单硫酸鼠李三糖及衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单硫酸鼠李三糖及衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
背景技术
骨骼肌萎缩(简称肌萎缩)主要是指骨骼肌质量减少、肌肉功能的降低，肌萎缩的发生是骨骼肌蛋白质降解与合成出现负平衡的综合表现，影响因素包括相关激素变化、活性氧组织水平变化以及细胞凋亡等。导致肌萎缩的常见原因有长期营养不良、全身性或局部肢体的运动减少或缺失、失神经支配等，查明和去除致病原因是治疗和预防疾病的重要前提。由于长期营养不良导致的骨骼肌萎缩在去除病因、持续补充全面营养的情况下，就可以逐步改善。骨骼肌蛋白质的分解代谢、合成过程受到体内许多激素、细胞因子、蛋白酶体抑制剂的影响和调控。针对促合成代谢调节物质减少的情况，补充适量的生长因子对防治肌萎缩不失为一种有效的方法。除了胰岛素生长因子、重组人生长激素(rhGH)、促肾上腺激素释放因子2受体(CRF2R)激动剂、癸酸诺龙、肌酸、氯沙坦、维生素D、亮氨酸等，近年还有研究报道维生素E、白藜芦醇、线粒体营养素对动物肌萎缩都有较好的对抗作用。这些药物对不同形式的肌萎缩、对不同月龄的实验动物或者不同年龄的人分别显现不同的防治效果。但是对于硫酸鼠李糖在抗肌萎缩中的研究，目前未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供单硫酸鼠李三糖及衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一方面提供单硫酸鼠李三糖在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
本发明的另一方面提供单硫酸鼠李三糖衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
可选的，将所述单硫酸鼠李三糖或者所述单硫酸鼠李三糖衍生物应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的药物，或者将所述单硫酸鼠李三糖或者所述单硫酸鼠李三糖衍生物应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的功能食品。
可选的，所述单硫酸鼠李三糖用以抑制TNF-α对骨骼肌细胞C2C12的分化抑制，并促进C2C12的肌球蛋白MHC和成肌细胞myogenin的产生，促进骨骼肌肌原细胞向肌纤维的转化。
可选的，单硫酸鼠李三糖是以绿藻礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α-L-Rhap-(2S04)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap，是通过1，3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成，分子量为536.14Da。
可选的，所述单硫酸鼠李三糖分子结构式如下：
可选的，所述单硫酸鼠李三糖衍生物包括：以包含单硫酸鼠李三糖为母核的硫酸化衍生物、以包含单硫酸鼠李三糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含单硫酸鼠李三糖为母核的乙酰化衍生物。
可选的，所述单硫酸鼠李三糖的用量为10-300mg/kg。
可选的，所述单硫酸鼠李三糖的制备方法包括如下步骤：
1)、将绿藻礁膜或者浒苔配成水溶液；
2)、采用稀盐酸加入到步骤1)中水溶液中，加热，并搅拌、降解，采用NaOH调节PH值为中性；
3)、将步骤2)得到的溶液进行浓缩、醇沉，取上清液经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理；
4)、然后采用Bio-Gel P4色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线；
5)、收集峰尖部分，冻干即得单硫酸鼠李三糖。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供单硫酸鼠李三糖及衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
2、本发明实施例将所述单硫酸鼠李三糖或者单硫酸鼠李三糖衍生物应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的药物，或者将所述单硫酸鼠李三糖或者单硫酸鼠李三糖衍生物应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的功能食品。
3、本发明实施例采用TNF-α诱导骨骼肌萎缩的细胞模型，发现单硫酸鼠李三糖在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。实验结果表明：单硫酸鼠李三糖可显著抑制TNF-α对骨骼肌细胞C2C12的分化抑制；并有效促进C2C12的肌球蛋白MHC和成肌细胞myogenin的产生，有效促进骨骼肌肌原细胞向肌纤维的转化，具有明显的抗骨骼肌肌萎缩的功效。
4、本发明实施例原料来源于海洋天然绿藻礁膜或者浒苔，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，可开发成抗骨骼肌肌萎缩的药品及功能食品(保健品)，因此具有较好的市场应用前途。
附图说明
图1是本发明实施例中单硫酸鼠李三糖的二级质谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的一实施例提供单硫酸鼠李三糖在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
具体的，将所述单硫酸鼠李三糖应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的药物或者功能食品。
具体应用方式为：将单硫酸鼠李三糖直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为：每天1-3次，以单硫酸鼠李三糖的用量计，每次20-750mg。所述单硫酸鼠李三糖的用量为10-300mg/kg。
本发明实施例中，单硫酸鼠李三糖可以抑制TNF-α对骨骼肌细胞C2C12的分化抑制，并促进C2C12的肌球蛋白MHC和成肌细胞myogenin的产生，促进骨骼肌肌原细胞向肌纤维的转化，具有明显的抗骨骼肌肌萎缩的功效。
本发明的另一实施例提供单硫酸鼠李三糖衍生物在抗骨骼肌肌肉萎缩中的应用。
具体的，将所述单硫酸鼠李三糖衍生物应用于抗骨骼肌肌肉萎缩的药物或者功能食品。
具体应用方式为：将单硫酸鼠李三糖衍生物直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为：每天1-3次，以单硫酸鼠李三糖的用量计，每次20-750mg。所述单硫酸鼠李三糖的用量为10-300mg/kg。
本发明实施例中，单硫酸鼠李三糖衍生物可以抑制TNF-α对骨骼肌细胞C2C12的分化抑制，并促进C2C12的肌球蛋白MHC和成肌细胞myogenin的产生，促进骨骼肌肌原细胞向肌纤维的转化，具有明显的抗骨骼肌肌萎缩的功效。
本发明实施例中，单硫酸鼠李三糖衍生物包括：以包含单硫酸鼠李三糖为母核的硫酸化衍生物、以包含单硫酸鼠李三糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含单硫酸鼠李三糖为母核的乙酰化衍生物。
本发明的还一实施例提供单硫酸鼠李三糖及其制备方法
单硫酸鼠李三糖是以绿藻礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α-L-Rhap-(2S04)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap，是通过1，3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成，分子量为536.14Da。
单硫酸鼠李三糖的制备方法，包括如下步骤：
1)、将绿藻礁膜或者浒苔配成0.5-1.5wt％水溶液；
2)、采用0.2-1.0wt％稀盐酸加入到步骤1)中水溶液中，加热到80-100℃，并搅拌、使其降解4-6小时，采用NaOH调节PH值为中性；
3)、将步骤2)得到的溶液进行浓缩、醇沉，取上清液经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱Sephadex G10进行脱盐处理；
4)、然后采用Bio-Gel P4色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线；
5)、收集峰尖部分，冻干即得单硫酸鼠李三糖。
以下为具体实施例。
实施例1
将绿藻浒苔藻粉配成1wt％水溶液，采用0.5wt％稀盐酸加入到浒苔水溶液中，加热到90℃后搅拌降解5小时，然后用0.1M的NaOH中和为PH7.0，浓缩、醇沉，取上清液经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱Sephadex G10进行脱盐处理，然后采用Bio-Gel P4凝胶色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线，收集峰尖部分，冻干即得单硫酸鼠李三糖。
所制得的单硫酸鼠李三糖结构式如下：
取寡糖样品(单硫酸鼠李三糖)加入0.05mol/l的NaBH4于冰箱4℃中反映10小时，以乙酸水调PH为7.0。采用AG50W-X8色谱柱对寡糖样品进行蒸馏水洗脱，然后浓缩冻干。在质谱分析过程中，以氮气为吹干气体和喷雾气体，流速为250L/h，以乙腈∶水＝1∶1(V/V)为流动相进行质朴分析。在二级质谱中，需要锥孔电压80eV，氩气作为碰撞气体，流速为15L/h。同时，保持碰撞能量保持在20-50eV交换时，得到最佳序列信息。离子源和溶剂挥发峰温度分别为80℃和150℃。
根据单硫酸鼠李三糖的二级质谱图，MS/MS碎片离子(m/z 225)(m/z243)(m/z371)(m/z 389)均由糖苷键的断裂产生，(m/z 475)碎片离子确定硫酸基团位于非还原端鼠李糖的C-2位。根据硫酸鼠李糖二级质谱序列分析方法，推出硫酸鼠李三糖结构为α-L-Rhap-(2S04)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap。
实验测试1：单硫酸鼠李三糖对TNF-α诱导骨骼肌细胞释放LDH的影响
采用实施例1所制备的单硫酸鼠李三糖进行测试。具体步骤为：
(1)细胞培养：将C2C12细胞接种于DMEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育12h后，加入不同浓度的单硫酸鼠李三糖，放入恒温细胞培养箱继续孵育12h。孵育结束后更换培养基，每孔加入TNF-α 100ng/ml，培养箱继续孵育48小时后，收集上清，检测其中的LDH含量。每次三个平行，实验重复三次。
实验结果如表1所示，礁膜寡二糖的给药浓度为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L，400μmol/L时，LDH的释放水平与对照组存在显著性差异，单硫酸鼠李三糖可显著抑制TNF-α诱导的骨骼肌细胞LDH的释放，并呈现明显的剂量依赖效应。
表1单硫酸鼠李三糖对TNF-α诱导骨骼肌细胞释放LDH的影响
注：n＝9，x±SD，与模型组相比，*P＜0.05，***P＜0.001
实验测试2：单硫酸鼠李三糖对TNF-α诱导骨骼肌分化蛋白的影响采用实施例1所制备的单硫酸鼠李三糖进行测试。
(1)细胞培养：将C2C12细胞接种于DMEM完全培养液中(含有1OOU/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育12h，然后加入不同浓度的单硫酸鼠李三糖，放入恒温细胞培养箱继续孵育12h。孵育结束后更换培养基，每孔加入TNF-α 100ng/ml，培养箱继续孵育72小时后，提取RNA，进行MHC和myogenin的mRNA荧光定量RT-PCR分析。实验重复三次。
结果如表2所示，单硫酸鼠李三糖可显著逆转TNF-α抑制的肌纤维关键蛋白的表达。单硫酸鼠李三糖可显著提高MHC的表达，增加Myogenin的蛋白含量。MHC和Myogenin是衡量骨骼肌功能的重要指标，在肌肉萎缩性疾病中表达量显著降低，造成骨骼肌功能的退化。而本发明实施例中的单硫酸鼠李三糖可有效抑制肌肉损伤，保护骨骼肌免受疾病的干扰。
表2单硫酸鼠李三糖对TNF-α诱导骨骼肌分化蛋白的影响
需要说明的是，在整个申请文件中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的试试方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。
