化性高分子纤维成分，主要分布在植物细胞的细胞壁或植物种子的表皮，并且本发明的膳食纤维可为源自绿茶提取物的膳食纤维。本发明的绿茶提取物中所包含的膳食纤维，可占绿茶提取物总重量的10重量％或以上、11重量％或以上、12重量％或以上、12.1重量％或以上、12.2重量％或以上、12.3重量％或以上、12.4重量％或以上、12.5重量％或以上、12.6重量％或以上、12.7重量％或以上、12.8重量％或以上、12.9重量％或以上、13重量％或以上、13.1重量％或以上、13.2重量％或以上、13.3重量％或以上、13.4重量％或以上、13.5重量％或以上、13.6重量％或以上、13.7重量％或以上、13.8重量％或以上、13.9重量％或以上、14重量％或以上、14.1重量％或以上、14.2重量％或以上、14.3重量％或以上、14.4重量％或以上、14.5重量％或以上、14.6重量％或以上、14.7重量％或以上、14.8重量％或以上、14.9重量％或以上、15重量％或以上、15.1重量％或以上、15.2重量％或以上、15.3重量％或以上、15.4重量％或以上、或者15.5重量％或以上，具体地，可占13重量％或以上，更具体地，可占13.6重量％或以上。

　　本发明的单糖(monosaccharide)作为碳水化合物的单体，是指用酸或酶将多糖进行水解时产生的糖类，包括葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、核糖(ribose)等，本发明的单糖可为葡萄糖或果糖，并且可为源自绿茶提取物的单糖。本发明的二糖(disaccharide)是指由两个单糖分子形成的物质，包括由一分子葡萄糖和一分子果糖结合而成的蔗糖(sucrose)、由两分子的葡萄糖结合而成的麦芽糖(maltose)、由一分子葡萄糖和一分子半乳糖结合而成的乳糖(lactose)等，本发明的二糖可为蔗糖，并且可为源自绿茶提取物的二糖。基于绿茶提取物的总重量，本发明的绿茶提取物中单糖及二糖的含量可小于7重量％、小于6.9重量％、小于6.8重量％、小于6.7重量％、小于6.6重量％、小于6.5重量％、小于6.4重量％、小于6.3重量％、小于6.2重量％、小于6.1重量％、小于6重量％、小于5.9重量％、小于5.8重量％、小于5.7重量％或小于5.6重量％，具体为小于6重量％，更具体为小于5.9重量％。

　　本发明的绿茶提取物可不受限制地采用制备方法，只要所述方法能够制备包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种的绿茶提取物。

　　根据本发明的一个实施例确认到，相比于通过对在第一次绿茶提取步骤中未去除叶绿素和低分子量多酚的提取物进行过滤和干燥而制备的绿茶提取物(比较例)，通过对在所述第一次绿茶提取步骤中去除了叶绿素和低分子量多酚的提取残渣进行第二次的热水提取而制备的绿茶提取物(实施例1)、及通过对所述第二次提取过程中的热水提取物进行乙醇水溶液沉淀反应而制备的绿茶提取物(实施例2)含有更多的多糖和膳食纤维，所含有的儿茶素极少，并且所含有的单糖和二糖(葡萄糖、果糖及蔗糖)更少(实验实施例1及表4)。

　　本发明的组合物可降低血糖。此外，本发明的组合物可抑制碳水化合物的消化、及小肠细胞中的葡萄糖吸收。

　　本发明的组合物可通过抑制碳水化合物的消化来降低血糖。本发明的消化是指将动物从体外摄取的高分子物质分解成能够吸收的低分子物质的过程，所述高分子物质可为碳水化合物，所述抑制消化可指抑制高分子物质分解为低分子物质。本发明的抑制碳水化合物的消化可为抑制碳水化合物消化酶的活性，所述碳水化合物消化酶可包括淀粉酶(amylase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)、糊精酶(dextrinase)、乳糖酶(lactase),蔗糖酶(sucrase)或麦芽糖酶(maltase)，具体地，可为葡萄糖苷酶或淀粉酶，更具体地，可为α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶。在本发明的一个实施例中，根据本发明制备的绿茶提取物(实施例1和实施例2)具有浓度依赖性地抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性的效果，尤其与比较例的绿茶提取物相比，抑制α-淀粉酶活性的效果更加优异，从而，确认到本发明的包含绿茶提取物的组合物具有优异的降血糖效果(实验实施例2和实验实施例3、表5和表6、及图1)。

　　此外，本发明的组合物可通过抑制小肠细胞中葡萄糖的吸收来降低血糖。碳水化合物经过消化过程会以诸如葡萄糖的单糖形式存在于小肠内腔，本发明的葡萄糖吸收可指所述葡萄糖被小肠粘膜上的绒毛所吸收，所述抑制葡萄糖吸收可指抑制存在于小肠内腔的葡萄糖被小肠粘膜的绒毛所吸收。在本发明的一个实施例中确认到，根据本发明制备的绿茶提取物(实施例1和实施例2)具有抑制小肠细胞吸收葡萄糖的效果，其效果相当于作为阳性对照组的番石榴提取物，并且抑制葡萄糖吸收的效果优于比较例的绿茶提取物(实验实施例4、表8和图3)。比较例的绿茶提取物通过抑制碳水化合物消化酶的活性而具有抑制消化的效果，但是对于经消化后存在于小肠的葡萄糖被小肠细胞吸收的抑制效果甚微，因此无法期待充分的降血糖效果，与此相比，本发明的实施例1和实施例2的绿茶提取物不仅对碳水化合物消化的抑制效果优异，对小肠细胞中的葡萄糖吸收的抑制效果也优异，从而具有更加优异的降血糖效果。

　　本发明的绿茶提取物可通过在绿茶中添加作为第一溶剂的醇或醇的水溶液进行提取，再对提取物的提取残渣进行热水提取而获得。此外，本发明的绿茶提取物可为所述热水提取物的醇或醇的水溶液的沉淀物。

　　所述提取残渣可为叶绿素及低分子量多酚被去除的物质。

　　所述热水提取可用于从去除叶绿素和多酚的所述提取残渣中提取水溶性活性成分，热水提取可在70℃至95℃的温度下进行1小时至5小时。

　　可通过将醇或醇的水溶液缓慢加入到所述热水提取物或热水提取物的过滤液中，来进行所述醇或醇的水溶液的沉淀，并且相对于所述提取液或过滤液的含量，可添加4至10倍含量的醇或醇的水溶液。

　　所述醇或醇的水溶液可为包括甲醇、乙醇、丁醇、丙醇及异丙醇等的具有1至5个碳原子的低级醇或此类醇的水溶液，并且可为如包括乙酸乙酯的极性溶剂和包括己烷或二氯甲烷的非极性溶剂的有机溶剂、或他们的混合溶剂。具体地，所述第一溶剂可为10％(v/v)至90％(v/v)的乙醇，更具体地，可为70％(v/v)的乙醇。此外，具体地，在所述醇或醇的水溶液的沉淀物中，醇或醇的水溶液可为10％(v/v)至99％(v/v)的乙醇，更具体地，可为70％(v/v)至95％(v/v)的乙醇，更加具体地，可为95％(v/v)的乙醇。

　　基于组合物总重量，本发明的组合物中绿茶提取物的含量可为0.0001重量％至99重量％，具体地可为0.1重量％至99重量％，更具体地可为1重量％至50重量％。

　　在另一个方面，本发明可涉及一种调节血糖的方法，所述方法包括绿茶提取物给药于需要调节血糖的个体，其中，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。在本发明的另一个方面，可根据本说明书所记载的给药方法及给药剂量来进行所述方法的给药。

　　在又一个方面，本发明可涉及一种绿茶提取物在制备用于调节血糖的药物组合物中的用途，其中，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。

　　在又一个方面，本发明可涉及一种绿茶提取物在制备用于调节血糖的食品组合物中的用途，其中，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。

　　在又一个方面，本发明可涉及一种绿茶提取物的用于调节血糖的用途，其中，基于绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。

　　在又一个方面，本发明可涉及一种绿茶提取物的用途，其中，基于用于调节血糖的绿茶提取物的总重量，所述绿茶提取物包含选自7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素及10重量％或以上的膳食纤维中的一种或多种物质。

　　在上述方面，所述组合物可为药物组合物或食品组合物。

　　所述药物组合物可通过将所述组合物作为有效成分并添加市售的无机载体或有机载体，制备成固体、半固体或液体形式的口服剂型。

　　所述用于口服给药的制剂可包括片剂、丸剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、散剂、细粒剂、粉剂、乳剂、糖浆剂、微丸剂。根据常规方法可容易地将本发明的有效成分进行剂型化，并且可适当使用表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂及其它常用的辅助剂。

　　根据本发明的药物组合物具有优异的血糖调节效果，具体而言，具有优异的降血糖效果，因此可有效地用于治疗和预防与血糖相关的疾病，具体而言，可有效地用于治疗和预防因血糖升高而诱发的疾病。所述与血糖相关疾病包括肥胖、糖尿、糖尿病并发症、脂肪肝、高血压、外周血管疾病、血脂异常、胰岛素抗性、心血管疾病、动脉硬化、代谢综合症、高血糖症、高脂血症及碳水化合物代谢异常，但不限于此。

　　所述药物组合物可通过口服、直肠、局部、经皮、静脉内、肌内、腹腔内、皮下等给药。

　　此外，所述活性成分的施用量将根据需要治疗的受试者的年龄、性别和体重、需要治疗的特定疾病或病理、疾病或病理的严重程度、给药途径和处方者的判断而变化。基于这些因素确定基础的施用量属于本领域技术人员的知识范围内。通常的施用量为0.001mg/kg/天至2000mg/kg/天，具体为0.5mg/kg/天至1500mg/kg/天。

　　所述食品组合物可为保健食品组合物，可直接添加本发明的绿茶提取物或者与其他食品或食品成分一起使用，可根据常规的方法适当地使用。

　　对所述保健食品的种类没有特别的限制。可添加所述绿茶提取物的食品，例如有肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、饼干、披萨、方便面、其他面类、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料水、茶、饮剂、酒精饮料及复合维生素剂等，并包括在通常意义上的所有保健食品。

　　与常规的饮料一样，本发明的保健饮料组合物可含有作为附加成分的多种调味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物为如葡萄糖、果糖的单糖；如麦芽糖、蔗糖的二糖；如糊精、环糊精的多糖；以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。作为甜味剂可使用如索马甜、甜叶菊提取物的天然甜味剂，或使用如糖精、阿斯巴甜的合成甜味剂等。基于本发明的组合物的总重量，所述天然碳水化合物的含量可为0.01重量％至0.04重量％，具体可为0.02重量％至0.03重量％。

　　除了上述以外，本发明的保健食品可包含各种营养素、维生素、电解质、增味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。除此之外，还可包含天然果汁、果汁饮料及用于制作蔬菜饮料的果肉。这些成分可单独使用或混合使用。基于本发明的组合物的总重量，这些添加剂的含量可为0.01重量％至0.1重量％。

　　在另一个方面，本发明提供一种所述组合物的制备方法，其包括如下步骤：通过在绿茶中添加作为第一溶剂的醇或醇的水溶液，从绿茶中去除叶绿素及低分子量多酚的第一次提取步骤；以及从所述第一次提取步骤的提取残渣中热水提取水溶性活性成分的第二次提取步骤。此外，所述制备方法还可包括，通过在第二次提取步骤的热水提取物中添加作为溶剂的醇或醇的水溶液来进行沉淀的沉淀步骤。关于所述第一次提取步骤、提取残渣、热水提取、沉淀、及醇或醇的水溶液的内容与上述记载相同。

　　以下，将通过如下的实施例和实验实施例对本发明进行描述。提供这些实施例和实验实施例的目的仅在于帮助理解本发明，本发明的范畴和范围并不限于此。

　　【实施例】绿茶提取物的制备

　　在500kg的经粉碎干燥绿茶叶而制备的绿茶粉末中添加10,000L的70％(v/v)乙醇，然后在70℃的温度下进行提取，将所述提取液浓缩至初始体积的五分之一，进行第一次过滤后，将所述第一次过滤液的部分进行干燥，以获得浓度为35％的绿茶提取物，在以下实验实施例中用作比较例。通过对剩余的第一次过滤液进行离心分离，回收去除叶绿素及低分子量多酚的提取残渣。

　　在经所述第一次提取过程后去除叶绿素及低分子量多酚的提取残渣中添加50,000L的水，并在90℃下搅拌3小时以进行热水提取。然后，将一部分所述热水提取物减压浓缩至初始体积的五分之一，在120℃下进行干燥，以获得15,000g的绿茶提取物(实施例1)。

　　在剩余的所述热水提取物中添加500L的95％(v/v)乙醇，并进行离心分离以进行乙醇沉淀反应。然后，将所述沉淀物在120℃下进行干燥，以获得70,000g的绿茶提取物(实施例2)。

　　【实验实施例1】绿茶提取物的成分分析

　　对所述实施例中获得的绿茶提取物(比较例、实施例1和实施例2)进行成分分析，其条件和方法如下。

　　【实验实施例1-1】多糖的分析

　　将50mg的葡萄糖放入50ml的容量瓶(1mg/mL)中，用蒸馏水稀释标准原液，以制成不同浓度的标准溶液，从而完成标准溶液的制备。然后，用所述实施例中获得的各个绿茶提取物(比较例，实施例1及实施例2)分别制备0.1％至0.5％的水溶液，进行2小时或以上的搅拌以充分进行溶解后，通过对所述溶液进行离心分离(8000rpm，30分钟)并取上清液，或减压过滤(20μm至25μm)来去除不溶性物质，然后将所述溶液转移到用于透析的管中并进行预处理。然后，将所述预处理的绿茶提取物放入用于透析的管中，并对管的端部进行密封，将所述管浸入到蒸馏水中并进行24小时的透析后，测定经透析的溶液的总体积。此时，在透析时随时更换蒸馏水。将所述溶液的一部分用作测定多糖含量的实验溶液。将所述标准溶液及200μl的实验溶液分别加入试管中，均添加1ml的5％苯酚溶液并进行混合后，将5ml的浓硫酸添加到所述混合物中并进行20分钟的反应，然后在490nm处测定吸光度。此时，对照溶液使用蒸馏水来代替实验溶液，然后进行相同的操作。在490nm波长下测定吸光度，利用下述数学式1来计算多糖含量(mg/g)。

　　[数学式1]

　　多糖含量(mg/g)＝C×(a×b)/S×1/1000

　　C：从校准曲线获得的样品浓度(μg/mL)

　　a：透析后的实验溶液的总量(mL)

　　b：稀释倍数

　　S：样品采集量(g)

　　1/1000：单位换算系数

　　【实验实施例1-2】儿茶素的分析

　　利用甲醇和超声波处理来充分提取儿茶素后，利用液相色谱/紫外检测器(HPLC/UVD)在最大吸收波长280nm处进行定量分析，以对所述实施例的绿茶提取物(比较例、实施例1和实施例2)进行儿茶素的分析。本次儿茶素的分析中使用的标准物质及分析过程如下。

　　(标准物质1)表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)

　　分子式：C15H14O7，分子量：306.27，CAS No.：970-74-1

　　(标准物质2)表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-gallate,EGCG)

　　分子式：C22H18O11，分子量：458.37，CAS No.：989-51-5

　　(标准物质3)表儿茶素((-)-epicatechin,EC)

　　分子式：C15H14O6，分子量：290.27，CAS No.：490-46-0

　　(标准物质4)表儿茶素没食子酸酯((-)-epicallocatechin-gallate,ECG)

　　分子式：C22H18O10，分子量：442.37，CAS No.：1257-08-5

　　将10mg的所述四种标准物质分别放入10mL的容量瓶中，将甲醇填充至标线后，进行适量的稀释，以用于制作校准曲线。然后，将所述实施例的各个绿茶提取物添加到100ml容量瓶中直至作为所述四种标准物质的表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)及表儿茶素没食子酸酯(ECG)的总和达到20mg至80mg后，加入甲醇来进行超声波提取，将甲醇填充至标线后，用0.45μm的膜滤器进行过滤，然后按照下述表1和表2的条件来进行HPLC分析。

　　【表1】

　　HPLC条件

　　【表2】

　　流动相条件

　　通过以下数学式2和数学式3，分别计算所述实施例的绿茶提取物(比较例，实施例1和实施例2)中所包含的四种儿茶素各自的含量及四种儿茶素的总含量。

　　[数学式2]

　　四种儿茶素各自的含量(mg/g)＝C×(a×b)/S×1/1,000

　　C：实验溶液中各别儿茶素的浓度(μg/mL)

　　a：实验溶液的总量(mL)

　　b：稀释倍数

　　S：样品采集量(g)

　　1/1000：单位换算系数

　　[数学式3]

　　四种儿茶酸的总含量(mg/g)＝EGC(mg/g)+EGCG(mg/g)+EC(mg/g)+ECG(mg/g)

　　【实验实施例1-3】膳食纤维的分析

　　对所述实施例的绿茶提取物(比较例，实施例1和实施例2)进行膳食纤维分析所用的方法为，通过将利用磷酸缓冲溶液的酶-重量法应用于含有难消化性麦芽糊精(RMD)的食品，来确定被乙醇沉淀而出的高分子水溶性膳食纤维(HMWSDF)(如，高分子的难消化性麦芽糊精)，并通过对溶于乙醇的低分子水溶性膳食纤维(LMWSDF)(如，低分子的难消化性麦芽糊精)进行脱盐和浓缩后，用液相色谱法进行确认。在所述方法中，通过水不溶性膳食纤维(IDF)及HMWSDF和用液相色谱法确定的LMWSDF的总和，来计算总膳食纤维。即，将利用酶-重量法求得的膳食纤维的含量与溶于醇的水溶性膳食纤维的含量相加，以作为总膳食纤维的含量，从而对所述实施例的绿茶提取物(比较例，实施例1和实施例2)中所含的膳食纤维进行分析。

　　【实验实施例1-4】单糖和二糖的分析

　　在60℃的真空烘箱中，将试剂及每种糖类混标溶液的糖类标准品(果糖，葡萄糖，蔗糖)进行12小时的干燥，然后分别溶解于蒸馏水中，以混合调制标准溶液。此时，通过调整并调制用于校准曲线的标准溶液的浓度，使实验溶液的峰面积能够满足各个糖类标准物质的线性。通过将乙腈和蒸馏水以80:20的体积比进行混合，以调制本次单糖和二糖分析中的流动相。此时，所使用的流动相已通过玻璃纤维过滤器(Whatman GF/F 0.7um或与其同等的)或尼龙66过滤器(Pall 0.45um或与其同等的)进行过滤后，在使用前已进行超声波处理以去除气体。

　　对所述实施例(比较例，实施例1和实施例2)的各个绿茶提取物进行均质化之后，将精确称量的5g的均质化试料放入50mL的离心分离管中并用25mL的石油醚进行分散，以调制实验溶液。然后，在2,000rpm下进行约10分钟的离心分离后，在不除去固形粉的前提下小心地除去石油醚，重复上述过程并用氮气使石油醚完全蒸发。此时，在样品被证实不含脂肪的情况下，省略了从样品中去除脂肪的过程。脂肪已被去除的各个绿茶提取物中加入25mL的蒸馏水或50％乙醇溶液并确认重量，在85℃的水槽中加热25分钟以提取果糖、葡萄糖、蔗糖，并冷却至室温后，添加提取溶剂直至达到最初记录的提取溶剂的重量。然后，用0.45μm的尼龙膜滤器(membrane filter)进行过滤，以作为实验溶液，在实验溶液混浊的情况下，在2,000rpm下进行10分钟离心分离以进行过滤。按照下述表3的条件执行液相色谱(LC)。

　　【表3】

　　LC条件

　　求出将10μl的所述定量实验实验溶液及标准溶液分别进行注入而得到的峰的宽度或高度，以制作校准曲线，然后分别求出实验溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖的浓度(μg/mL)，并利用下述数学式4计算出试料中的果糖、葡萄糖、蔗糖的含量(mg/100g)。此时，调整标准溶液校准曲线的浓度范围，以使能够分别满足对于实验溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖的浓度的线性。

　　[数学式4]

　　糖含量(mg/100g)＝S×(a×b/试料采集量(g))×(100/1000)

　　S：实验溶液中糖的浓度(μg/mL)、a：实验溶液的总量(mL)、b：稀释倍数。

　　【实验实施例1-5】绿茶提取物的成分分析结果

　　按照所述实验实施例1-1至1-4的方法，对所述三种绿茶提取物(比较例、实施例1和实施例2)进行分析的成分分析结果如下表4所示。在下表4中，各成分的含量是指基于绿茶提取物总重量的重量％。

　　【表4】

　　(单位：重量％)

　　其结果可知，如表4所示，与比较例相比，通过对绿茶提取物残渣进行热水提取或乙醇沉淀而获得的实施例1和实施例2的多糖含量约为1.8倍或以上、儿茶素含量约为1/7倍以下、膳食纤维含量约为20倍或以上，而且作为单糖和二糖的葡萄糖、果糖及蔗糖的含量少于比较例的2/3倍。由此可知，与比较例相比，实施例1和实施例2包含更多的多糖和膳食纤维，并且包含更少的儿茶素、单糖和二糖，即各成分的含量与比较例不同。

　　【实验实施例2】抑制葡萄糖苷酶活性的效果

　　在所述实验实施例1中已确认通过对绿茶提取物残渣进行热水提取或乙醇沉淀而获得的实施例1和实施例2中的各成分含量与比较例不同，另外按照以下方法测定葡萄糖苷酶活性的抑制程度，以确认实施例1和实施例2的绿茶提取物是否具有通过抑制碳水化合物的消化来降低血糖的效果。

　　将所述实施例中制备的实施例1和实施例2的绿茶提取物按0.25ppm、0.5ppm、1ppm及2ppm的浓度溶于0.1M的磷酸钙缓冲液中，然后将97uL的各溶液分别混合到浓度为20mU/mL的1uL的α-葡萄糖苷酶中。经过30分钟后，添加2uL的底物溶液(α-NPG(对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷))并进行15分钟的反应，然后添加碳酸钠以终止反应。然后，在405nm处测定吸光度，并通过以下数学式5计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率，其结果示于下表5中。

　　[数学式5]

　　α-葡萄糖苷酶活性抑制率(％)＝(对照组的α-葡萄糖苷酶活性-实施例的绿茶提取物的α-葡萄糖苷酶活性)/对照组的α-葡萄糖苷酶活性×100

　　所述对照组的α-葡萄糖苷酶活性是只有底物溶液与α-葡萄糖苷酶进行反应时的活性。

　　【表5】

　　α-葡萄糖苷酶活性抑制率(％)

　　如表5所示，根据本发明制备的实施例1和实施例2的绿茶提取物具有浓度依赖性地抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果，因此可知，基于绿茶提取物的总重量，包含7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素、10重量％或以上的膳食纤维、及小于7重量％的单糖和二糖的绿茶提取物具有通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来降低血糖的效果。

　　【实验实施例3】抑制淀粉酶活性的效果

　　与实验实施例2相同地，按照以下方法测定淀粉酶活性的抑制程度，以确认实施例1和实施例2的绿茶提取物是否具有通过抑制碳水化合物的消化来降低血糖的效果。

　　向浓度为4U/mL的160uL的α-淀粉酶中，分别混合20uL的已知为血糖调节物质的番石榴提取物、以及按照250ppm、500ppm及1000ppm的浓度将所述实施例中制备的比较例、实施例1及实施例2的绿茶提取物溶解于含有6.7mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液中的溶液。经过10分钟后，添加200uL的淀粉并进行10分钟的反应，添加200uL的包含罗谢尔盐(Rochelle盐，四水合酒石酸钾钠)及3,5-二硝基水杨酸的显色试剂，并在95℃下进行加热。经过5分钟后，对所述加热的溶液进行冷却，添加580uL的蒸馏水后，在540nm处测定吸光度，并通过以下数学式6计算出α-淀粉酶活性抑制率，其结果示于以下表6和图1。

　　[数学式6]

　　α-淀粉酶活性抑制率(％)＝(对照组的α-淀粉酶活性-实施例的绿茶提取物的α-淀粉酶活性)/对照组的α-淀粉酶活性×100

　　所述对照组的α-淀粉酶活性是只有底物溶液与α-淀粉酶进行反应时的活性。

　　【表6】

　　α-淀粉酶活性抑制率(％)

　　如表6和图1所示，根据本发明制备的实施例1和实施例2的绿茶提取物具有浓度依赖性地抑制α-淀粉酶活性的效果，其程度与阳性对照组的番石榴提取物相似。此外，实施例1和实施例2抑制α-淀粉酶活性的效果更优于比较例，因此可知，基于绿茶提取物的总重量，包含7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素、10重量％或以上的膳食纤维、及小于7重量％的单糖和二糖的绿茶提取物具有通过抑制α-淀粉酶活性来降低血糖的效果。

　　【实验实施例4】抑制小肠上皮细胞中的葡萄糖吸收的效果

　　选定小肠细胞(Caco-2细胞)并利用24孔大小的插入物(insert/24well plate,Cat#37024,无菌，SPL研究所)，按照如下所述来进行葡萄糖吸收实验，以确认在所述实施例(实施例1和实施例2)中制备的绿茶提取物抑制在小肠中的葡萄糖吸收的效果。

　　具体地，将Caco-2细胞以6×104cell/孔的数量分株到24孔的插入物中，然后在5％CO2和37℃的条件下进行2周的培养直至所述Caco-2细胞生长到100％，以制造类似于人体小肠的环境。每隔3至5天用PBS(磷酸盐缓冲盐水，Phosphate-Buffered Saline)进行洗涤并更换DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基，Dulbeco’s Modified Eagle’s Media)培养基。为了评估小肠细胞的通透性，测定TEER(跨上皮电阻，transepithelial electricalresistance)，并使用测定值为100Ω/cm2或以上的细胞。

　　将已知具有血糖调节效果的番石榴提取物用作阳性对照组，为了将所述实施例中制备的三种绿茶提取物(比较例，实施例1及实施例2)处理于Caco-2细胞，先用转移缓冲液(transport buffer)进行两次的洗涤，并使用转移缓冲液作为溶剂来进行实验。在浓度为250ug/mL的所述阳性对照组、比较例、实施例1和实施例2中分别混合浓度为25mmol/L的葡萄糖，并在24孔插入物的顶端层(apical layer)中分别处理0.5mL(以下，称为“葡萄糖处理组”)。与所述葡萄糖处理组不同地，将没有混合葡萄糖的浓度为250ug/mL的所述阳性对照组、比较例、实施例1和实施例2，在另外的24孔插入物的顶端层中分别处理0.5mL(以下，称为“葡萄糖未处理组”)，以确认葡萄糖吸收的差异。所述葡萄糖处理组和葡萄糖未处理组中所包含的物质的浓度如下表7所示。此时，在基底层(basolateral)中仅分配1ml的转移缓冲液。然后，在5％CO2、37℃的条件下对葡萄糖处理组和葡萄糖未处理组进行1小时的培养，然后获得基底层。

　　【表7】

　　利用LabAssay葡萄糖试剂盒(变旋酶/GOD法，Wako公司)测定通过小肠细胞的葡萄糖含量。在96孔板中将300uL的含有葡萄糖分解酶的显色剂(chromogen reagent)与2uL的所述葡萄糖处理组及2uL的葡萄糖未处理组分别进行分株后，充分进行混合。然后，在37℃下进行5分钟的反应后，用505nm处的吸光度测定葡萄糖含量，利用下述数学式7计算出葡萄糖吸收抑制率，其结果示于下表8及图3。对1、5、10、25、50、100mmol/L进行测定后创建葡萄糖的标准曲线。

　　[数学式7]

　　葡萄糖吸收抑制率(％)＝(葡萄糖未处理组的糖含量-葡萄糖处理组的糖含量)/葡萄糖处理组的糖含量×100

　　【表8】

　　小肠细胞中葡萄糖吸收抑制率

　　如表8和图3所示，根据本发明制备的实施例1和实施例2的绿茶提取物具有抑制小肠细胞中的葡萄糖吸收的效果，其抑制程度相当于作为阳性对照组的番石榴提取物，并且抑制葡萄糖吸收的效果优于比较例的绿茶提取物。

　　当一同考虑所述实验实施例2和实验实施例3中的抑制碳水化合物消化酶(α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶)活性的效果时，比较例的绿茶提取物虽具有抑制碳水化合物消化的效果，但对于经消化后存在于小肠内腔的葡萄糖被小肠细胞吸收的抑制效果甚微，因此无法期待充分的降血糖效果，与此相比，本发明的实施例1和实施例2的绿茶提取物不仅对碳水化合物消化的抑制效果优异，对小肠细胞中的葡萄糖吸收的抑制效果也优异，从而具有更加优异的降血糖效果。因此可知，基于绿茶提取物的总重量，包含7重量％或以上的多糖、小于20重量％的儿茶素、10重量％或以上的膳食纤维、及小于7重量％的单糖和二糖的绿茶提取物不仅抑制碳水化合物的消化，还抑制小肠细胞中的葡萄糖吸收，从而具有降低血糖的效果。

　　以下将描述根据本发明的一个实施例的组合物的剂型实施例，但是也可以应用为各种其他剂型，该描述仅旨在具体描述本发明，而不是限制本发明。

　　【剂型实施例1】散剂的制备

　　2g的实施例1或实施例2的绿茶提取物

　　1g的乳糖

　　将以上成分进行混合后填充至气密袋中，以制备散剂。

　　【剂型实施例2】片剂的制备

　　100mg的实施例1或实施例2的绿茶提取物

　　100mg的玉米淀粉

　　100mg的乳糖

　　2mg的硬脂酸镁

　　将以上成分进行混合后，根据常规的片剂制备方法进行压片，以制备片剂。

　　【剂型实施例3】胶囊剂的制备